蛋白热稳定技术原理
各位老师熟知的荧光定量PCR仪，现在已经是分子生物学实验室的标配仪器了。这台仪器的最基本用途就是核酸的定量或者定性检测。
其实除了核酸检测，荧光定量PCR仪在蛋白检测领域也有用武之地，包括蛋白质的定量检测和蛋白质热稳定结果的研究。今天主要给老师介绍的就是蛋白热稳定，英文：Protein Thermal Shift™（简称 PTS assay）的应用。
在天然的溶液条件下，蛋白质结构处于折叠状态，亲水部分在外部其疏水部分隐藏在内部。随着温度的上升，蛋白质的天然结构会逐渐解体，其疏水部分逐渐暴露出来。如果我们在蛋白的缓冲液中加入一种对蛋白质结构没有直接影响的荧光染料，这种染料具有一种特性：疏水环境（非极性环境）中会发出荧光，而在在水溶液（极性环境）中会被淬灭。在加热升温的过程中，对疏水部分亲和的荧光染料会逐渐结合到蛋白质上，导致体系荧光信号强度上升。当温度达到某一点时，展开的蛋白质链会聚集，阻止荧光染料的结合。被阻止的荧光染料重新回到周围的水环境中荧光淬灭，导致荧光信号强度下降。这是一个随着时间进程荧光升起又下降的过程，类似一条“熔解曲线”。
通过追踪检测荧光信号的变化，可以测定出蛋白质的Tm值。Tm值的改变(delta Tm)可以在一定程度上量化表示在突变、不同缓冲剂或配体结合等因素的影响下蛋白质稳定性所发生的改变（图一）。
在药物研究开发过程中，蛋白质是典型的被研究的对象。通常需要在几个月内对几千种配体和某几种靶标蛋白进行结合稳定性研究，而这是需要大量时间和精力的。而且，这样的测试，首先就是需要对蛋白在不同的条件下，例如不同的盐离子、离子浓度、PH值等去测试。蛋白热稳定的研究可以在研究蛋白天然活性的过程中引入这个热稳定过程的熔解曲线。在蛋白进行纯化、结晶或者功能测试中，对不同的配体结合或者溶液环境的降解或者凝集力进行测试。
传统的蛋白热稳定研究方法有“量热法”（Calorimetry），包括“差示扫描量热法”（DSC）、等温滴定量热（ITC）以及“圆二色法” （circular dichroism）等。这些方法共同特点是蛋白用量大，通量低，过程复杂。
赛默飞蛋白热稳定性技术方案
赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）的荧光定量PCR试剂，针对蛋白热稳定性研发出完备的解决方案，包括仪器、试剂、标准品以及相应分析软件。提供经济和高效的蛋白热稳定分析的整个实验流程。这个方案能够使用少量蛋白质和微量的体积，进行蛋白配体结合、蛋白修饰、蛋白突变以及缓冲液条件更换来增加蛋白的热稳定性的研究，对于像结构生物学、药物筛选用户有着低成本、高通量的优势。并且还能用于测试蛋白和其抗体的结合能力的研究，十分适合疫苗研发或者抗体药物研究和生产的用户（图二）。
图二：蛋白热稳定性结果图
ABI所有系列荧光定量PCR仪，包括Stepone™系列、7500系列和QuantStudio™系列。
大多数蛋白是可以使用PTS assay的，但是当buffer中存在去垢剂，或者蛋白没有足够多的疏水结构不能产生较强的荧光信号（如小分子蛋白），或者如果未变性蛋白暴露出太多的疏水结构产生较强的背景信号可能会影响效果。每一种蛋白都有适合它们的条件，而大多数蛋白是可以成功筛选出来的。用量：每孔体积10-50ul, 蛋白质0.05-5µg，一般是1ug。
实验流程介绍
根据实验设计把蛋白和配体配置成不同浓度的体系。缓冲液可以根据实际需要进行更换。需要同时做空白对照（只含Buffer、Dye和Water），以及只有配体（只含Ligand、Buffer、Dye和Water）的两个空白对照。并做4个复孔。
无需另外染料校准，采用报告荧光ROX，进行一次melt curve实验。注意设置升温速率。不同仪器设置的界面如下：
Protein Thermal Shift™ Software 。这是一个专用于分析ABI荧光定量PCR仪器下机的蛋白熔解曲线数据的软件。把eds结果导入软件即可分析。不同的蛋白得到的曲线的形状、斜率、信噪比和温度范围都有差异。软件通过这些差异自动计算出delta Tm值。
软件还能根据分组给出每组的温度分布情况，显示出中位数(Diamond plots)，还能根据条件组合的级别不同自行分级（condition Hierarchy Plot），自动提示Tm值明显变化组等强大的分析功能，有兴趣的老师还能在官网申请免费试用该软件一个月（图四）。
图四：Protein Thermal Shift™ Software的分组分析功能界面
应用实例
RecA蛋白是大肠杆菌中的具有双重功能一种蛋白分子，能激活蛋白酶并能改变单链DNA分子。它参与大肠杆菌所有的同源重组途径，有单体和多聚体两种形式。RecA具有DNA依赖的ATP水解酶活性[5]，在RecA单体上存在ATP结合位点，RecA单体的解离需要ATP水解，而使得RecA组装具有多态性。因此可以研究RecA与ATP的集合而研究该蛋白的活性与多态性。
某研究使用荧光定量PCR仪QuantStudio™ 5与赛默飞的PTS试剂，做了以下工作：
终浓度为0.2ml/ml的RecA蛋白，与其配体、终浓度为5mMATP和PTS专用染料混合。含配体和不含配体的样品分别做了8个复孔。运行程序为：25℃到99℃缓慢升温，升温速度为0.05℃/秒。采用x1-m4滤光片组合持续采集荧光。结果导入Protein Thermal Shift™ Software v 1.3进行分析。
结果如图五:上图，温度-荧光图；下图，温度-荧光导数图。玻尔兹曼Tm值与导数Tm值分别用绿色点线和黑色点线显示。
从显示结果可以看出，结合了ATP以后，RecA的玻尔兹曼分析显示，Tm值从53.2度升高到了57.7度。可见，在配体的存在下，RecA蛋白热稳定性提高了。（本案例相关数据来源于公开发表资料，详见附录参考资料2）
图五：蛋白RecA与配体ATP结合后，热稳定性提高
某研究想比较不同RNA逆转录酶的热稳定性，哪种蛋白能在较高温度下保持天然活性呢？
研究者选取了市面上常见的三种逆转录酶：M-MLV小鼠白血病病毒逆转录酶（红色）、Invitrogen™ SuperScript™ II逆转录酶（绿色）和 经过点突变改进后的Invitrogen™ SuperScript™ III 逆转录酶（蓝色）。每种蛋白的浓度均为0.2 mg/mL，溶解于天然活性的缓冲液中。当蛋白与PTS染料混合后，在ABI 的 ViiA™ 7荧光定量PCR仪上运行程序为25°C缓慢升温至99°C，升温速度为0.05°C/sec。
图六：蛋白突变对蛋白热稳定性的分析
好了，技术介绍就到这里，如果想详细了解更多的细节，可以点击阅读原文，到赛默飞官网进行详细的学习，里面还有4段详细介绍的录像呢！
