喙腹髓 （RVM） 中的血清素能神经元通过调节脊髓和三叉神经伤害感受网络促进疼痛的双向控制。该通路的缺陷被认为会导致病理性疼痛状态，但 5-羟色胺能机制的变化是促伤害性还是抗伤害性存在争议。我们结合使用了光遗传学和纤维光度法来更仔细地检查这些机制。我们发现幼稚小鼠脊髓中 RVM 血清素能传入神经的光遗传学激活产生机械超敏反应和条件性位置厌恶 （CPA）。由眶下神经慢性收缩损伤 （CCI-ION） 引起的神经性疼痛，引起脊髓三叉神经尾核 （SpVc） 内血清素 （5HT） 浓度的强直性增加，用液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 测量。根据合同，CCI-ION 对 SpVc 中的阶段性血清素瞬变没有影响，SpVc 由有害钠引起，并使用血清素传感器的光纤光度法测量。这些发现表明，脊髓中血清素的释放是伤害性的，并且在慢性疼痛模型中，持续血清素信号的增加，而不是阶段性或事件驱动的增加，会增强伤害感受。
一、介绍
越来越多的证据表明，慢性疼痛与自上而下的疼痛调节脑回路异常有关。这些下降途径对伤害感受施加双向控制，并且该回路中促进突触后目标的不平衡可能会促进和维持慢性疼痛。因此，利用这些下降系统来抑制疼痛信号，在神经处理的早期阶段可能是治疗疼痛，尤其是慢性疼痛的高效策略。最完整的下降疼痛调节回路是导水管周围灰-喙腹髓 （PAG-RVM） 系统。RVM 是疼痛下降调制的最后一个公共中继，将来自 PAG 和其他皮层下和皮层结构的输入整合到背角以及尾三叉神经核 。越来越多的证据表明，从 RVM 到背角神经元的促进和抑制输出之间的不平衡会导致慢性疼痛状态。
RVM 包含几类表达不同递质的细胞。广泛研究的是 ON 和 OFF 细胞，它们分别以增加或减少放电速率对急性有害刺激做出反应。很大一部分 RVM 神经元，被认为既不是 ON 细胞也不是 OFF 细胞，表达血清素 （5HT），它们在背角神经元上释放。然而，很少有研究报告明确识别的 5HTRVM 神经元的数据，并且没有足够的数据来支持关于 5HT 在慢性疼痛中的作用的科学前提。在这个关键问题上存在截然相反的观点，这些观点得到了相互矛盾的证据的支持，一些人认为 5HT 是伤害性的，而另一些人则认为它是抗伤害性的。例如，我们表明，在由眶下神经慢性收缩损伤，抑制 RVM 中的 5HT 合成可显著改善疼痛行为并逆转 SpVc 神经元的过度兴奋性。5HT 对参与疼痛行为的脊髓和前脑结构的影响可能不同。确定 5HT 是促伤害还是抗伤害是开发慢性疼痛循证疗法的关键，因为现有的 5HT 调节剂具有不一致的临床疗效，并导致明显的副作用。
了解 5HT 在慢性疼痛中的作用的障碍也是由于存在几种类型的血清素受体;其中一些受体引起神经元兴奋，而另一些则产生抑制;有些是突触前的，有些优先是突触后。重要的是，这些受体对 5HT 的亲和力在数量级上变化，因此不同的类别在不同的 [5HT] 下优先被激活。因此，5HT 对伤害感受的影响主要取决于 5HT 的水平。不幸的是，在正常或慢性疼痛情况下，背角中强直或诱发的 5HT 水平尚不清楚。
为了解决这一知识差距，我们比较了 CCI-ION 前后 SpVc 中的 5HT 动力学。我们发现 CCI-ION 动物的 5HT 滋补水平较高。相比之下，诱发的 5HT 水平在有或没有 CCI-ION 的动物中难以区分。在未受伤的小鼠中，SpVc 中 RVM 末端光遗传学释放 5HT 会引起触觉敏感性和条件性位置厌恶 （CPA），这与 5HT 的伤害感受作用一致。
二、材料和方法
2.1 动物
所有动物程序均由作者机构动物护理和使用委员会审查和批准，并遵守美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南和 ARRIVE 指南。我们使用成年雄性和雌性转基因小鼠，其中 Cre 重组酶表达受 Pet-1 启动子控制。实验小鼠是从杰克逊实验室购买的育种对中培育的（JAX 股票 #012712;B6.Cg-Tg（Fev-cre）1Esd/J）。所有动物在手术时大约八周大，并随意与食物和水分组。
2.2 病毒构建体注射
所有病毒载体注射均在无菌条件下进行，在异氟醚麻醉下使用 Rimadyl 进行立体定位装置进行术后镇痛。我们通过开颅手术 （;1-2 mm），并在 4.6 mm 深度注射 500 nl AAV5-Ef1a-DIO-ChR2（E123T）-EYFP（Addgene 质粒 #35507）或 AAV5-Ef1a-DIO-eGFP。5-羟色胺传感器的病毒载体 AAV9-CAG-iSeroSnFR-Nlgn 由作者的大学病毒载体核心使用 Addgene 质粒 #128485 制备。通过将肌肉组织反射到枕骨大孔上以暴露 SpVc 来将传感器注射到脊髓三叉神经尾核 （SpVc） 中。我们在双侧 0.5 毫米的深度注射了 500 nl 病毒。
2.3 通道视紫红质表达、特异性和活性的验证
为检查表达功效和特异性，对 3 只注射病毒的小鼠进行氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物深度麻醉，并经心灌注 1*PBS 和 4% 多聚甲醛 （PFA）。提取大脑，在室温下在 4% PFA 中后固定过夜，并在振动切片机上水平面 50mm 处切片。从每只小鼠中，通过小鼠脑图谱定义的 RVM 的两个切片被处理用于血清素免疫组织化学。将切片封闭在 4% 正常驴血清和 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液中，并在封闭溶液中用兔抗羟色胺 （1：10 000） 孵育过夜。第二天，将切片在 PBS 中用 Cy-3.5 偶联的驴抗兔 （1：1500） 孵育。我们使用共聚焦显微镜进行图像采集，并手动计数表达 EYFP 和/或 5-羟色胺的细胞。
我们使用全细胞膜片钳电生理学来验证通道视紫红质 （ChR） 激活 RVM 中 5-羟色胺能神经元的能力。按照前面描述的方法，从四只注射 RVM 的小鼠中制备 300 毫米厚的冠状切片。为了记录，我们将切片放入浸没室中，并用含有（以 m 为单位）：119 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH PO、2.4 NaHCO3、12.5 葡萄糖、2 MgSO ·7H2O 和 2 CaCl ·2H O 的人工 CSF （ACSF） 持续灌注 （2 ml/min）。10 KCl、10 HEPES、1 MgCl、0.5 EGTA、2.5 MgATP 和 0.2 GTP-Tris。
2.4 脑样本中血清素水平的定量
我们使用了两性的 Pet-Cre 小鼠，其中 11 只 （5 只雄性和 6 只雌性） 有眶下神经收缩损伤 （CCI-ION;见下文），9 只 （4 只雄性和 5 只雌性） 接受了假手术。CCI 产生了用 von Frey 细丝测量的口面部区域的强大机械灵敏度（图 3A）。手术后 3 周，对小鼠进行深度麻醉，并切除大脑。对 CCI-ION 同侧的脊髓尾部三叉神经核 （SpVc） 进行显微解剖并迅速冷冻。我们为每个样本合并了两只小鼠 （同性别和治疗组） 的 SpVc。样品保存在 80°C 直至测定。
液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 方法用于定量脑样本中的血清素水平。5-羟色胺-d 用作内标 （IS）。在Thermo TQS Altis串联四极杆质谱仪上使用电喷雾电离（ESI）进行分析，电喷雾电离（ESI）在正离子模式下运行，质量跃迁m/z为177.1！血清素为 160.1，m/z 为 181.1！IS（血清素-d）为 164.1。在脑中 5-5000 ng/g 的浓度范围内量化 5-5000 ng/g 的血清素浓度。在 BEH C 柱（2.1 50 mm、1.7 mm;沃特世公司）使用 0.1% 甲酸的水溶液 （A） 和 0.1% 甲酸的乙腈溶液 （B） 作为流动相，使用 4.2 min 线性梯度程序，流速为 0.3 mL/min。梯度程序从 5% B 开始 0.75 min，在 1.5 分钟内增加到 95% B;并在 2 中进一步增加到 99% B8 分钟;在 3.2 分钟内将组合物恢复到初始 （5%），并保持至 4.2 分钟以进行再平衡。5-羟色胺和 IS 的保留时间为 0.50 min。使用乙腈沉淀蛋白质从样品中提取 5-羟色胺和 IS。将总共 20 ml 脑匀浆（500 mg/ml 在含 0.1% 甲酸的冰冷水中匀浆）与 10 ml IS 溶液 （500 ng/ml） 混合，然后加入 800 ml 乙腈。涡旋混合 2 分钟并在 15,000 rpm 4°C 下离心 10 分钟后，将 700 ml 等分试样的上清液转移到 2 ml 管中，并在稳定的氮气流下干燥。将样品重悬于 100 ml 流动相 A 和 B 混合物 （1：1 v/v） 中，并将 2 ml 注入 LC-MS/MS 系统中。使用 Xcalibur V 2.1进行数据收集和分析。使用双尾 t 检验进行统计分析，ana 为 0.05。
2.6 慢性疼痛模型
眶下神经的慢性收缩
使用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物（腹膜内）麻醉雄性和雌性小鼠，并将其仰卧位放在温控加热垫上。使用无菌手术技术，通过口腔内切口暴露三叉神经的眶下分支并从周围的结缔组织中脱离。从眶下孔的出口点开始约 1-2 毫米处，神经松散地用无菌的 4-0 丝缝线结扎。用 VetBond 组织粘合剂闭合切口，并持续监测小鼠直至完全从麻醉中恢复。每日术后监测持续 5-7 天，而小鼠继续在家笼中恢复。
2.7 完成弗氏佐剂 （CFA）
用异氟醚麻醉先前在 SpVc 小鼠中双侧注射 AAV9CAG-iSeroSnFR-Nlgn 的小鼠，并将 14 ml CFA 皮下注射到弧菌垫中。使用带有 30 号针头的 Hamilton 注射器进行双侧注射。我们在 CFA 注射后 3-5 天从这些小鼠那里获得了由有害捏引起的纤维光度记录。
2.8 5HT 传入神经的光遗传学刺激
如上所述，5 只雌性和 6 只雄性 Pet-Cre1 小鼠接受 AAV5-Ef1a-DIO-ChR2（E123T）-EYFP （2 只雌性，4 只雄性） 或 AAV5-Ef1a-DIO-eGFP （3 只雌性和 2 只雄性） 的 RVM 注射。这些小鼠植入了一个 1.25 毫米陶瓷套圈、200 毫米核心、0.39 NA 光纤探针，立即固定在颈脊髓背侧，并用牙科粘接剂固定在相邻椎骨上。选择这个位置是为了确保探针的稳定性，同时能够刺激投射到脊髓尾段的表达 ChR2 的 5HT 传入神经。
2.9 条件性场所厌恶 （CPA）
将 5-羟色胺能 RVM 神经元中的 ChR2 或 eGFP 置于两室装置中，并记录探索每一侧所花费的时间 30 分钟。然后对动物进行 3 d 的调节，在此期间，他们将在早上接受 30 分钟的光刺激，下午在他们喜欢的腔室接受 30 分钟的假刺激。我们使用 R-LG473-100-A5 激光器作为光源 生成光刺激，该激光器的波长为 473 nm，功率为 5 mW。在刺激期间，每 10 秒施加 10 个脉冲，持续时间为 4 ms，频率为 20 Hz。我们从已发表的数据中得出这些刺激参数 报告称 RVM 血清素能神经元对有害刺激的反应具有瞬时放电率;50 Hz，持续速率约为 10 Hz。将小鼠连接到光纤系统，在假刺激期间光分离。第二天，再次记录腔室偏好 30 min，并将配对侧和未配对侧花费的时间与配对 t 检验进行比较。
2.10 机械提款阈值
我们测量了手术后 3 周连续 5 天的基线机械撤离阈值。为了评估触觉敏感性，小鼠将小鼠放在带有金属丝网地板的高架平台上，并在测试前适应测试环境 1 小时。我们使用上下方法测试了左右后爪以确定退出阈值。
在这些基线测试期间，小鼠连接到光纤刺激系统，但没有接合 LED。第 3 天，我们在 4 次重复光刺激训练后 30 分钟重新评估了戒断阈值：20 Hz 的 10 个脉冲（持续时间 4 毫秒），训练之间 10 秒。在每次测试之前，LED 功率都校准为 5 mW。48 小时后重复测试以测试可重复性。我们使用单向重复测量方差分析和事后 Tukey 多重比较检验来测试记录会话中每组内阈值的变化。
2.11 光纤光度法
我们使用了 5 只雄性和 5 只雌性 C57Bl6 小鼠。用腹膜内注射 2 mg/kg 氨基甲酸乙烷麻醉小鼠，放置在立体定位框架和光纤探针放置在右侧或左侧 SpVc 的表面。光纤探头通过Doric Lenses 连接到运行 Synapse 软件 的 RZX10 LUX 光纤光度计处理器。465 nm （40mW） 和 405 nm （40mW） 的 LED 分别用于 iSeroSnFR 激发和等压控制。根据需要使用数字光功率计验证和校准 LED 功率。记录对有害捏的反应为幼稚 （三只雌性小鼠和 2 只雄性小鼠） 或双侧 CFA 注射后 3-5 天 （三只雌性和 2 只雄性小鼠）。我们使用了校准的探针，带有 ;2 毫米一次性塑料尖端，用于对幼稚小鼠和 CFA 小鼠的脸颊进行 3 秒的有害机械捏合 （120 g）
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在刺激过程中使用 TA-100 传感器放大器监测来自集成力传感器的模拟读数，以确保所有试验的一致性。我们使用改编自 Tucker-Davis Technologies 模板的定制 Python 脚本分析了光度数据，这些脚本计算了荧光的相对变化。通过从传感器荧光中减去缩放的等压信号来计算传感器荧光的变化。使用每次刺激前 5 秒的窗口作为基线，将传感器荧光的事件相关变化转换为 DF/F。使用 GraphPad Prism 中的 AUC 分析功能计算每只小鼠的平均响应的曲线下面积 （AUC）。
我们使用 3 只小鼠进行体外纤维光度法验证 iSeroSnFr 对 5-羟色胺的反应性。用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠，并按照前面描述的方法制备穿过传感器表达区域的 300m 厚的冠状切片。为了记录，我们将切片放入浸没室中，并连续灌注（2 ml/min）含有（以米为单位）：119 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH PO、2.4 NaHCO、12.5 葡萄糖、2 MgSO·7H O 和 2 CaCl·2H O。如上所述，记录了响应血清素或去甲肾上腺素沐浴的传感器荧光变化。
2.12 统计数据和严谨性
进行行为分析的人员对实验条件不知情。所有统计比较均使用 GraphPad Prism 软件进行。我们使用非配对 t 检验进行两个独立组之间的比较，或使用配对 t 检验进行组内比较。为了分析在多个会话中出现的机械阈值，我们使用了单向重复测量方差分析和 Tukey 检验进行事后比较。在所有测试中，a p ， 0.05 被认为是显著的。所有图表中的数据均显示为具有 95% 置信区间 （CI） 的平均值，除非图例中另有明确说明。
三、结果
3.1 SpVc 中血清素的释放是感知性和厌恶性的
喙腹髓质 （RVM） 中的血清素能神经元是脊髓背角血清素能传入神经的主要来源。然而，这些投射促进或抑制脊髓伤害性网络的条件尚不清楚。为了帮助解决这个问题，我们使用光遗传学来激活 5-羟色胺能 RVM 神经元的轴突，因为它们下降到髓质和脊髓背角，并评估了清醒小鼠的疼痛行为。我们在先前注射 AAV5-ChR-EYFP-DIO 的 PET-1/FEV Cre 小鼠的颈脊髓上植入了光纤探针，以通过一系列光学刺激选择性地激活脊髓中的 RVM 血清素能轴突。我们验证了通道视紫红质 （ChR） 在三只小鼠 （每只小鼠两片） 的 RVM 切片中进行血清素免疫组化处理的特异性和有效性（参见材料和方法）。所有 EYFP1 神经元的血清素免疫阳性（图 1A），表明 ChR 在 5-羟色胺能细胞中选择性表达。RVM 中几乎所有 （78%） 的 5-羟色胺阳性神经元都表达 EYFP1，表明该区域 5-羟色胺能神经元中 ChR 的表达效率很高。我们还在来自个体小鼠 RVM 切片的四个神经元中验证了这些神经元在体外以这些神经元活动特征的频率进行光学刺激可靠地夹带动作电位（图 1B）。
图 1.脊髓中 5-羟色胺能传入神经的激活是令人厌恶的。A，RVM 中表达 5-羟色胺的神经元（红色）中 ChR/eYFP 表达（绿色）的免疫组织化学验证。B，体外验证光刺激序列 （20 Hz） 可以在 RVM 中夹带表达 ChR 的神经元。比例尺 1/4 20 mV/200 ms. C，表达通道核蛋白酶的脊髓血清素能传入神经的光学刺激（4 次重复，10 个脉冲，持续时间 4 毫秒，频率为 20 Hz，两次之间为 10 秒）在幼稚小鼠（蓝色）中产生机械性异常性疼痛，但在表达 eGFP（黑色）的动物中不产生。D，脊髓 5HT 轴突的光学刺激仅在表达 ChR 而不是 eGFP 对照的小鼠中引起条件性位置回避。**p，0.01，重复测量 C 中的方差分析和 D. N 中的配对 t 检验 1/4 每组 5。
我们使用 von Frey 细丝评估了激活 RVM 轴突对后爪伤害感受阈值的行为影响。计算在 RVM 中血清色调能神经元中表达通道视紫红质 （ChR） 或 eGFP 的小鼠的基线机械戒断阈值 （n 1/4 每组 5）。血清素能脊髓传入神经的光学刺激对对照组 （eGFP） 的机械阈值没有影响，但在表达 ChR 的小鼠中产生了机械异常性疼痛（图 1C，Tukey 多重比较事后检验的单向重复测量方差分析，p，基线与第一次或第二次光学刺激相比为 0.01）。因此，在其他幼稚小鼠中 SpVc 中 RVM 末端的激活可靠地产生机械异常性疼痛（图 1C）。
为了检查非反射性行为指标，我们对同一组小鼠进行了条件性位置厌恶测试。如图 1D 所示，在与光学刺激配对后，在 RVMaxons 中表达 ChR 的小鼠在它们先前喜欢的腔室中花费的时间更少，而我们观察到 eGFP 对照没有变化。在 ChR 表达组中，在优选腔室中花费的时间从刺激前的平均 55% （49-60%） 减少到 45% （38-51%;双尾配对 T 检验，p 1/4 0.0019，n 1/4 5）在刺激过程中。作为一个组，在首选腔室中的平均时间减少了 10% （6-14%），这表明在其他幼稚小鼠中激活脊髓 RVMafferent 是厌恶的。
3.2 SpVc 中的血清素动力学
上述研究结果表明，幼稚小鼠脊髓中血清素的释放是厌恶的，并导致机械性异常性疼痛。因此，我们假设由有害刺激引起的血清素释放会在持续疼痛的小鼠的背角中增强。我们使用纤维光度法和病毒介导的基因编码血清素传感器在 SpVc 中。在体外，正如 Unger 及其同事报告的那样，50-100 毫秒血清素的沐浴会产生传感器荧光的剂量依赖性增加（n 1/4 3 切片）（图 2A 中的示例记录，插图）。相比之下，去甲肾上腺素 （20-100m） 的沐浴应用没有引起反应（数据未显示）。
在体内，氨基甲酸乙酯麻醉小鼠中 SpVc 的纤维光度测量记录，这些小鼠要么是幼稚的，要么在双侧皮下注射 CFA 到弧菌垫后对口面部捏持表现出机械敏感性（图 2A），揭示了响应有害捏合的强烈血清素瞬变。图 2B 显示了从假鼠标记录的这些瞬变的示例，其中该图显示对单个试验的响应。该图下方的折线图显示了所有试验的平均响应，阴影区域表示 95% CI 。在捏合期间 SpVc 中的血清素水平稳定而持续地增加 （;2 s） 在返回接近刺激前水平之前。
来自 5 只假小鼠和 5 只 CFA 小鼠 （每组 3 只雌性小鼠和 2 只雄性小鼠;图 2C、D）显示血清素释放的曲线（图 2B）或曲线下面积（AUC;图 2D）在假注射和 CFA 注射小鼠之间（平均 AUC 和 95% CI：假 0.038、0.018–0.057;CFA：0.034,0.17–0.51，配对 t 检验，p 1/4 0.7）。SpVc 中血清素瞬变的相似性表明，CFA 引起的机械异常性疼痛不是由有害事件触发的血清素瞬变差异引起的。
图 2.SpVc 中血清素的相释不受 CFA 诱导的炎症性疼痛的影响。A，CFA 诱导的炎症降低了对口面部区域机械刺激的戒断阈值。B，以 SpVc 表达并通过纤维光度法测量的血清素传感器的荧光变化，以响应有害的捏合。热图显示了传感器对 10 次连续捏合的响应，以及所有 10 个响应的平均值和 95% 置信区间，如下面的轨迹所示。插图中显示了传感器对 50 和 100 毫秒血清素（细和粗蓝线）外源应用的反应的体外验证。C，幼稚小鼠和 CFA 注射后 3-5 d 小鼠的 SpVc 中诱发血清素瞬变的平均值 （t 1/4 0） （每组 n 1/4 5）。假小鼠和 CFA 小鼠 （D） 之间的反应没有差异，以曲线下面积 （AUC） 测量。
3.3 滋补血清素水平
由较大的 5-羟色胺瞬变引起的损伤引起的痛觉过敏的另一种假设是强制患有慢性疼痛的小鼠的血清素水平升高。我们使用定量液相色谱-串联质谱法 （LC-MS/MS） 检验了这一假设，以比较眶下神经慢性缩窄损伤 （CCI-ION） 小鼠和 Shams 对照小鼠 SpVc 中血清素的组织浓度。使用 von Frey 细丝测试每组的一个子集对口面部区域的机械敏感性（图 3A）。CCI 小鼠的退出阈值从 1.3 g（95% CI：1.28-1.38 g）降低到 0.24 g（95% CI：0.2-0.28 g，p，0.0001，配对 t 检验），而假手术组的阈值保持不变（基线时平均 1.37 g，1.3-1.4 g，假手术后平均 1.38 g，1.35-1.41 g，p 1/4 0.6 配对 t 检验）。与我们的假设一致，CCI-ION 小鼠 SpVc 中血清素的浓度高于假小鼠（图 3B;平均 695% CI;假：17 ng/ml，7-121 ng/ml vs CCI-ION：103 ng/ml;95% CI：77-214 ng/ml;Mann-Whitney 检验，第 1/4 页 0.02）。因此，强直性 5-羟色胺水平的持续升高与 CCI-ION 损伤引起的机械超敏反应有关。*p <0.05， ****p<0.0001.
图 3.在神经性疼痛的小鼠模型中，SpVc 中的强直血清素水平升高。A、CCI-ION 降低对口面部区域机械刺激的戒断阈值。B， 通过液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 定量分离的 SpVc 组织中 5-羟色胺浓度。组份：n 1/4 9 假设 n 1/4 11 CCI，p 1/4 0.018，未配对的 t 检验。
四、讨论
我们使用三叉神经病变和炎症的小鼠模型研究了喙腹髓 （RVM） 血清素能神经元 （RVM） 的输入对急性和慢性疼痛中 SpVc 的贡献。我们报道了髓背角（脊髓三叉神经核尾部;SpVc） 产生机械性异常性疼痛，并且天生厌恶。由有害菌引起的 SpVc 中的血清素瞬变在幼稚小鼠和 CFA 诱导的炎症性疼痛的小鼠中难以区分。然而，三叉神经病变小鼠 SpVc 中 5-羟色胺的强直水平较高。总之，我们的数据支持 RVM神经元对 SpVc 中的回路产生感觉作用的假设，并表明背角内 5HT 的持续增加，而不是事件驱动释放的变化，有助于慢性疼痛表型。
4.1 血清素和急性疼痛
RVM 是参与疼痛下降调节的高级大脑区域与脊髓和 SpVc 中的伤害感受回路之间的明确特征联系。该通路强度或功效的变化被认为有助于慢性疼痛的发生和维持。RVM 包含异质神经元群，包括中缝大核、网状核、巨细胞 a 和副巨细胞核 中的血清素能神经元。
RVM神经元可能通过仍知不多的机制具有伤害性或抗伤害性，并且这种信号通路的变化可能导致慢性疼痛。
抑制脊髓中血清素释放或使用 SSRI 提高血清素浓度的操作对其他幼稚动物的伤害感受阈值几乎没有影响。在 RVM 中，用 RNAi 靶向抑制血清素合成在很大程度上消耗了血清素的背角，但对基线机械或热撤退阈值没有影响。全身或鞘内注射血清素再摄取抑制剂氟西汀产生的强直血清素水平增加，对基线疼痛阈值也没有影响。尽管 SSRI 产生的强直性脊髓血清素浓度的变化尚不清楚，但这些数据表明，对有害刺激的正常行为反应对这种增强的血清素能信号水平不敏感。这些研究表明，在幼稚条件下，血清素通常在调节脊髓伤害性回路中最多起着很小的作用。正如我们在这里显示的那样，当 RVMafferent 活动超过足够高的阈值时，此角色可能会更改。SpVc 中 RVMafferents 的光遗传学激活会产生机械性异常性疼痛，并且在幼稚小鼠中是厌恶的（图 1）。同样，RVM 中 5-羟色胺能神经元的光遗传学激活会在小鼠中产生长期的机械和热超敏反应，并且超敏反应的持续时间可以在重复激活后延长数周。这些结果支持 RVM神经元有助于慢性疼痛发展的假设，但这些神经元的活动开始促进伤害感受的机制尚不清楚。
4.2 血清素和持续性疼痛：阶段性释放
麻醉大鼠的有害刺激激活 RVM 内的血清素能神经元并诱导在背角中特别突出的5HT 的升高。我们假设 SpVc 中血清素的释放在疼痛或敏感性增加的情况下会增强。与我们的假设相反，幼稚小鼠和患有炎症性疼痛的小鼠之间由有害刺激引起的血清素释放的程度没有差异（图 2）。因此，5-羟色胺水平的阶段性变化似乎不会导致炎症性疼痛引起的超敏反应。一种可能性是，在患有炎症性疼痛的动物中，强直性血清素水平已经增加到“天花板”水平，而阶段性、有害刺激无法进一步增加。血清素释放的主要来源也可能来自最近被证明具有抗伤害性与伤害性的血清素能 RVM 神经元群。我们使用血清素传感器来检测释放，将无法检测到这种变化或 SpVc 内释放位点变化对伤害感受的影响。
这种有害的捏动会引起 SpVc 中的血清素瞬变，这似乎与表明 RVM 神经元对急性有害刺激没有反应的证据不一致。推定的 RVM 神经元被归类为“中性”细胞，与其他神经元相反，这些神经元在有害刺激期间增加（“ON 细胞”）或减少（“OFF 细胞”）其活动。这些发现之间的明显差异可能是由于用于评估 RVM 神经元活动的不同指标造成的。虽然我们测量了 SpVc 中的血清素释放，但以前的研究测量了假定的 RVM 神经元的放电率。与轻度麻醉大鼠的发现一致，RVM神经元种群中活动水平的微小变化可能导致 SpVc 中血清素水平的可检测变化。
4.3 血清素和持续性疼痛：强直性释放
血清素可能通过增加强直性释放来促进慢性疼痛。与这一假设一致，我们发现相对于假手术，患有眶下神经慢性缩窄损伤 （CCIION） 的小鼠的强直血清素水平更高（图 3）。这一结果与报道一致，即 RVM 传入神经中血清素的消耗会阻止异常性疼痛的发展。同样，在一项针对骨关节炎患者的研究中，脑脊液中血清素代谢物 5-HIAA 的浓度与报告的疼痛严。虽然较高的强直血清素水平可以解释受伤后疼痛增加的原因，但血清素受体亚型的功能变化也可能在慢性疼痛的表现中发挥作用。例如，在具有 CCI-ION 的动物中，突触前 5HT 受体的活性上调，导致中枢初级传入末梢的谷氨酸释放增加。然而，很难将这种变化与慢性疼痛中的血清素异常联系起来，因为血清素作用于几种突触前和突触后受体，它们对血清素的亲和力在数量级上变化，使得不同的类别优先响应不同的 [5HT] 而被激活。因此，5HT 对伤害感受的影响主要取决于 5HT 的水平。
我们研究的一个局限性是基本假设，即在持续性疼痛的 CFA 和 CCI 模型中，血清素能信号的变化是相似的。CFA 诱导的疼痛行为比与 CCI-ION 相关的疼痛行为在更快的时间范围内表现出和消退。此处报道的 CFA 诱导的疼痛的阶段信号传导缺乏变化可能在 CCI 诱导的疼痛的较长时间过程中表现出来。同样，5-羟色胺能信号传导的强直性增加对 CFA 诱导的疼痛的潜在贡献需要进一步研究。
在这里，我们报告说，在慢性疼痛模型 （CCI-ION） 中，SpVc 中血清素的强直水平增加，同时疼痛行为增加。相比之下，注射 CFA 的动物中由有害刺激引起的血清素水平与对照小鼠的血清素水平没有区别。我们还表明，光遗传学诱发的 SpVc 中 RVM 末端释放的血清素会引起类似疼痛的行为。尽管了解血清素能信号传导持续增加对伤害感受的最终影响因受体亚型表达模式的变化而变得复杂，但我们的研究表明，减少脊髓投射 RVM神经元输出的靶向治疗可能被证明可有效降低慢性疼痛的严重程度。
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