1、YY/T 17442020ICS 1L040.30C 35I中华人民共和医药行业标准YY/T 17442020组织工程医疗器械产品生物活性陶瓷多孔材料中细胞迁移的测量方法Tissue engineering medical device productsBioactiveceramicsMethod to measure cell migration in porous materials(ISO 19090：2018 Tissue-engineered medical productsBioactiveceramicsMethod to measure cell migration in p
2、orous materials»MOD)2021-09-01 实施2020-09-27 发布国家药品监督管理局 发布目 次前m弓 iwIV112规范性引用文件 13术语和定义14M 25试验样品26试验步骤37计算98试验报吿10 12YY/T 17442020本标准按照GB/T L1-2OO9给出的规则起草，本标准使用重新起草法修改采用ISO 19090,2018（组织工程医疗产品生物活性陶瓷多孔材料 中细胞迁移的测量方法h本标准与ISO 19090:2018的技术性差异及其原因如下：一关于规范性引用文件，本标准做了具有技术性差异的调整，以适应我国的技术条件，调整的情 况反映在第2
3、章1规范性引用文件"中，具体调整如下：用等同采用国际标准的GB/T 16886,5代替ISO 10993-5B本标准还做了下列编辑性修改，删除了 ISO 19090:2018的附录A（资料性附录）“用于确定实验条件的实验结果”i删除了 ISO 19090,2018的附录B（资料性附录）“国际比对循环测试结果”.请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会 （SAC/TC 110/SC 3）归口.本标准起草单位：四川大学（四川医疗器械生物材料
4、和制品检验中心、中国食品药品检定研究院. 本标准主要起草人:梁洁、魏利娜、杨晓琴、蔡永福、袁暾、张乐、徐丽明。生物活性陶瓷因其具有良好的生物活性和生物亲和性，被广泛用于骨科和牙科领域。而多孔的生 物活性陶瓷，细胞可从组织进人其孔隙，从而具有有效修复骨缺损的潜力，成为骨组织工程医疗产品细 胞支架的潜在候选“原材料"之一。为了证明生物活性陶瓷的临床安全性和有效性，首先须对其物理，化学和生物特性进行检测。在所 使用的方法中，动物试验是检测生物活性陶瓷的生物学特性最重要和必要的方法:然而，在3R原则（替 代replacement,?少reduction,优化refinement）下，必须减少
5、动物和动物试验的数虽，细胞迁移能力是多孔生物材料（包括生物活性陶瓷）的首要和最重要的性能.在多孔生物材料及其 周围环境中，如果没有细胞迁移，就不会发生细胞增殖、分化以及组织形成和组织成熟。目前有两种细胞接种方法用于测试细胞迁移能力：一种是将细胞悬液滴到多孔材料表面，这种方法 测试了细胞悬液在重力作用下的穿透能力；另一种是将多孔材料加到细胞悬液中通过摇晃驱使细胞进 人材料中。这两种方法只能检測细胞的穿透和留存能力，但是不能模拟在体内的细胞迁移情况。体液 本身足以携带细胞穿过植入材料和宿主骨组织之间的较小间隙.因此，目前还没有模拟体内细胞行为 的细胞迁移测试方法的报道。当多孔生物陶瓷植入骨缺损部位
6、时，细胞迁移到孔中形成新骨.在这个过程中，成骨细胞的迁移在 骨传导中扮演重要角色。也就是说，没有成骨细胞迁移，就不会发生骨传导或骨形成。因此需要建立一种可景化且模拟细胞在体内的行为的方法来测S多孔生物活桂陶瓷的细胞迁移潜 能，以便客观地评估其作为组织工程医疗产品支架材料的潜力，标准起草小组通过使用如下四种材料：HT（HA : j9-TCP = 8 : 2,平均孔径312.3 孔隙率 80.9%，孔结构为无序，球形）,HTL（HA *3-TCP =6 < 4,平均孔径390.3 孔隙率81.7%,孔结构 为无序，球形）、TH（HA :卢一TCP =1 : 9,平均孔径375.4 Mm，孔隙
7、率81.6%,孔结构为无序，球形）、 THL（HA«-TCP =3 « 7,平均孔径293.8 Mm，孔隙率77.7%，孔结构为无序，球形），验证了本标准 中给出的方法用于评价多孔生物啕瓷的细胞迁移潜能是可行的和可操作的.组织工程医疗器械产品生物活性陶瓷多孔材料中细胞迁移的测量方法1范围本标准规定了用于测量和记录多孔生物活性陶瓷材料中细胞迁移的測试方法.本标准适用于多孔生物活性陶瓷B本标准不适用于低细胞黏附性或无细胞黏附性的多孔材料，例如合成聚合物和金属。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的
8、引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 16886.5医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毐性试验（GB/T 16886.52017,ISO 10993-5：2009tIDT) 3术语和定义下列术语和定义适用于本文件.3J生物肉瓷 bioceramics植人人体内増强生钧功能的陶瓷材料.3.2生物话性陶瓷 bioaclive ceramics当植人到骨缺损部位后具有引导骨结合性能的生物陶瓷。3.3生物材料 b iomaterials用于诊断、治疗、修复或替换机体组织、器官或增进其功能的材料。YY/T 1445016,定义 3,193.4完全合 full conflue
9、nt单层细胞几乎完全95 %-100 %）覆盖细胞培养皿。3.5完全培养基 complete medium用于所选细胞类型的含有所有必需添加物的细胞培养基.该细胞培养基经使用者验证对细胞增殖 有益且不会使细胞发生突变。3.6成骨样细胞 ostecblast-Iike cell已建立的被广泛认可具有"成骨活性”的细胞系。3.7细胞群cell group由至少五个细胞组成的群，且每个细胞之间距离不超过细胞自身的宽度。4原連本方法可以简单有效地测量钿胞自身迁移能力。如罔1所示，培养皿内汇合层中的细胞能够进一 步迁移至培养皿内多孔生物陶瓷材料中并增殖.为了尽ft减少因细胞传代、细胞种类、细胞
10、培养耗材 （包括培养基和血清等）差异造成的影响，本方法采用一种具有代表性的且已上市并在各国临床使用中 证明有良好效果的多孔生物活性陶瓷作为计算相对迁移距离的参考材料.材料放置前:试验材科中不包含絪胞b）材料放買后：细朐a过孔隙上移至，试材料说明，1 含培养基的培养HL;2 黏附于培养血底部的细胞；3试轻材料，图1测试方法示意图细胞移行到材料界面之后，开始逐步向材料孔隙中迁移，这种迁移距离因材料性质，化学稳定性， 表面形态和孔隙结构的不同有所差异.该过程类似体内骨再生过程的初始阶段，吉姆萨染色是一种非常稳定和简便的染色方法.从吉姆萨染色的多孔生物活性陶瓷的横截面测益的有效细胞的最长直线迁移距离很
11、好地反映了细 胞在体内的迁移情况，5试验样品 5J 形状和尺寸试验样品的形状成为直径l0±0.2）mtn,厚度（2土0.1）mm的圆片状.52试验样品数量采用至少5片对照样品和5片试验样品进行比较。5.3对照材料经过基础研究和/或临床结果证实为良好骨填充物的已上市多孔生物活性陶瓷.推荐使用已在多 个国家上市的对照材料，或者检査结果证实具有该性能的标准品。6试验步® 6.1试验样品厚度和直径的測量应用卡尺或微米尺测H试验样品的厚度和直径.6.2试验样品灭菌在试验前用不影响材料质量的方法对试验样品进行灭菌。6.3试验样品脫气将试验样品浸人装有5 mL完全培养基的密封离心管中，用
12、连接20 mL注射器的1821号针头 剌人试管盖后，将注射器的芯杆活塞完全拉冋到基准线并保持2 min3 min,以消除气泡.6.4细胞培葬将成骨样细胞接种于6孔板或直径35 mtn细胞培养皿中，培养至完全汇合.推荐使用MG63或 MC3T3-E1成贷样细胞。为了使细胞在6孔培养板中3 d内增殖至完全汇合，毎孔接种MG-63, 6.0X1O4个或MC3T3-E1.8.0X104个.在接种2 d3 d后，应在相差显微镜下观察细胞，以检査细胞 汇合情况井避免细胞过度汇合。注：参考ISO 13366-1:2008或者ASTM F2149-01中表述的细胞计数方法对细胞数量计数.若使用非本标准推荐的细
13、胞系进行试验时，应先通过预试验确认细胞接种数#，确保细胞于3 d内 达到汇合状态.当孔（皿）中细胞完全汇合时，取3个孔（皿）使用吉姆萨染色，用于记录迁移试验前的细胞汇合状 态，具体方法如下:用2%戊二醛固定过夜后，每孔（皿）加入2.5 mL适当浓度的吉姆萨溶液（使用PBS 溶液稀释），并于室温下孵育3 min.然后去除染色液，使用2.5 mL蒸馏水清洗3次.每个孔（皿）的立 体显微照片应在10倍或最大可用放大倍数下拍摄，以便在相同的范围内观察孔或皿的底部。6.5在细胞层上放置样品当细胞达到完全汇合状态时，弃去原培养液，加人新鲜细胞培养液后，在细胞层上放置一个脱气处 理后的样品，并于上方放置一个
14、外径为10 mm,线径为0.8 mm1.0 mm的SUS316不锈钢（相当于我 国的OCrl7Nil2Mo2不锈钢）双环（如图2所示）固定样品.两者均应使用镊子轻放，避免直接落人培养 基或搅动培养基.因为制造过程的因累，样品表面可能有一些粗糙和不平整，应使用光滑面放置于细胞 层上.将培养板（或皿）转移到CO2培养箱中时，注意不要造成样品位移，因为这样可能会损害样品与细 胞层的紧密接触.细胞需继续培养3 d，期间无需更换培养基或任何其他操作.图2不锈钢双环在试样上放置重物（不锈钢双环是为了确保试验样品和细胞层能够紧密接触。然而，如果额外重 呈对细胞的影响不明确，那么应通过如下的细胞增殖试验来评估
15、急性细胞毒性（见GB/T 16886.5规定 的方法进行，以确保不锈钢双环对本次试验中细胞没有影响：a）将不锈钢双环用超纯水超声清洗1 h，然后用超纯水冲洗3次.b）于16O1C干热灭菌3 hac）将不锈钢双环放在相同条件下（6.4）完全汇合的细胞层上，至少培养3 d。用倒置荧光显微镜 观察细胞形状和环绕重物周围的细胞数，6.6细胞培养后处理培养3 d后收取样品.为防止细胞从样品上脱离，收取样品后，将样品底面（与细胞接触面）向上放 置.使用PBS清洗样品3次，使用2%戊二醛同定过夜。阂定完成后，室温下使用PBS清洗3次，并放 人10 mL吉姆萨溶液中进行染色处理。染色3 min后将样品转移到另
16、一个容器中，并使用10 mL蒸馏 水清洗，重复该清洗步骤3次。如果上述操作染色效果不佳或与染色液说明书有很大差异，请遵循说明书中的染色方案。 将收取样品后的孔（皿）使用PBS清洗3次，并使用2%戊二醛固定过夜。固定后，室温下将孔（皿） 用PBS清洗3次，并加人2.5 mL适当稀释的吉姆萨溶液进行染色。染色3 min后，移除吉姆萨溶液， 并使用蒸馏水清洗3次，再使用DAPI避光染色3 min。如果样品和不锈钢双环不影响细胞活力，则可 观察到孔（皿）上细胞转移区域边缘的细胞迁移。此外，如果在样品放置区域中的细胞没有显示形貌和 数景的变化但是又没有良好转移，原因则可能是由于试样的“平整度”不好。6.
17、7阳性和阴性对照每次测试中均包含阳性和阴性对照是有益的。选取不含细胞的支架（试验样品）可以作为阴性对 照。将阴性对照放置在没有细胞的培养皿内，和培养基一起培养、清洗、染色、成像和评分.阳性对照使 用移液管直接将细胞接种在支架上，在培养基中孵育以使细胞黏附（可能需要4 h24 h），清洗、染色、 成像和评分.对照组的设定用于保证检測体系有效并有助于结果的解释.在细胞迁移到试验样品中的情况下， 阴性对照则需证明没有细胞迁移，证明材料的本底染色和评分结果是可靠的。阳性对照组有明显的细 胞迁移，表明细胞有活性，染色有效，并且评分程序可靠，方可做出细胞在试验样品中迁移情况较差的判 断。试验体系中包括阳性
18、和阴性对照有助于分析结果和提高结论的可信度.6.8观察迁移到样品内的细胞使用立体显微镜/激光扫描共聚焦显微镜（或其他能够观察到三维结构的显微镜）观察样品与细胞 接触面（底部），并拍摄底部的立体显微照片.使用薄型的眼科手术刀将样品分切成两块。根据样品底 面的平整度，染色区域可能分布不均匀且形状不规则。因此，切割位置应由样品与细胞层接触面（底部） 的染色情况确定;切口应沿着最长的切面确定长度，穿过样本染色最深的区域（见图3图6）.说明,A切割拉Et B染fe区域* c空0区域。围3样品表面染色区域超过一半时切割位置示意图说明：A切割位置; B 染色区域:C 空白区域.图4样品表面染色区域未超过一半
19、时切割位置示意图说明，A切割位S（ B染色K域,C空白区域.图5样品表面存在隔断染色区域时切割位罝示意困说明：A切割位罝; B染也区域； C空白K域，图6样品表面染色区域呈分散状态时切割位置示意图用立体显微镜/激光扫描共聚焦显微镜（或其他能够观察到三维结构的显微镜）观察横截面。相同 放大倍数下，拍摄样品横截面的立体照片.注1：建议样品使用眼科手术刀切开.若使用手术刀不能切割样品，则可使用金刚石切割机或类似设备，以磷酸盐 缓冲液为润滑刑切荆样品。注2：同样的但不含细胞的样品在相同的培养基中培养后，经同样的吉姆萨染色液染色相同时间后作为对照，用于 确认样品的本底染色悄况，以证明试样的染色部位是否存
20、在细胞.注3：如实验室条件许可的情况下，可用共聚焦镜观察荧光标记的细胞的最长迁移距离.6.9样品内细胞迁移距离测量6.9.1 总则所有测量应在放大倍数为10倍和20倍（物镜1倍和2倍，目镜10倍）的立体显微镜/激光扫描共 聚焦显微镜（或其他能够观察到三维结构的显微镜下进行.YY/T 174420206.9.2细胞最大迁移距离应測fi每个试验样品从样品底部到最远染色细胞或细胞群的最长直线距离。在测量之前，应检査 以下事项，a）使用髙倍放大（至少W倍）的立体显微镜/激光扫描共聚焦显微镜（或其他能够观察到三维结 构的显微镜），应使用通用准则来确认染色的细胞性质，包括细胞核染色和显示细胞生长过程 与黏
21、附于多孔结构表面的形态特征.b）以下所述的用于测量细胞和细胞群的验证是基于多个实验室内部测试的结果，这些測试经验 证避免了由于细胞培养基变化和固定前清洗而导致单个细胞或细胞群非特异性滞留在较大孔 位点内的情况.c）以下是验证细胞和细胞群的详细方案。d）应测fi从底部到迁移最远距离的细胞或细胞群的最大直线距离.6,9,3确定细胞屏的线性最长迁移距离在图7中，细胞群最顶端与底部相连，因此白线长度即细胞群的线性最长迁移距离，说明，灰色区域大苗细胞的染色区t白线 线性进长迁移鉅离，囲7单染色区域中迁移距离測最A说明：灰色区壤大算细胞的染色区;A单个细胞t白线 线性S长迁移距离。图8单染色区域中存在单个
22、细胞但不是细胞群时迁移距离測量7YY/T 17442020说明1灰色K域大S细胞的染色bh白线线性a长迁移姖离.图9染色区域隔断时迁移距离測量如图8所示，单个细胞从细胞群的顶部分离出来，黑线为单个“细胞”而不是细胞群的线性最长直线 距离；因此，“细胞群”的线性最长迁移距离是白线.如阁9所示，当染色区域被分割时，染色较高的部分被认定为细胞群的线性最长距离，如白线所示。 因此，如图7所示，如果没有观察到从底部染色区域分离的细胞群，则“细胞群”的线性最长距离为白线。 当细胞群从底部染色区域分离出来时，应进行以下验证.在如图10所示的情况中，细胞群A到已经被确认为有效细胞群迁移的最近距离（线6的长度）
23、比 线a（有效细胞群的迁移距离）的短，因此A被确认为有效的细胞群.在这种情况下，不存在离底部距 离较远的分离细胞群.因此,细胞群的线性最长距离是线c的长度.说明A-细胞群;；a有效细胞群的迁移距离；b细胞群A到有效细胞群的距离c细胞群的线性最长距离.围10当样品中存在离底部染色区很近的分散细胞群时迁移距离测量在如图11所示的情况中，从距离底部最近的细胞群C开始.线£表示的直线距离是从C到最近有 效细胞群的距离，这个距离比标示为j的这条直线距离短：因此C是一个有效的细胞群，而标示为A的 直线距离是有效迁移距离，这与图10中的细胞群A和直线距离c相同.同理可见，从另一个细胞群D 到底部的
24、更长距离（被标示为m）也是有效的（即直线距离A比直线距离/短）.相反，细胞群B则是无 效的，因为到最近有效细胞群的直线距离g比直线距离A更长.6.9.4确定细胞的线性最长迁移距离在确定“细胞群”的线性最长迁移距离之后,使用最接近的细胞群”，而不是“细胞”对单个细胞的距 离进行相同的确认.例如在图11中，当所有圆阁B、C和D是“细胞”而不是“细胞群时，细胞B应使用 直线长度e和/，而不是g和A进行确认。因此，即使直线长度g比直线长度A更短，细胞B也是无效 的，因为直线长度e比直线长度/更长.当C是“细胞群”时，使用直线长度g和A来确认细胞B.£ 1(1)在经过上述确认之后，应选择细胞和
25、细胞群的线性最长距离中的较长距离作为样品的最大细胞迁 移距离。说明sB、C、D 无序迁移的细胞群或细胞；d当C是有效细胞群时，细胞群/细胞B的长直线距珥；e当C不是有效细胞群时，细胞群/细胞B到有效细胞群的齩近距离；f当C不是有效细胞群时，距离细胞群/细胞B嫉近的有效细胞群的迁移距离|g当C是有效细胞群时，细胞群/细胞B与有效细胞群之间的最近距离；h细胞群/细跑C的S长直线鉅离！1细胞群/细胞C到有效细胞群的ft近®离；距离细胞群/细胞Cii近的有效细胞群的迁移鉅离；k细胞群/细胆D与有效细胞群之间的近HI离；I距离细胞群/细胞D W近的有效细胞群的迁移组离tm钿胞群/细胞D的
26、74;长亘线距离。困11当样品中存在很多分散细胞群时迁移距离测量6.10收取样品后残留在孔（皿）内的细胞为了确认细胞从孔板或皿底部移动到样品中的行为，收取样品后应对皿或孔板进行吉姆萨染色，操 作如下：固定处理3 min后，每孔或皿内加人2.5 mL吉姆萨溶液的稀释液（使用PBS进行适当稀释）. 然后移除染色液并使用2.5 mL蒸塯水清洗3次.以10倍或最大可用放大率拍摄每个孔或皿的立体显微照片，确保能够在一张照片中观察到板或皿 的底部7计算7.1平均迁移距离和标准偏差根据式（1）和式（2）计算毎个样品组的平均迁移距离及其标准偏差。平均迁移距离：标准偏差:-1(2 ) 经过验证的最大測a距离;测
27、试样片的总数。7.2相对平均迁移距s和相对标准偏差根据7.1中计算出的平均迁移距离及其标准偏差，运用式（3）和式（4）来计笄相对平均迁移距离和 相对标准偏差.相对平均迁移距离：相对标准偏差:(3 )6）(4 )用式（5）计算参考样品的相对平均迁移距离和相对标准偏差:(5 )式中r7参考样品的平均距离f试验样品的平均距离&相对平均迁移距离；参考样品平均距离的标准偏差; SB试验样品平均距离的标准偏差f SR 相对平均迁移距离的标准偏差。8试验报吿多孔生物陶瓷支架中细胞迁移的评估结果报卉应包含以下内容：a）参考标准，如ISO 19090 Bb）名称、产品编号、批号、主要成分、尺寸、孔径、孔
28、径分布、孔形状和孔隙率及其测量方法，以及试 样的制造商，c）试验的年/月/日、试验人员的姓名、隶属关系和职位.如果适用，也可包括试验室的质量管理 体系，d）使用的细胞系的名称和来源（供应商）、将陶瓷样品放罝前单层细胞总数、细胞计数方法和细胞 汇合百分率e）培养基，血淸和抗生素的名称、类型、商品编号、批号（如果适用，也需注明培养基中血清和抗生 索的浓度）Bf）细胞培养用的培养板、移液器吸头、移液器、无菌过滤器、细胞培养瓶等的名称、商品编号、批号 和生产商（或销售商Kg）作为对照的多孔陶瓷样品的名称、商品编号、批号和制造商（或销色商）。10YY/T 17442020h）试验结果，1）作为“细胞迁移
29、距离”的平均最长直线距离及其标准偏差；2）样品横截面和底面的立体i微照片；3）在迁移试验之前，六孔板中经吉姆萨染色细胞的立体显微照片；4）在迁移试验之后，六孔板中经吉姆萨染色细胞的立体显微照片|5）经参考样品数据标准化处理后的相对细胞迁移距离及其标准偏差.i）结论.11YY/T 17442020参考文献1 ISO 13366-1 MilkEnumeration of somatic cellsPart 1: Microscopic method (Reference method)2 ASTM F2149 – 01 (Reapproved 2007) Standard Test Method (or Automated Analyses of Cells the Electrical Sensing Zone Method of Enumerating and Sizing Single Cell Suspensions3 Russel W. M. S. The Three Rs： past，present and future> Animal Welfare 14，279-286 (2005)4 Ki
