*仅供医学专业人士阅读参考
点击右上方“关注”，
准时接收每日精彩内容推送。
不可控的出血是外科手术中或遭受重大创伤后的一个严重问题，导致了全世界超过30%的创伤伤亡，其中一半以上发生在紧急护理之前[1,2]。有效的止血可显著减轻痛苦，防止进一步损伤，促进伤口恢复并提高存活率。然而，现有的止血敷料（纱布、纸巾和止血带等）不能很好地控制伤口、创伤性静脉或动脉的出血，而且它们对潮湿或可移动组织的粘附力较弱，难以应用在动脉和内脏伤口的出血上。为解决上述问题，研究者们开发了各种类型的止血敷料，如原位水凝胶、海绵、粉末和颗粒等（表1）。
表1 常用的止血材料
那么问题来了，对于水凝胶的止血性能该如何检测呢？为此，本期EFL将为大家介绍几种常见的水凝胶止血的检测手段，并通过事发分析具体的检测方法。
01
检测方法
（1）管倒置观察法
首先，将150μL水凝胶放置在37℃下2.0 mL的离心管中，随后加入300μL的肝素化全血溶液。空白对照组只取血液，不取任何样品进行处理。为评估水凝胶的体外止血性能，将离心管倒置以确定血液是否能承受其重量发生流动[7]。
（2）直接观察法
通过穿刺或刮擦在目标模型上造成出血，立即将水凝胶贴在出血部位，观察出血情况（拍摄视频或图片记录止血过程）。
（3）SEM观察法
通过将血液与水凝胶直接接触后，对水凝胶进行SEM拍摄，观察血液细胞和血小板在样品表面的粘附、形态和数量，进一步研究水凝胶的止血机制。水凝胶对血小板和血细胞的吸收能力越强，则具有更好的体外凝血效果[1]。
（4）凝血指数（Blood Clotting Index，BCI）测定
向肝素化大鼠血液（9mL）中加入CaCl2（1mL，0.1M）以活化血液。将50µL活化血液置于水凝胶表面，并在不同时间点使用5 mL去离子水溶解未凝固的血液。通过酶标仪测试540 nm处的OD值。50µL血液在5 mL去离子水中的溶液作为参比。BCI通过以下公式计算：
BCI越低，表明可以更有效地刺激血液凝固。
（5）红细胞（Red Blood Cells，RBC）吸附率测定
在96孔板中加入100μL水凝胶，然后将50μL枸橼酸全血加入水凝胶表面，在37°C振荡器中孵育10min，然后用PBS洗涤未粘附的红细胞。随后，将水凝胶转移到含有3mL去离子水的离心管中，并在37°C下孵育30min以裂解贴壁红细胞。在540 nm处测试OD，并以50µL血液加入3ml去离子水作为参比。
红细胞的高吸附能力有助于体外的凝血作用。
（6）血小板（Platelets）吸附率测定
将全血以4000 rpm离心10min以获得PRP。将50 µL PRP添加到100 µL水凝胶表面，并在37 °C的振荡器中孵育10min。未粘附的血小板用PBS洗涤3次，然后通过将水凝胶浸入1 mL Triton X-100 (1%) 中，在37 °C下1h来裂解粘附的血小板。然后，按照LDH试剂盒说明书使用酶标仪在490nm处检测OD值。以未经处理的50 µL PRP作为参照组[8]。
血小板的高吸附能力有助于体外的凝血作用。
（7）相对失血量或失血重量
使用动物的出血模型评估水凝胶的体内止血性能。以小鼠肝脏穿刺出血模型为例，对动物进行麻醉后，切开腹部以露出肝脏。使用注射器针头在肝脏上进行肝脏穿刺，随后将称重的滤纸放在肝脏下。然后迅速将水凝胶注入或粘附在出血部位，并在设定的时间内记录失血重量。未经任何治疗的伤口用作对照。
其中 M样品和M对照分别代表样品组和对照组的失血量。
该方法常见的出血模型包括：肝脏切口、肝脏缺损和尾部截肢等。
（8）凝血时间测定
对动物进行麻醉后，手术暴露目标模型部位，使用注射器针头或手术刀在目标部位进行穿刺或损伤，然后迅速将水凝胶注入或粘附在出血部位，并记录伤口停止出血的时间。未经任何治疗的伤口用作对照。
以上所述方法可试用常见的出血模型，例如：肝脏穿刺、肝脏切口、肝脏缺损、尾部截肢、颈静脉穿刺、股静脉穿刺、腹主动脉损伤、不可压缩脊髓横断和神经横断出血模型等。
接下来，我们通过具体事发来看看小哥中都是如何表征水凝胶止血能力的。
02
事发说明
（1） Advanced Healthcare Materials（IF= 11.092）:具有固有抗菌、止血、炎症调节和促再生性能的复合海绵用于MRSA感染的伤口愈合
图1 复合聚合物海绵的制备示意图及其作为用于MRSA感染伤口愈合的新型多功能敷料的应用。PAAS，聚丙烯酸钠；QAS-CS，季铵盐结合壳聚糖；COL，胶原蛋白。
检测方法：鼠尾截断法–失血重量、凝血时间；SEM观察
图2 PQC海绵止血能力的体外和体内评价
原文链接：
（2）Advanced Functional Materials （IF=19.924）：生物启发的多功能混合水凝胶促进伤口愈合
图3 通过混合 DCS 和 BAPEG 溶液形成混合水凝胶的示意图。
检测方法：管倒置观察法
图4 i) CS、ii) DCS、iii) CS/BAPEG、iv) DCS/BAPEG对肝素化小鼠血液的影响。
检测方法：直接观察法（肝脏缺损、颈静脉穿刺、股静脉穿刺）
图5 a) 混合水凝胶装饰针、血管出血和肝脏出血的示意图。
原文链接：
（3）Advanced Functional Materials（IF=19.924）：仿生天然生物聚合物基湿组织粘合剂，用于坚韧粘合、无缝密封、紧急/非压迫止血和促进伤口愈合
图6 仿生CoSt水凝胶的配制和形成
检测方法：凝血指数（BCI）测定、红细胞（RBC）吸附率测定、血小板吸附率测定、凝血时间、管倒置观察法、SEM观察法
图7 水凝胶体外止血功效评价
检测方法：鼠断尾模型–失血量测定、凝血时间测定；肝损伤模型–失血量测定、凝血时间测定
图8 水凝胶在大鼠尾部截肢和严重肝损伤模型中的止血特性
检测方法：腹主动脉出血模型–止血时间；横断神经损伤出血模型–止血时间
图9 水凝胶在大鼠腹主动脉损伤和横断神经损伤模型中的止血特性
原文链接：
（4）Advanced Functional Materials（IF=19.924）：一种用于止血和伤口密封的可注射快速粘附和抗膨胀水凝胶
图10 快速粘附和抗膨胀的止血水凝胶(RAAS)的设计示意图。
检测方法：肝缺损出血模型–失血量；腹主动脉损伤和横断神经损伤出血模型–直接观察法
图11 水凝胶在大鼠腹主动脉损伤和横断神经损伤模型中的止血特性
原文链接：
通过对于上述水凝胶的多种止血性能检测手段的了解，在课题研究中，我们可以根据所设计材料的具体特性，选择合适的出血模型和表征手段更好的全面的研究材料的止血特性。
参考文献
[1] X Zhao, B Guo, H Wu, et al. Injectable antibacterial conductive nanocomposite cryogels with rapid shape recovery for noncompressible hemorrhage and wound healing [J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 2784.
[2] B Guo, R Dong, Y Liang, et al. Haemostatic materials for wound healing applications [J]. Nature Reviews Chemistry, 2023, 5(11): 773-791.
[3] L Wang, Y Zhong, C Qian, et al. A natural polymer-based porous sponge with capillary-mimicking microchannels for rapid hemostasis [J]. Acta Biomaterialia, 2023, 114: 193-205.
[4] X Zhao, B Guo, H Wu, et al. Injectable antibacterial conductive nanocomposite cryogels with rapid shape recovery for noncompressible hemorrhage and wound healing [J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 2784.
[5] Y Wang, Y Zhao, L Qiao, et al. Cellulose fibers-reinforced self-expanding porous composite with multiple hemostatic efficacy and shape adaptability for uncontrollable massive hemorrhage treatment [J]. Bioactive Materials, 2023, 6(7): 2089-2104.
[6] Y Hong, F Zhou, Y Hua, et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds [J]. Nature Communications, 2023, 10(1): 2060.
[7] X Xia, X Xu, B Wang, et al. Adhesive hemostatic hydrogel with ultrafast gelation arrests acute upper gastrointestinal hemorrhage in pigs [J]. Advanced Functional Materials, 2023, 32(16): 2109332.
[8] L Teng, Z Shao, Q Bai, et al. Biomimetic glycopolypeptide hydrogels with tunable adhesion and microporous structure for fast hemostasis and highly efficient wound healing [J]. Advanced Functional Materials, 2023, 31(43): 2105628.
了解更多
关注“EngineeringForLife”，了解更多前沿科研资讯~
