bm细胞包含什么细胞技术支撑｜大肠杆菌及脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞基质金属蛋白酶表达的影响-上海聚慕医疗器械有限公司

摘要：为研究大肠杆菌（E. coli）及脂多糖（LPS）对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）基质金属蛋白酶（MMPs）表达的影响，以及MMPs与基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）系统在调控细胞外基质（ECM）代谢中的作用，分别以10⁶ CFU/mL热灭活E. coli菌液、7.5 µg/mL LPS以及E. coli菌液与LPS混合液作用于体外培养的BMECs，分别在作用细胞6、12、24、48 h后提取细胞总RNA和总蛋白，通过qPCR、Western blot检测MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1 mRNA转录水平和相应蛋白表达水平，并通过明胶酶谱试验检测细胞上清液中MMP-2和MMP-9蛋白活性。结果显示：E. coli菌液和LPS作用于BMECs后，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1 mRNA转录水平和相应蛋白表达水平均有不同程度上升。MMP-2、TIMP-1、uPA、uPAR、PAI-1 mRNA转录水平在菌液作用后显著上升，MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-2、uPAR mRNA转录水平在菌液与LPS联合作用后显著上升；MMP-9、MMP-13、TIMP-2蛋白表达水平在LPS作用后显著上升；TIMP-1、uPA、uPAR蛋白表达水平在菌液作用后显著上升；MMP-9、MMP-13、uPA、uPAR蛋白表达水平在菌液与LPS联合作用后显著上升。3个作用组MMP-2蛋白活性在不同时间均显著上升；菌液、菌液与LPS联合作用12 h时MMP-9蛋白活性显著上升。结果表明，热灭活E. coli菌液和LPS可诱导BMECs中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR和PAI-1的表达，并激活uPA系统参与调控MMPs的表达。本试验初步探究了大肠杆菌感染奶牛乳腺组织导致乳腺纤维化的发病机理，为奶牛乳腺炎和乳腺纤维化药物研究提供了依据。

奶牛乳腺炎是乳腺组织受到病原微生物感染或理化因素刺激等发生的炎症反应，可导致奶牛泌乳量减少、奶品质下降、生长发育减缓、繁殖力降低、产奶年限缩短和死淘率上升。奶牛乳腺炎可导致乳腺纤维化，主要病理变化为乳腺组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可使乳腺结构破坏和功能减退。奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）具有天然免疫功能，在感染的早期，能够及时识别病原并释放细胞因子，以阻止病原侵入和增殖，并介导表达促炎因子诱导的炎症反应。在炎症后期，细胞再生与肉芽组织增生修复损伤使上皮细胞发生转分化，形成活化的肌纤维母细胞，进而引发纤维化。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度合成、分解ECM的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达受阻或是基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissuse inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）的过度表达，是组织器官纤维化的主要原因。MMPs是一类依赖于Zn²⁺/Ga²⁺等金属离子的内肽酶，能够降解ECM的不同成分。MMPs的催化活性主要在基因表达、酶原激活和特异性抑制剂（金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs和非特异性蛋白酶抑制剂）3个方面受到调控。尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）系统主要包含uPA、uPAR和PAI-1。uPA可以催化纤溶酶原（Plg）转化为有活性的纤溶酶，在ECM蛋白降解过程中发挥作用；PAI-1通过调节ECM的降解和沉积、刺激细胞增殖、调节细胞的黏附作用等过程，参与组织器官纤维化等疾病的发展。

大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一，是一种无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。它是条件性致病菌，通常大多数作为正常菌群存在于机体胃肠道中，少部分在一定条件下引起组织器官感染。由大肠杆菌导致的乳腺炎多表现为急性，多发生于产奶量高的奶牛。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，是脂质和多糖的复合物，可代替革兰氏阴性菌应用于诱导炎症的动物和细胞模型。本试验通过研究大肠杆菌和LPS对BMECs MMPs/TIMPs和uPA系统表达的影响，以阐明MMPs/TIMPs和uPA系统在调控ECM代谢中的作用，从而进一步阐明大肠杆菌感染奶牛乳腺组织导致乳腺纤维化的发病机理，为研究奶牛乳腺炎和乳腺纤维化药物提供依据。

材料和方法

材料准备

主要试剂　LPS，购自InvivoGen公司；Multisource Total RNA Miniprep Kit，购自AXYGEN公司；全蛋白提取试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；反转录试剂盒、qPCR试剂盒，均购自TaKaRa公司；DMEM/F12培养基，购自Gibco公司；MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1兔单抗，购自Proteintech公司；β-actin鼠单抗、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP二抗，均购自天津三箭生物技术股份有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；ECL显色液，购自Thermo公司；蛋白预染Marker，购自Bio-Rad公司；MMP-2和MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒，购自上海信帆生物科技有限公司；CCK-8试剂盒，购自Biosharp公司。

菌种及细胞　大肠杆菌菌种，由本实验室分离、鉴定并保存，BMECs由本实验室保存备用。

热灭活菌液制备　参考赵楠的试验方法，制备热灭活的大肠杆菌菌液。

BMECs复苏及培养　将实验室冻存的第3代BMECs复苏培养，按1×10⁵ 个/mL接种于细胞瓶，传代后使用无胎牛血清（FBS）DMEM/F12培养液饥饿处理24 h进行后续试验。

刺激BMECs的LPS最佳质量浓度筛选　收集对数生长期BMECs接种于96孔板，设置对照组（不添加LPS）以及4个LPS刺激组（分别添加LPS，使其最终质量浓度分别为2.5、5.0、7.5、10.0 µg/mL），每组3个重复，同时空白对照仅添加基础培养基；将96孔板置于37 ℃恒温培养箱继续孵育6 h后，每孔加入10 µL CCK8溶液，继续在培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定OD_{600 nm}，以细胞抑制率（IR）≤10%为判断标准，确定LPS最佳刺激浓度。IR =（LPS刺激组OD_{600 nm}-空白组OD_{600 nm}）/（对照组OD_{600 nm}-空白组OD_{600 nm}）× 100%。经计算，7.5 µg/mL LPS为刺激BMECs的最佳剂量。

试验方法

菌液和LPS处理细胞　待BMECs生长至第7代并铺满细胞瓶时，用无FBS的DMEM/F12培养基饥饿处理细胞24 h。对照组为无FBS培养基；试验组分为热灭活大肠杆菌菌液（10⁶ CFU/mL）处理组，LPS（7.5 µg/mL）处理组，以及大肠杆菌、LPS联合作用组（简称联合作用组）。将大肠杆菌菌液及LPS加入细胞瓶中作用6、12、24、48 h后，收集细胞上清用于明胶酶谱检测，提取细胞总RNA用于RT-qPCR检测，提取细胞总蛋白用于Western blot试验。

实时荧光定量PCR检测　提取各组细胞的总RNA，通过酶标仪测得各组RNA浓度和纯度，参考反转录试剂盒说明书进行cDNA制备。qPCR反应体系参考TB®Premix Ex Taq™ II说明书，并于Quant Studio™ 7 Flex Real-Time PCR System仪器进行试验。设计β-actin、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1基因引物序列（表1）。以β-actin作为内参基因，检测MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1 mRNA转录水平，并重复3次试验。结果采用2^-∆CT法分析，所得数据用Graph Pad Prism 5作图，并进行双因素方差分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01及P＜0.001均为差异极显著。

Western blot检测　提取各组细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白样品浓度；设定蛋白的统一上样量为20 µg，加入蛋白上样缓冲液，经金属浴100 ℃变性5 min后，置于-80 ℃保存；参考Solarbio蛋白凝胶试剂盒说明书操作，配制SDS-PAGE凝胶进行试验，使用对应的抗体孵育，采用ECL显色试剂盒显影拍照，检测MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达情况。结果利用Image J进行灰度分析，所得数据用Graph Pad Prism 5作图，并进行双因素方差分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01及P＜0.001均为差异极显著。

明胶酶谱检测　制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶，用收集的各组细胞上清与2×SDS-PAGE nonreducing buffer按照体积比1:1混合，上样，在110 V电压下进行凝胶电泳；分别用明胶酶谱检测试剂盒1×Buffer A、1×Buffer B孵育凝胶，考马斯亮蓝染色液染色后，再用脱色液脱去浮色；将凝胶放在扫描仪上扫描，透亮区域即为MMP-2、MMP-9的活性位置。结果利用Image J进行灰度分析，所得数据用Graph Pad Prism 5作图，并进行双因素方差分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01及P＜0.001均为差异极显著。

结果

MMP-2、MMP-9 mRNA转录水平、相应蛋白表达水平及明胶酶谱分析

MMP-2、MMP-9 mRNA转录水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-2 mRNA转录水平在6 h时显著上升，在12 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-2 mRNA转录水平在6 h时显著下降；联合作用组MMP-2 mRNA转录水平在6 h时显著下降（图1-A）。作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-9 mRNA转录水平在6 h时极显著上升，在24、48 h时显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-9 mRNA转录水平在48 h时极显著上升；联合作用组MMP-9 mRNA转录水平在12、48 h时极显著上升（图1-B）。

MMP-2、MMP-9蛋白表达水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组、7.5 µg/mL LPS处理组以及联合作用组MMP-2蛋白表达水平在6、12、24、48 h时均极显著上升（图2-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-9蛋白表达水平在6、12、24、48 h时均极显著下降；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-9蛋白表达水平在12 h时显著上升，24、48 h时均极显著上升；联合作用组MMP-9蛋白表达水平在6 h时极显著下降，24、48 h时均呈极显著上升（图2-B）。

MMP-2、MMP-9蛋白明胶酶谱分析　作用6、12、24、48 h后，利用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9蛋白活性。结果显示，可在72和92 kDa位置处发现清晰、活化的MMP-2和MMP-9蛋白条带。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-2活性在6、12、24 h时均呈极显著上升，48 h时极显著下降；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-2活性12、24 h均呈极显著上升，48 h时极显著下降；联合作用组MMP-2活性在6、12、24、48 h时均极显著上升（图3-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-9活性在12 h时显著上升，24、48 h时极显著下降；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-9活性在12、24、48 h时极显著下降；联合作用组MMP-9活性在24、48 h时极显著下降（图3-B）。

MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA转录水平和相应蛋白表达水平

MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA转录水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-1 mRNA转录水平在6 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-1 mRNA转录水平在各时间点转录水平差异均不显著；联合作用组MMP-1 mRNA转录水平在12 h时极显著上升（图4-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组、7.5 µg/mL LPS处理组MMP-3 mRNA转录水平在各时间点的差异均不显著；联合作用组MMP-3 mRNA转录水平在12 h时极显著上升（图4-B）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-13 mRNA转录水平在12 h时显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-13 mRNA转录水平在12 h时极显著上升；联合作用组MMP-13 mRNA转录水平在12 h时极显著上升（图4-C）。

MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表达水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-1蛋白表达水平在6、12 h时极显著下降，24、48 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组、联合作用组MMP-1蛋白表达水平在6、12、24、48 h时均极显著下降（图5-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-3蛋白表达水平在6 h时极显著上升，24、48 h时极显著下降；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-3蛋白表达水平在6、12 h时极显著上升，48 h时极显著下降；联合作用组MMP-3蛋白表达水平在6 h时显著上升，12、24 h时极显著下降（图5-B）。10⁶ CFU/mL菌液处理组MMP-13蛋白表达水平在6、12、24、48 h时均极显著下降；7.5 µg/mL LPS处理组MMP-13蛋白表达水平在12 h时极显著下降，在24、48 h时极显著上升；联合作用组MMP-13蛋白表达水平在12、24、48 h时均极显著上升（图5-C）。

TIMP-1、TIMP-2 mRNA转录水平和相应蛋白表达水平

TIMP-1、TIMP-2 mRNA转录水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组TIMP-1 mRNA转录水平在6 h时显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组、联合作用组TIMP-1 mRNA转录水平均在6 h时极显著下降；（图6-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组、7.5 µg/mL LPS处理组TIMP-2 mRNA转录水平在各时间点转录水平差异均不显著；联合作用组TIMP-2 mRNA转录水平在12 h时极显著上升，24 h时显著上升（图6-B）。

TIMP-1、TIMP-2蛋白表达水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组TIMP-1蛋白表达水平在在6 h时极显著上升，24 h时显著下降，48 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组TIMP-1蛋白表达水平在6、12、24、48 h时极显著下降；联合作用组TIMP-1蛋白表达水平在12、24、48 h时极显著下降（图7-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组TIMP-2蛋白表达水平在6、12、24、48 h时极显著下降；7.5 µg/mL LPS处理组TIMP-2蛋白表达水平在6 h时极显著上升，12、24、48 h时极显著下降；联合作用组TIMP-2蛋白表达水平在6、12、48 h时极显著下降（图7-B）。

uPA、uPAR、PAI-1 mRNA转录水平和相应蛋白表达水平

uPA、uPAR、PAI-1 mRNA转录水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组uPA mRNA转录水平在6、12、24、48 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组uPA mRNA转录水平在12 h时显著上升；联合作用组uPA mRNA转录水平在12 h时极显著上升（图8-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组uPAR mRNA转录水平在6、12 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组uPAR mRNA转录水平在各时间点转录水平差异均不显著；联合作用组uPAR mRNA转录水平在12 h时极显著上升，24 h时显著上升（图8-B）。10⁶ CFU/mL菌液处理组PAI-1 mRNA转录水平在6 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组PAI-1 mRNA转录水平在6 h时极显著下降；联合作用组PAI-1 mRNA转录水平在6 h时极显著下降（图8-C）。

uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达水平　作用6、12、24、48 h后，与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组uPA蛋白表达水平在6、12、24、48 h时均极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组uPA蛋白表达水平在6 h时显著上升，12、24、48 h时均极显著下降；联合作用组uPA蛋白表达水平在6、24 h时极显著下降，48 h时极显著上升（图9-A）。与对照组相比，10⁶ CFU/mL菌液处理组uPAR蛋白表达水平在12、24 h时极显著下降，48 h时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组uPAR蛋白表达水平在6、24、48 h时极显著上升，12 h时极显著下降；联合作用组uPAR蛋白表达水平在6、12、48 h时极显著上升（图9-B）。10⁶ CFU/mL菌液处理组PAI-1蛋白表达水平在6、12、24、48 h时极显著下降；7.5 µg/mL LPS处理组、联合作用组PAI-1蛋白表达水平在6、12、24、48 h时均极显著上升（图9-C）。

讨论

当奶牛乳头、乳房通过创口或挤乳器被大肠杆菌污染，可引起乳腺感染。LPS的分子结构特殊，为革兰氏阴性菌细胞壁的最外层结构，具有抗原性与毒性。在正常机体内，MMPs可通过分解ECM来控制其数量，当炎性作用刺激ECM过度表达时，亦会诱导MMPs、TIMPs表达增多。

有研究发现，大肠杆菌感染绒毛膜后，MMP-2和MMP-9活性形态的分泌增加，并与ECM相关，而TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4没有变化。牙龈杆菌LPS和大肠杆菌LPS处理的细胞中MMP-3 mRNA和蛋白表达显著上调。以LPS诱导成骨样细胞MC3T3-E1模拟牙周炎患者的病理特征，结果证明LPS能够诱导MMP-13表达，说明大肠杆菌和LPS均可引起组织器官炎症甚至纤维化。本试验研究结果显示，热灭活的大肠杆菌菌液诱导后，BMECs中MMP-2、TIMP-1表达出现不同程度上调，LPS诱导后BMECs中也可检测出MMP-2。该结果与上述文献的结果相似，但MMP-2、TIMP-1 mRNA表达到达峰值的时间不一致。

据相关文献报道，LPS刺激系膜细胞后，系膜细胞TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达增高，而MMP-2、MMP-9 mRNA表达降低。本试验研究结果显示，热灭活的大肠杆菌菌液诱导后，BMECs中的TIMP-1表达出现上调，LPS诱导后BMECs中的TIMP-2表达量先极显著上升后极显著下降。在路军的研究中，LPS对TIMP-2的表达具有抑制作用，LPS在诱导平滑肌细胞MMP-9、TIMP-1表达的同时可降低TIMP-2表达，其作用呈浓度时间依赖性。这与本试验结果相似，TIMP是MMPs的内源性抑制剂，特异性抑制MMP的表达与活性，TIMP-2表达量下降可能与诱导后期MMPs表达量下降有关。

LPS能够促进牙龈成纤维细胞表达uPA，参与牙周组织的破坏。本试验结果显示，LPS作用组和联合作用组诱导后，BMECs中PAI-1的表达出现不同程度上调，并且随诱导时间延长，MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13表达量出现下降。uPA与细胞表面受体uPAR结合，使uPA浓集于细胞表面，活性形式的uPA丝氨酸蛋白酶结构域可水解激活纤溶酶原转变为纤溶酶，纤溶酶可直接降解基质组分或进一步激活金属蛋白酶降解基质。uPA一方面激活MMPs，引起ECM降解，另一方面又诱导产生PAI-1，使MMPs的产生受限。PAI-1通过调节ECM的降解和沉积、刺激细胞增殖、调节细胞黏附作用等过程，参与纤维化、肿瘤和心血管疾病等的发展。

在大肠杆菌诱导的大鼠肺损伤试验中，MMP-9 mRNA和蛋白表达均升高；在LPS诱导小鼠肺损伤试验中，MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达均升高。在转基因小鼠肺组织中TIMP-1/-2/-3表达上调，MMP-9活性降低，从而可能减少ECM降解，导致肺纤维化。有研究表明，MMP-13由促炎细胞因子诱导，其表达增加与肿瘤、骨关节炎、类风湿关节炎和牙周病等疾病发生发展相关。MMP-2和MMP-9在炎症早期是具有抗纤维化功能的酶，降解部分过多的ECM，减缓纤维化进程，在炎症后期又可作为炎症前介质，促进细胞增生，启动并加速纤维化进程。

大肠杆菌抗原成分复杂，可分为菌体抗原、鞭毛抗原和表面抗原，后者有抗吞噬和抗补体能力。LPS是大肠杆菌细胞壁的重要组成部分，是革兰氏阴性菌重要的毒力因子。本试验中大肠杆菌作用组MMP-2、MMP-3、TIMP-2和PAI-1 mRNA和蛋白表达量高于LPS作用组，可能与大肠杆菌其他毒力因子作用有关。LPS可以通过细胞信号转导途径引起动物体内炎症反应。本试验中，联合作用组MMP-1、MMP-9、MMP-13和uPAR mRNA表达量低于菌液作用组和LPS作用组，可能与BMECs对LPS的耐受量有关。据相关文献报道，20 μg/mL LPS在体外直接作用可诱导正常肝细胞发生凋亡。在筛选LPS刺激BMECs最佳质量浓度试验中，10 μg/mL LPS作用后BMECs的细胞抑制率下降，说明更高质量浓度的LPS可能会导致BMECs损伤。本试验研究表明，大肠杆菌和LPS诱导BMECs的早期，uPA系统被激活表达，参与了MMPs/TIMPs的激活与调控，促进了ECM代谢，随着诱导时间延长，uPA和uPAR的表达下降，这可能是因为PAI-1的显著升高抑制了uPA和uPAR表达，进而抑制了其对MMPs/TIMPs活化的促进作用，加快纤维化进程，也可能是MMPs/TIMPs和uPA系统在奶牛乳腺纤维化中的潜在机制。本试验为明确大肠杆菌及LPS诱导的BMECs中MMPs/TIMPs及uPA系统对奶牛乳腺纤维化的影响奠定了基础。

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（责任编辑：高向向）

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