1.1.1 菌株
菌株解淀粉芽孢杆菌BS-3分离自云南省景洪市橡胶树根，对多种病原菌有抑制作用，保存于云南省热带作物科学研究所植物保护与微生物利用研究中心。
植物病原真菌：橡胶树褐根病菌(Phellinus noxius)、尖孢炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)、橡胶疫霉(Phytophthora heveae)均保存于云南省热带作物科学研究所植物保护与微生物利用研究中心。
1.1.2 主要试剂和仪器
细菌基因组DNA提取试剂盒，布鲁克(北京)科技有限公司；DL2000 DNA Marker，北京天根生化科技有限公司。PCR仪，Applied Biosystems公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；NanoDrop 2000，赛默飞世尔科技公司。
1.1.3 培养基
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0；PDA培养基(g/L)：马铃薯200.0、葡萄糖20.0。固体培养基均添加琼脂粉15 g/L。1×105 Pa灭菌30 min。
1.2.1 植物病原真菌拮抗试验
采用平板对峙法，在PDA平板中间分别放置橡胶树褐根病菌、尖孢炭疽病菌、小孢拟盘多毛孢、橡胶疫霉4种植物病原菌的菌块，菌块四周划线接种BS-3，以只接种病原菌的处理为对照，重复3次，28 ℃恒温箱中培养5 d，测量抑菌圈直径(对照组菌落生长直径−处理组菌落生长直径)，观察抑菌情况并拍照。
1.2.2 菌株总DNA提取
菌株BS-3接种于LB培养基中，在37 ℃、180 r/min条件下培养12 h，将培养液10 000×g离心5 min收集菌体，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组，操作步骤参照试剂盒说明书。使用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测DNA样品的浓度、纯净度和降解程度。
1.2.3 全基因测序
本次测序委托深圳华大基因股份有限公司完成。样本质检合格后，使用Covaris仪超声波打断DNA样品，进行文库构建。采用第二代BGISEQ平台与第三代PacBio平台相结合的测序技术进行测序。
1.2.4 基因组组分分析
使用pb-falcon v2.2.3软件对三代Reads进行组装，并对二代数据组装结果进行2次Polish (pilon v1.23软件)。编码基因预测使用GeneMarkS软件(V4.17) (http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)[]；重复序列的预测使用RepeatMasker (Version open-4.0.5)软件和TRF (Tandem Repeats Finder，V4.07b)[-]；tRNA预测通过tRNAscan-SE软件(V1.3.1)[]，rRNA预测采用RNAmmer软件(V1.2)[]，sRNA确定采用cmsearch程序(V1.1rc4)[-]。基因岛预测采用IslandPath-DIOMB软件(V0.2)[]，前噬菌体预测通过PhiSpy软件[](V2.3)，CRISPR预测利用CRISPRdigger[](V1.0)。
1.2.5 基因功能分析
(1) 基因功能注释
使用BLAST软件与Gene Ontology (GO)[]、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)[-]、Cluster of Orthologous Groups of Proteins (COG)[]、Non-Redundant Protein Database (NR)[]、Carbohydrate-Active EnZymes Database (CAZy)[]、Type Ⅲ Secretion System Effector Protein (T3SS)[]、Virulence Factor Database (VFDB)[]、Pathogen Host Interactions (PHI)[]、Swiss-Prot[]数据库进行比对，获得功能注释信息。
(2) BS-3的进化和比较基因组学分析
根据全基因组注释信息，选择gyrA基因序列及NCBI数据库比对分析结果，利用MEGA 7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树；同时将菌株BS-3的基因组序列与参考菌B. amyloliquefaciens subsp. FZB42 (CP000560)的基因组序列基于Mummer进行比对分析。
(3) 拮抗物质分析
利用antiSMASH 3.0 (https://fungismash.secondarymetabolites.org)对菌株BS-3中次级代谢产物合成基因簇进行预测[]。结合基因注释结果和NCBI BLAST比对分析结果，分析菌株BS-3次级代谢产物中的抑菌物质及编码基因簇。
2.3.1 GO注释结果
将菌株BS-3氨基酸序列与GO数据库进行比对和统计分析，得到菌株功能基因的分布情况。共有2 620个基因在GO数据库中被注释到，GO数据库按照细胞组分(Cellular Component)、生物学过程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function) 3个方面对蛋白进行注释()，而生物学过程、细胞组分和分子功能分支各25、11和10个，共计46个分支。在细胞组分中，共2 450个基因得到注释，其中与细胞部分(Cell Part)、细胞(Cell)、细胞器(Organelle)有关的基因表现出最高相关性，各有914、914、198个；生物学途径类共5 967个基因被注释，涉及最多的基因与细胞内过程(Cellular Process)、代谢过程(Metabolic Process)有关，各有1 464、1 466个；分子功能分支共3 271个注释结果，其中涉及最多的基因与结合(Binding)、催化活性(Catalytic Activity)、转运活性(Transporter Activity)有关，分别为1 186、1 408、236个。
2.3.2 COG注释结果
对菌株BS-3基因组中具有生物学功能的蛋白编码基因进行COG注释，结果发现共有2 875个蛋白编码基因被注释到。如所示，基因功能注释结果共分为25类，分别有1、1、167、58、306、89、248、184、131、221、283、123、202、63、117、173、95、301、210、171、31、87、2、31、2个基因注释分类到A−Z，其中氨基酸代谢及转运(Amino Acid Transport and Metabolism)的注释结果最为丰富，共306个，占注释基因总数的10.64%；其次为常规功能预测(General Function Prediction Only)基因，共301个基因，占注释基因总数的10.47%，而转录(283个基因，9.84%)、碳水化合物转运和代谢(248个基因，9.88%)、翻译、核糖体结构和生物合成(221个基因，7.69%)的基因也得到较多的注释，此外还有210个(7.3%)功能未知的基因，有待今后进一步研究。
2.3.3 KEGG注释结果
将菌株BS-3与KEGG数据库进行比对分析，对应到KEGG Pathway的1 855个基因富集在194条代谢通路中，占菌株基因总数的44.85%；基因数大于等于20的代谢通路有24个()。KEGG富集分析显示，ABC转运蛋白(ABC Transporters)、双组分调节系统(Two-Component System)、细菌的群体行为调控机制(Quorum Sensing)是最主要的3种代谢通路，分别有120、107和70个基因注释结果；此外，嘌呤代谢(Purine Metabolism)、核糖体(Ribosome)、嘧啶代谢(Pyrimidine Metabolism)、丙酮酸代谢(Pyruvate Metabolism)、氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation)通路与菌株基因组相比具有较高的相关度。
2.3.4 CAZy功能分析
将基因组序列与CAZy数据库进行比对，发现菌株BS-3的基因组中共有140个基因编码的蛋白质结构域属于CAZy家族，包括20类糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GHs)家族的蛋白49个、9类糖苷转移酶家族的蛋白(Glycosyl Transferases，GTs) 36个、6类碳水化合物酯酶(Carbohydrate Esterases，CEs) 17个、2类多糖裂解酶(Polysaccharide Lyases，PLs) 3个、辅助酶4个、3类碳水化合物结合组件(Carbohydrate-Binding Modules，CBMs) 31个。土壤中存在植物病残体，这些病残体物质的主要组分是糖类和蛋白质类，而菌株BS-3中含有编码内切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)、α-淀粉酶(amyE，EC3.2.1.1)等酶的基因，从基因角度分析进一步了解菌株BS-3的生防作用机理。
2.3.5 NR数据库和Swiss-Prot数据库的注释
将菌株BS-3的基因序列翻译为相应的氨基酸序列，并与NR数据库进行比对，基因组中有4 040个基因在NR数据库上得到注释，得到B. amyloliquefaciens、B. subtilis、B. velezensis、B. nakamurai、B. paralicheniformis、Streptococcus pneumoniae和Paenibacillus sp.这7类物种，数量分别为3 237、1 599、342、36、1、70和3个。Swiss-Prot是一个精选的蛋白质序列数据库，包括蛋白质功能、结构、翻译后修饰、变异等描述，菌株BS-3中有3 328个基因的蛋白序列功能在该数据库中得到有意义的注释。
2.3.6 毒力因子分析
将菌株BS-3的基因组与VFDB数据库进行比对分析，在菌株BS-3的基因组发现62个毒力因子基因，其中最大基因为1 168 bp，最小基因为56 bp，具体结果如所示。这说明菌株BS-3有可能释放毒力因子来抑制病原菌的生长。
2.3.7 耐药基因分析
通过ARDB数据库注释，找到菌株BS-3的基因组有耐药基因30个，耐受药物林可霉素(Lincomycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、磷霉素(Fosfomycin)、青霉素(Penicillin)、抗菌物(na_Antimicrobials)、喹嗪(qa_Compound)、氨基糖苷(Aminoglycoside)、万古霉素(Vancomycin)、甲氧苄啶(Trimethoprim)、四环素(Tetracycline)、杆菌肽(Bacitracin)、脱氧胆酸盐(Deoxycholate)、大环内酯(Macrolide)、链霉素(Streptomycin)、膦胺霉素(Fosmidomycin)共15种，具体结果如所示。
2.5.1 次级代谢产物合成基因簇分析
次级代谢产物是微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体合成的一系列大分子生长非必需物质，用anti-SMASH对菌株BS-3基因组进行次级代谢产物分析，预测得到10个次级代谢产物基因簇()，并从中发现4类具有抗菌活性的物质：多烯类(Bacillaene)、丰原素(Fengycin)、儿茶酚型嗜铁素(Bacillibactin)和表面活性肽(Surfactin)。其中，Cluster 3与BGC0001089 c1来源的Bacillaene合成基因簇相似性为100%；Cluster 4与BGC0001095 c1来源的Fengycin合成基因簇相似性为93%；Cluster 7与BGC0000309 c1来源的Bacillibactin合成基因簇相似性为100%；Cluster 10与BGC0000433 c1来源的Surfactin合成基因簇相似性为86%；Cluster 8与BGC0001184 c1来源的杆菌溶素(Bacilysin)合成基因簇相似性为100%。比对发现菌株BS-3基因组中还存在4种功能未知的基因簇(Cluster 2、5、6、10)，其中Lantipeptide 1种、T3PKS (Type Ⅲ PKS)类1种、萜类(Terpene) 2种，这表明菌株BS-3中可能存在合成新抑菌物质的基因簇，具有较大的农业和药业应用潜力。
从2.4中选择3株参与gryA分析的芽孢杆菌近缘种，对基因组中已知功能的基因簇进行统计，统计结果如所示，除丁酰苷菌素(Butirosin)外，其他近缘菌种基因组中均有BS-3中含有的化合物，而Butirosin与菌株BGC0000693 c1来源的基因簇相似性仅为7%，说明该基因簇可能合成新的抑菌物质，有待今后进一步研究。
2.5.2 其他抑菌物质
据报道芽孢杆菌中的碱性丝氨酸蛋白(Alkaline Serine Protease)能够有效地杀死线虫，同时解淀粉芽孢杆菌FZB42和解淀粉芽孢杆菌Y2具有减少植物根部的根结线虫的能力，基因分析菌株BS-3中的碱性丝氨酸蛋白酶(BS3_GM000172)与解淀粉芽孢杆菌FZB42在氨基酸水平上相似性很高，这说明菌株BS-3可能有具有减少根部线虫的能力。
