CASA是什么检测人类精液检查与处理实验室手册第五版

artificialinseminationwithdonorsemenartificialinseminationwithhusbanamplitudeoflateralheaddisplacementanalysisofvariancealkalinephosphatase–anti-alkalinephoARARTN-benzoyl-L-arginineethylebeat-crossfrequencycomputer-aidedspermmorphometricongenitalbilateralabsenceofthevasdeferensclusterofdetermination46(acrosomalantigen)Dulbecco’sphosphate-bethylenediaminetetra-acgameteintrafallopianHanks’balancedsaltsolhumanchorionicgonadotrophhumanimmunodeficiencyhamsteroocytepenethorseradishperoxidintracytoplasmicspermlowerlimitofquantificationmeanangulardisplacemmultipleanomaliesinNAnumericalapertureNPpregnantmareserumgonadotrop-nitrophenolglucopyranosidePisumsativumagglutininteratozoospermiainstraight-line(rectili2.6.1应用伊红-苯胺黑的精子存活率试验2.7.2改良Neubauer血细胞计数板2.11.1在整个改良Neubauer血细胞计数板计2.14.3用于精子形态学分析的Shorr染色程序5.6HIV感染精液标本的制备A4.4Ham’sF-10培养液206附录6精液和宫颈黏液分析记录表格附录8精液分析的国家外部质量控制项目精子浓度测量值Youden图监视器上显示的镜台测微尺录像和覆盖在监方框7-2确定Xbar图的警戒限和处置限1且在提供另一种分析方法时，对其原理进行了解释。建议实验室发表研究结果差和获得准确数字结果的重要性。编辑委员会认为，每份射出精液的总精子数比精子浓度能更准确地评估睾丸功能，但是必须精确测量这份精液的间，因为任何精液参数的高值对生育力不可能是有害的。5%定为参考值的5和稀释，形成了精液。精液分成数段射出。比较输精管切除术前后的精液体积，阴道内。与此不同，在实验室环境场所中，全部的整份精液采集在一个容器里，精子是以前射精时存留的。这种情况影响了精液中精子老化程度和精子质量这些大量不可控制的易变因素解释了众所周知的精液成分个体内变异的原志愿者，采用WHO推荐的方法检测。对于解释精液分析的结果，注意这种变异（DatacourtesyofScheringPloughandBayel检测2～3份精液标本有助于获取基线数据（Polandetal.，1985；Bermanet30～60分钟：l标本容器应该保持在20～37℃环境中，以避免精子射入容器后，由于大的选择数份精子浓度高和活力好的精液标本，将每份标本的一半放在已知无毒性的容器2.2.3用于辅助生殖的精液无菌采集2.2.4用于微生物学分析的精液无菌采集注释：注释：从精液标本采集到开始在微生物学实验室进行检测的时间不能超过2.2.5在家采集精液l受检者应该记录获取精液的时间，并在采集后的1小时之内将标本送至实2.2.6使用避孕套采集精液l受检者应该记录获取精液的时间，并在采集后的1小时之内将标本送至实精液或许会丢失。此外，标本可能受到细胞和细菌的污2.2.7标本的安全处理病毒或者单纯疱疹病毒，因此应视为生物危险品处理。如果标本用于生物检测、或者进行精液培养（见2.2.4节处理标本过程中必须使用无菌物品和无菌技术。应该严格遵守附录2所列的安全指南，良好的实验室规范（goodlaboratory精液射到收集容器后很快呈现典型的半固体凝胶的团块。通常在室温下几2.精液反复（6～10次）缓慢地通过接在注射器上的18号钝性针头（内径2.3.3精液外观2.3.4精液体积 评述1：精液体积小是射精管阻塞或先天性双侧输精管缺如（CBAVDdela2.3.5精液pH值精液pH值反映了不同附性腺分泌液pH值之间的平衡，主要是碱性的精囊评述1：如果精液pH值<7.0，并伴随体积小和精子数量少，可能存在射精管精液的液化状态使得为精液分析而进行代表性取样成为问题。如果精液混当重复取样的结果一致时才能认可此测定值。应用Poisson分布来确定重复取样精子计数结果之间的一致性（方框2-7，表2-4和2-5应用二项分布确定百分率3因此，取10μl体积的精液置于一张洁净的载222.4.3精子聚集2.4.4精子凝集精子凝集特指活动精子以头对头、尾对尾或混合型相互黏附在一起的现象。2.4.5非精子细胞成分l比较两个重复样本值，核查两值的接近程度是否可以接受。如果可以接受，速度>25μm/s界定为a级。然而，技术人员很难无偏差地精确界定前向运动l为防止干燥影响观察精子活力的效果，应在距离盖玻片边缘至少5mm的区样本仍不能获得可接受的差异。在这种情况下，计算所有重复样如何确定所评估的百分率，不仅取决于计数到的精子数量（N还取决于一个真实的、但是未知的百分数（p二项分布）。如果百分率在20%～80%，大概的标准误（SE）是p（100-p/N。超出这个范围，更合适的方法是使用角转换（反正弦平方根z=sin-1（p/100带有一个1/66～76977～83884～88789～92693～95596～97498399235～650123～45～717～2324～34123456789对一个给出的平均百分率，如果重复百分率的差异小于或等于表2-1中列出的相对应要从精液中重新取样来制备新鲜的重复样本。对于评估精子形态学和用伊红-苯胺黑涂片2.5.3样例例2重复计数200个精子评估精子活力的结果为：前向运动是37%和2.5.4参考值下限评述2：活的但不活动的精子占有很大比例可能提示精子鞭毛有结构缺陷头更易辨别。也可以保存玻片用于再次评估和作为质量控制用途（Björndahlet2.6.1.3评定2.6.2.3评定3.如果很难分辨染成淡粉红色的精子头部，使用苯胺黑以提高背景的对比度2.6.3应用低渗膨胀的精子存活率试验2.6.3.3评定图2-6人精子在低渗透压作用下的特征性形态变化的示意图ofReproductionandFertility，70：219-228.®SocietyforReproductionandFertility每次射精的精子总数和精子浓度与妊娠时间（Slamaetal.，2002）和妊娠率 精液的精子总数可以通过精液评估中测定的精子浓度来计算。对于正常射因此精子总数可以衡量睾丸产生精子的能力和男性输精管道畅通的程度。精液中精子浓度与受精率和妊娠率相关，精子浓度受精囊腺和前列腺分泌液量的影响一次性计数板得出的结果可能与改良的Neubauer计数板的结果不同。计数板的浅池是借助毛细作用填充液体，由于液体流动可能使精子分布不均匀（Douglas-改良Neubauer血细胞计数板有两个独立的计数池，每个计数池有一个刻在盖在网格上，由计数池突起0.1mm的玻璃柱支撑着。每个计数区域划分为9个2.7.3使用血细胞计数板网格2.7.4计数板的保养2.7.5稀释精液的固定液2.7.6计数足够精子的重要性评估精子数的精确性取决于所数的精子数目。在Poisson分布中，计数的标准误（SE） 注释：这些数值只是近似值，因为围绕估值，可信区间不总是对称的。根据就会显著降低。如果每个重复样本计数的精子数目<200个，按照表2-2所给252030354045505560657075801270.7357.7450544.7640.8737.8835.4933.331.625.82022.48590958.22002506.33005.83505.340054504.75004.5在这种情况下，r=250μm，r²=62500μm2，τr²=19637如果显微镜物镜为20倍，10倍目镜孔径为20mm目镜，每个视野直径约为1000μm >40450950改良Neubauer血细64～40050200改良Neubauer血细8～605050改良Neubauer血细<2<85050改良Neubauer血细胞计数板或大容积所有9个网格l缓慢按下移液器的活塞，利用毛细作用使精液填满计数池。在填充过程中，注释1：一些计数池具有磨砂玻璃柱，在这种情况下，就见不到Newton环。在每个磨砂玻璃柱上加上1.5µl水，可使盖玻片保持在位置上（Braziletal.，2.8.3评估计数池内的精子数目应该评估血细胞计数板的两个计数池内的精子数目。如果两个计数池得出l首先评估改良Neubauer血细胞计数板一侧计数池的中央网格（图2-7，第5表2-4对于一定总数的两个重复计数可接受的差异2425262728212～22629227～24230243～25831259～27432275～29233293～30934310～32835329～34636347～36637367～38538386～40639407～42640427～44841449～47042471～49243493～51544516～53845539～56246563～58747此，在95%可信区间内N1-N2）/N1+N2的随机误差应该<1.96。2.8.4计算精液中精子浓度建议计算并报告精液中精子浓度。尽管精液中精子浓度不是衡量睾丸功能2.8.5样例两者之差为245-201=44。根据表2-4可以看到超出预期随机误差（41所以需/两者之差为268-224=44。根据表2-4可以看出超出预期随机误差（43所以需两者之差为224-213=11。根据表2-4可/2.8.6精子浓度的参考值下限2.8.7计算每次射出精液的精子总数液里没有精子，而不是指睾丸没有生成精子或作为诊断和治疗的依据。目前普遍接受的是无精子症这一术语仅可使用于离心后精液标本沉淀物中没有发现精子这些标本的处理方法主要取决于精子存在和精子活力的主观数据是否足够l顺序地逐个视野观察整个盖玻片区域。观察时，从盖玻片的一角开始，沿x轴观察到盖玻片的对侧；然后沿y轴下移一个视野，并在沿x轴观察同样2.10.3检测非离心标本中活动精子数目l顺序地逐个视野观察整个盖玻片区域。观察时，从盖玻片的一角开始，沿x轴观察到盖玻片的对侧；然后沿y轴下移一个视野，并在沿x轴观察同样本节叙述的是不离心而确定低精子浓度的方法。另一种离心沉淀精子的方精子浓度，取样误差为20%。如果计数所有9个网格，可以估计出低至27800精如这里建议的，这些值分别相当于500000精子/ml、55600精子/ml和2000精子/ml的未稀释精液的精子浓度。然而，精液稀释倍数这么低会使背景较重。仔如果在最初湿片每4nl高倍镜视野中有2个精子，那么从理论上改良Neubauer计数池的全部9个网格容积为900nl，将会有450个精子。按建议1:2误差。35～4024329～3463641～4725347～3663748～5426367～3853855～6227386～4063963～7028407～4264071～79212～22629427～4484180～89227～24230449～4704290～98243～25831471～4924320259～27432493～5154421275～29233516～5384522293～30934539～5624623310～32835563～587472.11.1.2精液中低精子浓度的计算如果每个计数池观察到的精子少于25个，精子浓度就<56000精子/ml；当2.11.1.4样例子，而重复样本2中在2个网格内观察到250个精子。4个网格中精子总数为200+250=450，两者之差为250-200=50。根据表2-5可以看出超出预期随机误例2稀释倍数是1:2（1+1重复样本1在3个网格内观察到210个精子，而重复样本2中3个网格内观察到200个精子。6个网格中精子总数为210+200=410，两者之差为210-200=10。根据表2-5可以看出小于预期随机误2.11.1.5每次射精的精子总数的计算推荐计算和报告每次射精的精子总数，因为这一参数可以评价睾丸产生精子的能力和男性输精管道的通畅性。精子浓度乘以整份精液体积可以得出精子利用大容量、100μm深的计数池可以提方框2-12在100µm深的大容量一次性计数板上，每个重低取样误差。6.顺序地逐个视野观察整个盖玻片区域。观察时，从盖玻片的一角开始，沿x2.11.2.2精液中低精子浓度的计算如果显微镜物镜是40倍、10倍目镜的孔径为20mm，每个视野直径约为500μm2=62500μm23或大约20nl。如果显微镜物镜是25倍、10倍目镜的孔径为25mm，每个视野直径约为1000μm2=250000μm22=785500μm23或约80nl。如果每个计数池观察到的精子数目少于200个，取样误差将超过5%。如果2.11.2.4样例而重复样本2在300个视野内观察到300个精子。600个视野内计数的精子总数而重复样本2在400个视野内观察到230个精子。800个视野内计数的精子总数而重复样本2中的整个计数池内观察到70个精子。两个重复样本中计数的精子如果稀释倍数是1:2（1+1并且检测了两个计数池的整个区域（总容积而重复样本2在整个计数池内观察到18个精子。由于所计数到的精子总数少于2.11.2.5每次射精精子总数的计算2.12.3样例计数200个精子观察到39个圆细胞。两份样本圆细胞数目之和为21+39=60，例2重复样本1中每200个精子观察到24个圆细胞，而重复样本2在每染色的精子。可以观察到这些精子几乎没有头部、中段或主段的缺陷。尾部可能有弯曲但没有呈锐利 后有意义。和不育的正常形态精子百分率的范围大致为0～30%，很少有精液标本的正常形2.13.2.2精子浓度低的标本2.13.2.3黏稠的精液标本2.13.2.4对于碎片多或黏稠的精液标本，以及为计算机辅助评估精子形态EA-50便必要时再次评估，而且可以用于内质量控制。已封片的涂片干燥后的折射率（RI1.50~已证明这种改良染色技术适用于分析精子形态学和检查未成熟生精细胞和非精2.14.2.4封片前对已染色精液涂片的处理l使用不溶于乙醇的封片剂，将涂片从上述染色程序的第19步直接进入到以2.14.3用于精子形态学分析的Shorr染色程序7.Shorr溶液3～5分钟2.14.4精子形态的快速染色程序快速染色方法对于需要当天提供分析结果的临床实验室尤为适用。有几种注释2：如果涂片的背景染色很深，应取一定量的该精液标本进行洗涤（见2.13.2.4节制备新涂片并染色。洗涤标本可能影响精子形态，必须记录下洗片的载玻片或盖玻片之间时，可以获得更清晰的图像。这种液体通常是一种浸油录异常形态精子的异常部位。在评估精子正常形态时，应采用以下的严格标准2%～7%得到以下数据：长度的中位数为4.1μm，95%可信限区间为3.7~人类精液标本中含有各种各样畸形的精子。精子异常发生和一些附睾的病表2-6精子形态学彩图中注释的解释顶体<40%顶体区小于精子头部的40%退化的精子细胞显而易见的异常上皮细胞来自男性泌尿生殖管道插入尾部插入头部长轴的一侧的位置正常类似在宫颈黏液中观察到的精子vac1ifPPOK2ifPPOK3ifPPOK4ifPPOK5ifPPOK6ifPPOK7ifPPOK8ifPPOK9ifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOK20ifPPOK1粗2345678粗9粗20粗21粗222324粗2526粗27粗28粗29粗30粗31粗32粗33粗3435粗36粗彩图31粗2345678粗9粗————粗粗20212223242526272829303132粗33粗34顶体区<40%粗3536彩图41粗23粗45粗6粗78粗9粗粗顶体区<40%20顶体区<40%12345粗6789粗彩图61顶体区<40%粗2粗34粗567粗89顶体区<40%粗粗顶体区<40%粗20ifPPOK212223粗24粗25262712vac23粗45ifPPOK6粗78<1/39ifPPOK顶体区<40%粗顶体区<40%ifPPOK粗短20粗212223242526272829303132ifPPOK3334ifPPOK35粗36ifPPOK37ifPPOK3839404142粗43顶体区<40%4445464748ifPPOK123456ifPPOK7ifPPOK8粗9ifPPOKifPPOK20212223粗242526粗27粗28293031123顶体区<40%4ifPPOK5ifPPOK6789粗ifPPOK粗20212223242526ifPPOK2728ifPPOK293031ifPPOK32ifPPOK33ifPPOK34粗3536顶体区<40%3712ifPPOK345粗67893vacifPPOK20ifPPOK2122ifPPOK23粗24252627粗28粗2930粗31粗32粗333435粗36顶体区<40%37粗38ifPPOK39粗40顶体区<40%41粗42ifPPOK43444546粗123粗45粗6789粗顶体区<40%粗粗粗20212223242526272829303132331234ifPPOK5粗67粗89粗粗20粗21222324252627粗28ifPPOK29303132333435363738彩图131234567892021222324彩定正常精子的比例可能已足够了。应用精子形态评估的示范图片来考虑例1重复计数200个精子，正常形态精子百分率分别为182.17.3参考值下限2.17.4异常精子形态的评估对所有异常形态精子进行分类，可能对诊断或研究工作是有益的。如果需l通过对400个精子的分析，可以得到正常和异常精子百分率（两者相加应等2.17.5样例2.17.6特定精子缺陷的评估大多数人精液中存在白细胞，主要是多形核白细胞（PMN，中性粒细胞）白细胞与精液涂片的精子细胞和精母细胞区分开来（见2.14.2节）。分辨白细胞主要基于着色、核的大小及形态的不同（Johanissonetal.，2000附彩图6、10、 大小也有助于鉴别：单核白细胞核大小的波动范围较大，从大约7μm的淋巴细胞，到大于15μm的巨噬细胞。这些大小仅作为参考，因为退化和分裂会影响核的大小。还有几种技术可以定量测出精液中白细胞的数目。由于过氧化物酶阳性的另外，可通过更耗时和更耗资的针对普通白细胞抗原和精子抗原的免疫细计数人精液中白细胞的传统方法是用组织化学方法鉴定粒细胞特有的过这项试验可用于鉴别多形核白细胞与不含过氧化物酶的多核精子细胞基础。此试验已有商品化的试剂盒。2.18.1.2试剂442O22.18.1.4在血细胞计数板上检测过氧化物酶阳性细胞的数目8.转换至血细胞计数板的第二个计数池，计数与第一个计数池相同的网格数，2.18.1.5精液中过氧化物酶阳性细胞浓度的计算细胞/nl。2.18.1.6方法的灵敏度如果计数池中的过氧化物酶阳性细胞数少于200个，取样误差将超过5%。如果每个计数池中所计数的过氧化物酶阳性细胞数少于25个，浓度将2.18.1.7样例应报告为“样本中未见过氧化物酶阳性细胞。细胞数过少，不能准确测定浓度2.18.1.8参考值目前还没有来自有生育力男性精液中过氧化物酶阳性细胞的参考范围。在白细胞浓度0.5×106到1.0×106/ml或总的白细胞浓度从1×106到2×106/ml精液中的抗精子抗体（ASAs）几乎都是属于两类免疫球蛋白：IgA和IgG。IgM抗体由于其分子量较大，在精液中极少发现。IgA抗体可能比IgG抗体更具的结果与检测血清抗体的制动试验的结果相关性很好。IB试验和MAR试验的实验方案有些不同，但这两种试验的精子/微珠制备均在显微镜下检查。微珠黏附于带有表面结合抗体的活动和不活动精子上；记录黏附有微珠活动精子的百液中未洗涤精子表面露出的IgG或IgA相接触。直接IgG和IgA的MAR试验，精子抗体阴性精液玻片作为对照。对照精液应该分别从先前直接MAR1次。2.20.1.2评分这项试验的目的是测定黏附有微珠的活动精子的百分率。出现的一个普遍1.仅评定活动精子和测定黏附有2个或2个以上乳胶颗粒的活动精子的百分率。2.为了获得可接受的低取样误差（方框2-5每次重复测试至少评价200个活2.20.1.3参考值球蛋白的微珠直接与洗涤过的精子相混合。带有抗人IgG或IgA的微珠结合到2.20.2.3制备精子6/ml>50 0.221～50>400.421～50<40>100.810～20>4010～20<40>102.0<10>5>2.0每次试验应该包括抗精子抗体阳性精子和抗精子抗体阴性精子作为对照。2.准备2张载玻片，分别滴上5μl抗精子抗体目前尚没有来自有生育力男性精液的IB试验结合抗体精子的参考值。在等2.20.3间接免疫珠试验2.20.3.3制备供者精子4.在每次间接试验中，包括已知阳性和阴性的标本用作每次间接试验的对照。例如，从带有和不带有抗精子抗体的男性中分别取得的血清，先前用间接免疫珠实验检测过这些血清。已经结扎输精管的男性，血清如果阳性可以2.20.3.6免疫珠试验4.003.00200200200464646232323284212545252544646392266324C/BD/BD/A2.55主段缺陷，44个有过多残留胞浆。重复样本2的结果是：3有主段缺陷，36个有过多残留胞浆。为了得出TZI，将所检出的缺陷总数（140+即TZI=604/322=1.88。表3-2显示就诊临床不育门诊的男性以及近3年内生育1个孩子的男性的TZI2TZI20.370.30.20.23.92.642.382.075TZI2TZI2255075902.44952.65N4930994胞、巨噬细胞或单核细胞，不能应用检测细胞过氧化物酶的邻甲苯胺实验来评估单克隆抗体来检测CD45。如果对它们感兴趣的话，可以通过改变第一抗体的种t3.2.3步骤2.空气干燥的细胞在纯丙酮中固定10分钟，或者在丙酮/甲醇/甲2.用苏木精复染几秒钟；自来水沖洗，并用水性封固液封片（见2.14.2.4和1.用亮视野以200或400放大倍数检查整个已染色区域。CD45阳性细胞（白5.计算2张涂片CD45阳性细胞数的总数和差异。3.2.3.6精液中CD45阳性细胞浓度的计算计算CD45阳性细胞的浓度与玻片上的精子浓度相关。如果N表示在同样如果标本中CD45阳性细胞数目比精子少（例如，<400取样误差会3.2.3.8样例3.2.3.9参考值目前没有源自生育力男性精液的CD45阳性细胞的性交后试验的目的是测定宫颈黏液中的活动精子数目，以及评估性交几小3.3.1.3对夫妇的指导宫颈管下部的精子数目取决于性交后的时间长度。性交后约2～3小时，宫每个显微视野中的黏液体积取决于视野的面积(τr2，τ约为3.142，r是显微镜视野的用目镜孔直径除以物镜放大倍数来估算。例如，40倍物镜、10倍目镜的孔直径是20mm，那么显微镜视野的直径约为500μm（20mm/40计数细胞的总数少，取样误差会高。报告从表2-2给出的10个精子的取样误差3.3.1.7PR=前向运动精子；IM=不活动精子。性交后9～14小时子宫颈内黏液中存在任何快速前向运动精子，可以排除评述2：试验阴性可以由选择实验时间不正确所致。对有生育力的妇女来说，在月经周期内过早或过迟进行试验也会出现阴性结果。有些妇女可能在整个评述1：可以从预约进行人工授精或辅助生育取卵的月经中期妇女获得供者宫颈黏液。应在自然周期或使用促性腺激素诱发排卵周期的授精前采集宫颈l体外实验应在采集精液后1小时内进行，以防止脱水或温度变化影响精液如果在宫颈管内测试pH值，应注意方法正确，因为宫颈管外的宫颈黏液pH值通常低于宫颈管内。还须注意避免阴道分泌物的污染，因为它的pHl精子对宫颈黏液pH值的变化甚为敏感。酸性宫颈黏液可使精子制动，而碱性宫颈黏液可提高精子活力。宫颈黏液碱性过强（pH>8.5）对精子存活有不利的影响。在宫颈黏液中精子移动和存活的最适pH值是7.0～8.5，这也是月经中期正常宫颈黏液的pH值范围。虽然pH值为6.0～7.0的宫颈黏液可容许精子穿透，但pH值低于6.5常抑制精子活力。如果宫颈黏液的3.3.3体外简化玻片试验3.3.3.2观察精浆，但大多数精子向宫颈黏液纵深移动，直至遇到细胞碎片或白细胞的3.3.3.3解释1.正常结果：精子穿透入宫颈黏液相，并且>90%精子具有明确的前向运动。②精子没有穿透入精液-宫颈黏液的分界面。指状突起可能形成或尚未形3.3.4毛细管试验7.将穿透计放回37℃孵箱，24小时后再次检查毛细管内前向运动精子的存在3.3.4.3观察表3-3精子穿透密度的等级顺序精子平均数/LPF010～52311～20421～50567例1在1cm处的穿透密度是51～100/LPF，在4.5cm处的穿透密度是6~例2在1cm处的穿透密度是21～50/LPF，在4.5cm处的穿透密度是51~3.3.4.4解释表3-4毛细管试验结果的分级顺序数的减少）10——<3或或>3或2差4.5和>50和<3和>24好虽然有时感染能引起这些标志物的分泌减少，但标志物的总量仍可以在正常值范围内。感染也能造成分泌上皮不可逆的损伤，以致治疗后分泌能力仍然低而且这些标志物之间存在很好的相关性。3.4.1节叙述了锌的分光光度检l精囊腺的分泌能力。精液中果糖反映精囊腺功能。3.4.2节介绍了检测果糖3.4.1.2原理锌结合，产生颜色变化。3.4.1.3试剂浆于-20℃待分析。去精子的精浆标本可与其他精浆标本混合在一起，为将3.4.1.5计算4.重复样本测定结果的一致性应在10%之内。即两个估计值之差除以估值3.4.1.6参考下限值3.4.2.2原理3.4.2.3试剂3.显色剂（16μmol/L苯甲酸固定液含2μmol/L吲哚溶解200mg苯甲酸于5.标准曲线：将2.24mmol/L果糖标准液加纯水稀释，得到另外4个标准液：浆于-20℃待分析。去精子的精浆标本可与其他精浆标本混合在一起，为将3.4.2.5计算4.重复样本测定结果的一致性应在10%之内。即两个估计均值之差除以估3.4.2.6参考下限值3.4.3精浆中性α-葡糖苷酶的测定3.4.3.2原理 Na2CO33.4.3.3试剂检测精液中附睾中性α-葡糖苷酶含量有商品化试剂盒。建议使用含SDS和castanospermine的试剂盒测定精液中附睾中性α-葡糖苷酶。替代的方法是准备浆于-20℃,待分析。去精子的精浆标本可与其他精浆标本混合在一起，为3.用正向置换式移液器重复取15μl精浆标本分别加入2个1.5ml试管中。包3.4.3.5计算5.2份重复测定结果的一致性应在10%之内。例如或两个估计值之差除以3.4.3.6参考值中性α-葡糖苷酶的参考下限值是每次射精20mU（Cooperetal.，1991and的应用，使得精子浓度以及前向活动精子浓度的测定成为可能（Zinamanetal.，一些还能够检测精子的浓度。有几种产品还有半自动化的形态学分析模块。用在使用CASA分析仪检测精子运动参数时，每份标本至少要分析200个活CASA分析仪应当链接到那些能进行数据整合和统计学分析的计算机软件。3.5.2.2标本的制备每个计数池检测6个视野（一共12个视野）通常可以得到可靠的结果。每个计数池至少需检测200个精子。采用2.5.2节中相同的质量控制原则，用于精子活3.5.2.3CASA术语动的时均速率。平均路径是根据CASA仪器的算法将实际的曲线轨迹平滑3.5.3CASA用于评估精子浓度虽然使用DNA荧光染色，CASA分析仪可以精确地测定活动精子浓度和精3.5.4计算机辅助精子形态学计量分析优于由熟练操作人员所做的人工评估。然而，方法学上的不一致如聚焦、照明、分精子头部和精液碎片的技术难度（尤其是精子浓度很低时Garrett&Baker，两项研究已经报道了CASMA结果与生育力评价的终点指标之间的显著相子功能调控的分子机制的深入了解，有助于发展新的精子功能诊断方法。例如，最近的数据强调了精子核DNA致密化及其完整性对于人精子功能的重要性，该数据受到关注，一些报道也提示了精子核DNA完整性及染色质的组装与生育力与之类似，调控精子功能的信号传导通路方面的研究进展，对于发展精子功能诊断方法，阐明不育男性精子异常的具体机制，也有着极其重要的意义。为研究导致男性不育深层次的生物学基础，已经开发了一系列的功能试验，以融合等。氧化亚氮等。过高浓度的活性氧可以诱导细胞的脂类、蛋白和DNA氧化损伤，维生素E当精子中的抗氧化系统被破坏，精子功能就会受损（Agarwaletal.，的信号是白细胞特异性的。可用含已知数量的多形核白细胞悬液来校准数据4.1.2.2试剂A4.5节。13.将配制的悬液冻存于-20℃待用。4.1.2.4检测自发产生的活性氧4.1.2.5FMLP诱导白细胞产生活性氧（a）在有白细胞污染时，加入白细胞特异性探针FMLP后，产生一个尖锐的活性氧信号峰。再加入Aitken）4.1.2.6酵母多糖诱导白细胞产生活性氧4.1.2.7PMA刺激白细胞和精子产生活性氧4.2人精子-卵母细胞相互作用试验受精失败的没有活性和未受精的人卵母细胞。这些试验可使用盐溶液中储存的精子结合卵透明带后，在卵透明带上发生生理性顶体反应。所以，可用从卵透明带表面取下的精子，或用人卵透明带分离出的蛋白处理精子，来检测卵透子症和少精子症的患者中，尽管一些患者的精液分析结果可能正常，但其精子在卵透明带诱发顶体反应方面存在缺陷，或者是能与卵透明带结合，但顶体反应较由于精子与卵透明带结合的种属特异性，也不可用其他灵长类的卵透明带替代 分装，冻存于-20℃。4.4.1.4精子涂片制备1.顶体完整（acrosome-intact，AI精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀顶体反应发生在精子与卵透明带结合之后的胞吐过程。且在精子穿透卵母4.4.2.4质量控制生顶体反应。由于体外孵育不及生物学过程有效，而且可能涉及多种不同机随着精子-卵透明带的相互作用，启动顶体反应的两个关键细胞内信号是钙流入和胞浆碱化作用。这两种细胞内信号均可用二价阳离子载体人工产生膜促性腺激素（hCG）溶液。小瓶分装。使用前储存在-20℃。在性未成熟仓鼠悬液散在滴布于小的Petri培养皿中。用一支一次性塑料吸管，吸取经CO25.测定精子团中的精子浓度（见2.7和2.8节用新鲜BWW液稀释为5×1067.用镊子夹住子宫角最远的部分，紧贴着镊子下方剪断子宫末端。剪下卵巢，2平衡的BWW液。3.用火焰烧拉制成的玻璃移液管（方框4-2从透明质酸酶液中转移已分离出7.37℃预热分离出的卵母细胞，将卵母细胞移入精子悬液中。另一种方法在Bunsen火焰灯上方转动玻璃毛细管或巴氏移液管，用双手分别持着玻璃管的两端，7.记录至少有1个精子穿透的卵母细胞百分率。记录穿透每个卵母细胞的精图4-4含有人精子的去卵透明带仓鼠卵母细胞的相差显微镜照片宽箭头指示胞浆中解凝聚的精子头；窄箭头指示在卵母细胞表面未穿透的精子Media］4.5.1.9质量控制或流式细胞仪检测。较新的方法包括DNA链断裂的检测，例如脱氧核糖核苷酸间。当精子数目极低时，可能需要改变离心力和离心时间，以尽可能回收精子。对推荐的离心力和离心时间做出改变时，需要经严格的实验论证才可临床应用。5.1.3将精子与精浆和感染性微生物分离的效率染的水平也不同。用前列腺分泌的锌作为可溶性的精浆成分标志物，Björndahl等液中锌的浓度比密度梯度法高。2，培养液最好以碳酸氢钠或类似成分作为缓冲系4.血清的用量：46ml培养液中添加4ml热灭活（56℃20分钟）的患者血清，利用精子从精液上游到培养液中的能力来优选精子，这种方法称为“上游由于是依靠精子的活力进行的优选，因此适合于精液中活动精子百分率低的情4.血清的用量：46ml培养液中添加4ml热灭活（56℃20分钟）的患者血清，非连续密度梯度法能很好地将精子和其他细胞及碎片分开，是分离高质量这种方法是将精液放置于由硅烷包被的胶体二氧化硅构成的密度梯度液的在管底形成一个松软的沉淀团。应用最广泛的是一种简单的两步法非连续密度4.血清的用量：46ml培养液中添加4ml热灭活（56℃20分钟）的患者血清，一般而言，附睾穿刺取精的适应证是梗阻性无精子症而非睾丸生精功能低睾丸精子可用开放式活检或经皮穿刺活检来获取。睾丸精液标本不可避免分离附着在精曲小管上的长形精子细胞（睾丸精子需要采用酶学或机械方1.将睾丸组织与胶原酶孵育（如每毫升培养液含0.8mg的1A型溶组织梭菌）5.7.3处理精子悬液用于ICSI射出的精液和尿液都应该进行分析。由于尿液体积大，需要离心浓缩标本精子免受冷冻损伤，由此开始了应用-79℃干冰冻存人精子（Polgeetal.，1949；性精子库或协调性国家服务机构的建立，精液冷冻保存在很多国家得以迅速发展人精子可以耐受一定范围内的冷冻和解冻速率。精子对初始阶段迅速降温（冷休克）引起的损害不很敏感，可能缘于脂质双层不饱和脂肪酸膜的高流动性更能耐受冷冻保存造成的损伤。然而，冷冻保存确实对人精子功能有不良效应，储存已知或假定有生育力的健康供精者的精液以备将来使用。临床或精子库可以招募供精者，并且匿名使用他们的精子。接受精液捐赠者也可选择了解供精者的情况。供精者l对没有活精子或没有适合做ICSI的长形精子细胞的不育男性，或是在治疗失败或不能应该遵循国家及地方有关遗传基因筛查和传染性疾当男性暴露于可能导致生育力受损的有害因素或进行某种可能损害其生育力的治疗之几种现成的精子冷冻及精子库管理方案可以采用（Mortimer，2004；Wolf，6.2.1.2将冷冻保护剂加入精液1.0.5ml塑料麦管由于其热传导性能好和易于储存而比较常用，塑料冷冻小瓶2.将精液-GEYC的混合液吸入0.5ml塑料麦管或装入冷冻小瓶。可在麦管上6.2.1.4精液麦管的密封6.2.1.5使用程控冷冻仪冷却和冷冻精液分钟降温6℃直到-100℃。整个过程大约需要40分钟。仪器冷冻室温度在6.2.1.6精液的人工降温和冷冻1.把麦管置于冰箱冷冻室（-20℃)中30分钟，然后放入干冰（-79℃)上30分小液氮罐颈部液氮蒸气与空气的混合气中，温度-80℃~-100℃,放置15分6.2.1.7