crp仪是什么【试剂与仪器】全血C反应蛋白检测系统性能评价的多中心研究

对象与方法

一、材料

1. 标本采集：收集2019年3—4月全国26家三级甲等妇幼保健院和儿童医院检验科的静脉血样本（EDTA-K₂·2H₂O 1.5~2.2 mg/ml）共7 540份。

2. 仪器和试剂：检测系统迈瑞BC-5390CRP全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）及原装配套试剂（批号2018110701），原理为乳胶增强免疫比浊法。国赛Astep PLUS特定蛋白分析仪（深圳市国赛生物技术有限公司）及原装配套试剂（批号0651200102），原理为散射免疫比浊法。奥普OTTOMAN-1000全自动特定蛋白分析仪（上海奥普生物医药有限公司）及原装配套试剂（批号20181108），原理为乳胶增强免疫比浊法。i-CHROMA Reader免疫分析仪（韩国Boditech MED公司）及原装配套试剂（批号CAOXY08A），原理为免疫荧光干式定量法。Orion QuikRead go检测系统（芬兰Orion诊断公司）及原装配套试剂（批号JY16），原理为干化学免疫速率法。以上5种全血CRP检测系统以a、b、c、d、e随机顺序代表。比对仪器为西门子BNⅡ或BN Pro特定蛋白分析仪（德国西门子公司）及原装配套试剂（批号16573C），原理为散射免疫比浊法。

3. 干扰物：英脱利匹特脂肪乳注射液，购于费森尤斯卡比华瑞制药有限公司（批号80LL097），二牛磺酸胆红素钠盐/缀合胆红素购自Frontier Scientific公司（批号190911 JH18-12398）。

4. 正确度验证样品：赋值为12.89 mg/L和30.60 mg/L的CRP正确度能力验证样品由上海市临床检验中心提供。

二、方法

1. 空白测定：使用样本稀释液作为标本在分析仪上连续检测3次，记录3次检验结果的最大值。

2. 携带污染：参考CLSI H26-A2携带污染率评估方法，选取高值CRP全血样本（CRP>80 mg/L）和低值CRP全血样本（CRP<10 mg/L），在待测仪器上连续测定3次高值样本后再连续测定3次低值样本，计算携带污染率^［5］。

3. 重复性：参考中华人民共和国医药卫生行业标准《YY/T1513-2017 C反应蛋白测定试剂盒》中重复性检测方法，选取CRP<10、10~30和>30 mg/L EDTA-K₂抗凝全血样本各10份，每例样本在待测仪器上连续进行10次测试，计算各浓度范围的标准差（standard deviation，SD）和变异系数（CV）^［6］。

4. 中间精密度：（1）方法1参考CLSI EP15-A2精密度评估方法，每天将高低2个水平的质控物质进行3次测试，连续5 d，根据测试结果统计中间精密度^［7］。（2）方法2参考CLSI EP5-A3精密度评估方法，每天上午将每个水平的质控物质进行2次测试，作为第1批测试的结果^［8］。至少间隔2 h，再用每个水平的质控物进行2次测试，作为第2批测试的结果。在2批测试之间，至少测定10例患者样本，连续20 d。如果有任何一次质控结果超出偏差限，调查原因并纠正，质控在允许范围内方可进行精密度评估测试，根据测试结果统计中间精密度。

5. 线性范围：参考《WS/T420-2013 临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》线性评估方法，用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，稀释成7个不同浓度梯度样本（100%、80%、60%、40%、20%、10%和0）^［9］。每个稀释浓度测试3次，采用CLSI EP6-A进行线性统计^［10］。CRP线性较宽，分3段进行线性测试及统计，分别为0.2~10.0、10.1~100.0和100.1~320.0 mg/L。

6. 样本稳定性：参考国际血液标准化委员会2014血细胞分析仪评价指南，选择20例新鲜抗凝静脉全血样本（其中10例CRP<10 mg/L，5例CRP 10~50 mg/L，3例CRP 50~100 mg/L，2例CRP>100 mg/L），每例样本不少于2 ml，将每份样本分成13等份，每等份约150 μl置于不同EP管中，第1等份样本管在采集后0.5 h测定2次，其余的12份分成2组，每组6等份分别保存在室温（18~25 ℃）、冷藏（2~8 ℃）^［11］。分别在4、8、24、48和72 h拿出各例样本1等份测定2次，其中冷藏环境下的样本需要恢复到室温后检测。以0.5 h检测结果为对照，计算各参数随时间变化的情况，用相对偏差来表示。

7. 血细胞比容（Hct）对全血CRP检测结果的影响：选取CRP>30.00 mg/L的样本，800 g离心10 min，离心后将上层血浆吸出，测定下层Hct结果在70%~75%，总计选取 10份样本。每份样本以上层血浆为Hct低值样本，离心后下层样本为Hct高值样本，将两者按比例配置，得到高值样本体积占比分别为10%、20%、40%、60%、80%和100%的6个Hct浓度点，每个浓度点测定2次CRP。计算不同浓度Hct样本CRP检测结果与40%浓度点相对偏差。

8. 甘油三酯（triglyceride，TG）对全血CRP检测结果的干扰：采用医用脂肪乳标本配置5个系列不同浓度干扰物（100%、80%、60%、40%和20%），其中最高浓度TG在19.00 mmol/L左右。随机选取EDTA-K₂抗凝血15份（每份不少于2 ml），分成5组，每组3例。将所有样本平均分成2份，其中第1份加入50 μl生理盐水，第2份加入50 μl不同浓度的医用脂肪乳样本，所有样本均检测3次CRP，对比各样本第2份与第1份CRP结果的相对偏差。

9. 胆红素对全血CRP检测结果的干扰：采用商品化胆红素样本配置5个系列不同浓度干扰物（100%、80%、60%、40%和20%），其中胆红素最高浓度在432.00 μmol/L左右。随机选取EDTA-K₂抗凝血15份（每份不少于2 ml），总共分成5组，每组3例。将所有样本平均分成2份，其中第1份加入50 μl生理盐水，第2份加入50 μl不同浓度的胆红素样本，所有样本均检测3次，对比各样本第2份与第1份CRP结果的相对偏差。

10. 全血CRP检测结果与西门子BNⅡ或BN Pro特定蛋白分析仪测定的血清或血浆CRP检测结果的可比性：选取不少于200例患儿同时采集的EDTA-K₂抗凝全血和血清样本，要求样本包含高低值白细胞计数样本、高低值红细胞计数样本、高低值血小板计数样本，CRP<10.00、10.00~100.00和>100.00 mg/L样本占比分别为50%、30%和20%。每份全血样本在待比对仪器上进行2次测试，对应血清样本在西门子BNⅡ或BN Pro特定蛋白分析仪上进行2次测试。计算待比对仪器与西门子BNⅡ或BN Pro特定蛋白分析仪的相关系数（r）。

11. 正确度验证：参考《WS/T 492 2016临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》^［12］标准进行正确度验证，将赋值为12.89和30.60 mg/L的2个浓度水平（可报告范围内）的CRP血清样本，在不同仪器上进行测定，连续5 d，每份定值标本每天测定2次^［13］。分别计算各仪器的测定均值、偏移值，如果实验室正确度验证物质测量偏移值≤正确度验证物质赋值的不确定度，则验证通过，无需计算验证区间；如果实验室正确度验证物质测量偏移值>正确度验证物质赋值的不确定度，则需计算此偏移值的验证区间并将其与赋值比较，如赋值在验证区间内，则验证通过，如赋值超出验证区间，则验证不通过。

三、统计学分析

采用Excel2007和Medcalc15.6软件进行数据分析，仪器比对实验采用Passing-Bablok回归分析，回归方式以y=a+bx表示，同时计算截距a和斜率b的95%可信区间（confidence interval， CI）。

结果

一、空白测定

5种检测系统空白测定结果均满足厂家说明书要求，最大值为0.80 mg/L，最小值为0.15 mg/L。

二、携带污染

除i-CHROMA Reader免疫分析仪、Orion QuikRead go检测系统携带污染不适用外，其他3种检测系统携带污染最大值分别为0.28%、0.26%和0.12%。

三、重复性

CRP浓度在3.00~10.00 mg/L范围时，>97%的样本CV<10.00%。CRP浓度在10.00~30.00 mg/L范围时，>98%的样本CV<6.00%。CRP浓度>30.00 mg/L时，>98%的样本CV<5.00%（图1）。

图1 5种检测系统CRP不同浓度水平的重复性

四、中间精密度

参与实验的医院可选择EP15-A2及EP5-A3方案。采用EP15-A2方案各医院精密度结果见表1。采用EP5-A3方案各医院精密度结果见表2。5种全血CRP检测系统中间（室内）精密度均<10.00%。

五、线性范围

参与评估的全血CRP检测系统线性理论值及实测值的r均>0.975，斜率在0.950~1.050。5种检测系统在CRP低值、中值和高值段检测结果见表3。

六、样本稳定性

样本在室温（18~25 ℃）或低温（2~8 ℃）保存72 h内全血CRP检测结果仍能保持稳定，相对偏差均在10%以内（表4）。

七、Hct对全血CRP检测结果的影响

在有Hct修正功能的全血CRP检测系统上进行检测时检测结果差异不明显，标本相对偏差均<10.00%；无Hct修正功能的全血CRP检测系统检测结果受不同浓度Hct影响较大，Hct不同稀释浓度点与40%稀释浓度点相比相对偏差最高可达67.48%（表5）。

八、TG对全血CRP检测结果的干扰

高TG水平对免疫比浊法及免疫荧光干式定量法CRP检测影响不大，TG水平在<15.46 mmol/L时，以上检测方法的检测设备加入不同浓度TG与未加入TG的样本进行比较，偏差均在10.00%以内；TG水平达19.33 mmol/L时，检测设备偏差在15.00%以内。高TG水平对干化学免疫速率法CRP检测结果的影响较大，与未加入TG样本比较，其偏差可高达26.32%（表6）。

九、胆红素对全血CRP检测结果的干扰

高胆红素水平对免疫比浊法及免疫荧光干式定量法CRP检测影响不大，在总胆红素水平<345.47 μmol/L时，以上的检测设备加入不同浓度胆红素与未加入胆红素的样本进行比较，偏差均在10.00%以内，在总胆红素水平达431.84 mol/L时，检测结果偏差在15.00%以内。高胆红素水平对干化学免疫速率法CRP检测结果的影响较大，与未加入胆红素样本比较，其偏差可高达15.52%（表7）。

十、全血CRP检测结果与西门子特定蛋白仪测定的血清或血浆CRP检测结果的可比性

5种检测系统全血CRP检测结果分别与西门子BNⅡ或BN Pro进行比对，0~300.00 mg/L检测范围内，各检测系统相关性均较好（r均>0.975， 表8）。

十一、正确度验证

使用上海市临床检验中心发放的正确度能力验证样品，参与实验的全血CRP检测系统均通过正确度验证（表9）。

讨论

CRP在炎症发生后4~6 h开始升高，36~50 h达到高峰；CRP水平和持续时间与感染程度呈正相关，CRP作为感染、炎症疾病的辅助诊断指标之一，广泛应用于临床^{［14, 15］}。与成年患者相比，儿童血标本采集更为困难，这是全血CRP检测替代血清CRP检测的主要原因之一。因此，在我国妇幼及儿童专科医院中，采用全血模式检测CRP相较血清或血浆模式更为广泛。然而，目前各医疗机构所使用的全血CRP检测系统的方法和原理相差很大，检测方法有免疫散射比浊法、免疫透射比浊法、免疫荧光法和干化学免疫法等，而且至今仍无全血CRP检测系统的性能评价标准。本研究纳入了临床普遍应用的、不同检测原理的5种全血CRP检测系统，参考CLSI和我国卫生行业标准中的方案，拟建立全血CRP检测系统的评价标准，保证该项目临床检测结果的准确性。WS/T420规定的临床实验室对商品定量试剂盒的性能验证内容至少包括精密度、正确度及线性验证。本研究除上述指标外，尚评估了临床实验室关注的指标，包括空白测定、携带污染、干扰实验、全血与血清样本结果相关性及样本稳定性。

实验结果显示，参与评估的全血CRP检测系统空白测定均<1.00 mg/L，说明设备的空白检测值足够低，根据此多中心实验结果，建议全血CRP设备空白测定<1.00 mg/L。携带污染指由测量系统将一个检测样本反应携带到另一个检测样品反应的分析物不连续量，由此错误地影响了另一个检测样品的表现量。参与评估的全血CRP检测系统携带污染<1.00%，表明高值全血样本对低值全血样本的检测结果干扰不明显。建议进行全血CRP携带污染评估时使用CLSI H26-A2方案，并取高值全血CRP标本浓度>80.00 mg/L、低值全血CRP标本浓度<10.00 mg/L，携带污染控制在1.00%以内。

影响检测精密度的因素较多，一方面，不同CRP浓度的样本可能导致检测系统不同的CV值，其中低浓度样本的CV值较大，中、高浓度样本的CV值较小，因此建议进行精密度评估时，根据不同样本浓度水平建立不同的判断标准，低浓度样本的CV值判断标准可适当高于中、高浓度样本或用标准差来判断。另一方面，精密度实验受仪器自动化水平影响，采用自动吸样的检测系统，较手工加样的检测系统能实现更高的精密度。结合本次多中心研究的数据、室间质评总误差要求及相关重复性及中间精密度的要求，建议全血CRP在3.00~10.00 mg/L时，检测系统的重复性CV值<10.00%；全血CRP>10.00 mg/L时，检测系统的重复性CV<6.00%；在各种浓度范围内中间精密度均应控制在10.00%以内。

WS/T 408-2012临床化学设备线性评价指南指出进行线性评价时所选用的样品应与临床实验样品相似，建议在进行样品制备时将高浓度混合样品与低浓度混合样品进行倍比稀释得到等浓度间隔的不同浓度水平^［16］。但不同临床来源的高、低浓度全血CRP样品，混合时可能会造成血型不合引起的溶血，因此不建议用高、低浓度全血CRP样品进行混合的方法进行线性评价。可考虑使用线性品或高、低值CRP血清样品进行倍比稀释得到不同浓度进行线性验证。本多中心研究表明各检测系统CRP设备的线性理论值及实测值的r值均>0.975，斜率在0.950~1.050。

在临床检测中，血液样本的检测结果会受各种因素的干扰，如采集后的处理方法，包括送检时间和保存温度等。考虑到临床对CRP结果有疑问时，需对标本进行复查的可能性，因此，本研究尝试对全血标本的可保存条件及时间进行研究。相关的样本稳定性实验表明，室温（18~25 ℃）或冷藏（2~8 ℃）72 h内全血CRP检测结果均能保持稳定，相对偏差在10 %以内。但由于CRP是急性时相反应蛋白，患者体内CRP变化较快，因此并不推荐长时间保存检测标本。但需对全血标本进行复检时，在常温或冷藏保存72 h内的标本，CRP结果仍然可信。

干扰实验结果表明，除干化学免疫速率法外，TG对全血CRP检测结果的影响较小。高血脂标本对目前在用的血细胞分析+全血CRP一体机及特定蛋白分析仪干扰较小，当TG浓度达到15.46 mmol/L时，与未加入TG的标本进行对比，偏差均<10.00%。新采购的全血CRP设备，或对CRP检测系统进行全面性能评估时建议进行高TG干扰验证，以相对偏差<10.00%为标准，得出干扰CRP结果的TG浓度。高胆红素标本也是临床比较常见的类型，需评估此类标本对全血CRP检测结果没有干扰。本次研究结果表明，当胆红素浓度达345.47 μmol/L时，对目前在用的血细胞分析+全血CRP一体机及特定蛋白分析仪干扰较小，与未加入胆红素的标本进行对比，偏差均<10.00%，采用POCT设备检测的标本相对偏差在20.00%以内。新采购的全血CRP检测设备，或对CRP检测系统进行全面性能评估时，建议进行高胆红素干扰验证并以相对偏差小于10.00%为标准，得出干扰CRP结果的胆红素浓度。

Hct是比较重要的影响全血CRP检测结果的因素，有Hct修正功能的全血CRP检测系统进行检测时，不同Hct浓度样本CRP检测结果相对偏差较小，而无Hct修正功能的全血CRP检测系统，较易受极端的Hct高值或低值的影响。无Hct修正功能的全血CRP检测系统，一般是根据Hct的参考区间将其设定于固定值，当实际Hct高于此固定值时，检测结果为假性减低，当Hct低于此固定值时则结果假性增高。因此，建议使用无Hct修正功能全血CRP检测系统的检测机构，对于极端高、低值的Hct患者样本检测的全血CRP值，参照标本的具体Hct值进行修正，确保该CRP（全血CRP）检测值尽可能接近CRP真实值（血清CRP值），这可通过实验室信息系统（LIS）引用该患者同期的血液分析的Hct结果，在LIS系统上设置修正公式，以得到正确的CRP检测结果。此外，部分全血CRP检测系统不具备检测前样本自动混匀功能，当临床样本量过大，检测前等待时间较长时，会因红细胞自然沉降的原因，导致检测结果受到一定的影响。

相对于CRP快速检测的POCT设备，如西门子特定蛋白分析仪之类的大型检测系统，在检测灵敏度、稳定性、溯源性等方面具有优势，被临床广泛使用，常被用作其他CRP检测系统的参考^{［17, 18］}。参与本次多中心研究的5种全血CRP检测系统，与该大型的特定蛋白分析仪CRP检测结果具有良好的相关性，0~300.00 mg/L检测范围内，各检测系统相关性均较好（r均>0.975）。但不同检测系统间也的确存在一定的系统偏差，建议使用不同检测系统时，应该采用由生产厂商提供的生物参考区间。

正确度是无穷多次重复测量所得量值的平均值与一个参考量值间的一致程度，正确度与准确度不同，准确度指单次检测结果与参考值间的一致程度，包含系统误差和随机误差，而正确度与随机测量误差无关，仅与系统测量误差有关。WS/T 492-2016提供了正确度验证方案，可以使用具有指定值的参考物质，也可使用患者样本。本研究的全血CRP检测系统的正确度验证，所有参与实验的检测系统均通过正确度验证。

本多中心研究发现，5种全血CRP检测系统的检测性能基本满足临床需求，但在临床应用中，需注意不同的操作人员以及Hct压积等因素对检测结果造成的影响，在规范的室间质控、室内质控管理体系下，保证全血CRP检验结果的准确性及可靠性。在选用新的全血CRP检测系统时，建议完成检测系统的完整性能评价。

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心傅启华教授对本项目启动和执行过程中给予的大力支持；上海交通大学医学院附属瑞金医院王剑飚教授在文章撰写过程中提出的宝贵建议；上海市临床检验中心居漪教授、朱宇清教授和朱岭峰老师对本文中所涉及的技术路线及方法给予验证，并提出修改建议

参考文献（略）