1. 凝胶预处理
1.1 将 Anti-Flag 亲和凝胶重悬混匀，吸取 10 μL 凝胶悬液 (约 5 μL 凝胶) 至干净的 1.5 mL 离心管。
1.2 加入 600 μL 洗涤缓冲液，混合均匀，10,000 rpm 离心 30 秒，弃去上清。重复 3-4 次。
注：小心吸取上清，避免凝胶损失。
2. 样品的结合
2.1 在上述清洗干净的凝胶中加入 500 μL 细胞裂解液。充分混匀后，置于翻转混合仪上孵育，4℃ 孵育 2 小时 (如需提高结合效率，可延长至过夜)。
2.2 10,000 rpm 离心 30 秒，将上清转移至新离心管 (上清液可用于检测 Flag 标签蛋白是否有残留)。
3. 洗涤
在上述分离得到的凝胶中加入 500 μL 洗涤缓冲液，充分混悬凝胶，10,000 rpm 离心 30 秒，弃去上清。重复以上洗涤步骤 3 次以上，直到洗涤后的上清液中 OD280 小于 0.05 为止。
注意：如上清液的 OD280 大于 0.05，适当增加洗涤次数即可。
4. 洗脱
本说明书提供三种 Flag 标签蛋白洗脱方案，操作者可根据需要选择不同的洗脱方案。
4.1 变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测。
步骤：在上述洗涤干净的凝胶中加入 50 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，充分混匀后煮沸 5 分钟。10,000 rpm 离心 30 秒，取 4 μL 上清液进行 SDS-PAGE 检测。
4.2 酸性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。步骤：在上述洗涤干净的凝胶中加入 50 μL 洗脱缓冲液 A，充分混匀后室温孵育 10 分钟。10,000 rpm 离心 30 秒，收集上清。按照每 50 μL 洗脱液加入 25 μL 中和缓冲液的比例加入中和缓冲液，将洗脱产物 pH 调节至中性，样品可用于后期功能分析。
4.3 竞争性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。
步骤：在上述洗涤干净的凝胶中加入 30-50 μL 洗脱缓冲液 B。充分混匀后，置于翻转混合仪上孵育，室温孵育 1 小时或 4℃ 孵育 2 小时。10,000 rpm 离心 30 秒，收集上清，即得目的蛋白，样品可用于后期功能分析。
