kar模型是什么斑马鱼重现KARS1突变引起的神经发育障碍和听力损伤

该研究通过国际合作调查16个不相关家庭，确定了22个受影响的个体都具有双等位基因KARS1变异。临床表现为中重度发育迟缓、神经感觉障碍、白质受累、发育退化、智力残疾、行为异常及其他神经异常等，该疾病通常在儿童早期发病，携带相同突变的不同患者间存在表型异质性。 

图1  16个家族中KARS1致病变异的

鉴定及临床总结

WISH检测斑马鱼胚胎中kars1的表达情况，结果显示在斑马鱼中枢神经系统、眼睛、内耳、肌肉和消化系统（肝脏、肠和胰腺）等组织中高表达（图2a-c）。作者利用CRISPR/Cas9技术建立了三个kars1功能缺失的斑马鱼突变系（kars1^om1del7，kars1^om2del8和kars1^1om3del7）。kars1纯合突变体（kars1^−/−）与野生型斑马鱼相比，从3dpf开始出现心脏水肿（黑色箭头）、小头（蓝线）、小眼（红线）、耳囊泡发育不全（红色箭头）、kars1^−/−幼鱼鱼鳔异常（黑色箭头）及躯干肌纤维异常等形态异常（图2d,e）。由于无法正常进食，kars1^−/−幼鱼发育至10dpf时全部死亡（图2f）。

作者比较了kars1^−/−与对照组的眼睛大小和头部长度，发现kars1^−/−出现小眼、小头的表型（图2g,h）。此外，kars1^−/−幼鱼对触摸没有反应，且丧失游泳方向。从kars1^−/−的侧卧图可反映出幼鱼前庭功能丧失、肌肉控制障碍以及鱼鳔充气障碍，而这些表型都会影响鱼体平衡能力。

考虑到kars1^−/−在眼睛和耳朵上表现出形态学缺陷且对触摸没有反应，作者进一步量化了它们的视觉惊吓行为反应（VSR）和听觉诱发行为反应（AEBR），kars1^−/−突变体对光或声刺激表现出运动能力完全丧失（图2i, j）。总体而言，kars1^−/−突变体在眼睛、内耳和躯干肌肉中发现的形态学缺陷似乎与胚胎发育过程中的kars1 mRNA的表达模式直接相关，提示这些表型源自kars1^−/−功能的丧失。

图2  kars1 mRNA在胚胎中的表达及

敲除后的形态表型和行为缺陷

对5dpf斑马鱼幼鱼大脑的组织学分析显示，与对照组相比，在kars1^−/−突变体中出现空泡状海绵体，细胞密度降低，节段边界紊乱（图3a– c）。此外，与对照组相比，kars1^−/−眼体积减少，视网膜层组织完全丢失，表明斑马鱼视力受损（图3b）。此外，与对照相比，kars1^−/−大脑和视网膜神经元细胞数量明显减少（图3a, b）。对神经元突触的免疫组化分析显示，大脑和眼睛区域的染色都有减少，kars1^−/−突触显著减少，表明神经元传递受损（图3d）。此外，染色显示kars1^−/−突变体运动神经元轴突投射收缩异常和末端轴突分支减少，进一步表明运动功能受到了严重影响（图3e）。

WISH数据显示，在躯干肌肉中有kars1 mRNA的表达（图2a），而在kars1^−/−突变体中，触摸无法诱发斑马鱼游泳行为。鬼笔环肽（Phalloidin）染色显示肌动蛋白在肌切部染色较弱、肌腱连接处的肌肉纤维错位和脱落，这表明kars1^−/−突变体有严重的神经肌肉功能障碍，导致运动不协调（图3f, g）。

kars1^−/−突变斑马鱼表现出内耳缺陷相似的听力障碍，与携带KARS1双等位基因突变的患者的表型一致。形态学分析显示，kars1^−/−突变体的耳泡和耳石变小（图3h）。静纤毛对内耳听毛细胞束的形成和机电转导至关重要，而内耳的Phalloidin染色显示富含F-肌动蛋白的静纤毛数量明显减少（图3i）。综上所述，kars1在斑马鱼内耳听毛细胞的形成过程中起着至关重要的作用，这与kars1突变个体中发现的听力障碍表型相一致。

综上，形态学、行为学和组织学分析表明，kars1^−/−突变体幼鱼表现出视觉障碍、神经肌肉功能障碍、感觉神经性听力损失，重现了KARS1突变人类患者中发现的部分表型。

图3  kars1^−/−幼鱼的组织学分析显示

神经、肌肉和内耳缺陷

为了确定kars1功能缺失对基因表达的影响，作者分别对3dpf和4dpf的 WT和kars1^−/−突变体进行了RNA测序（RNA-Seq）。KEGG通路分析显示，kars1功能缺失导致包括p53和细胞凋亡通路在内的许多通路的失调。ARSs已被证明可以调节细胞凋亡途径。为了检测在kars1^−/−突变体中发现的形态学缺陷是否是由于异常的细胞凋亡引起的，作者进行了TUNEL检测，在发育至5dpf时，与对照组相比，kars1^−/−突变体的脑、眼、躯干和内耳中TUNEL阳性细胞增加，表明不同的细胞类型对kars1的缺失都很敏感。

接下来，为了确定细胞凋亡的增加是否通过p53激活介导，作者在kars1^−/−胚胎中进行tp53 MO敲低实验，随后胚胎在发育至3dpf进行TUNEL检测。结果显示，注射MO的kars1^−/−突变体的大脑、眼睛、耳朵和躯干中的TUNEL阳性信号显著减少，眼睛尺寸恢复（图4a–d）。部分凋亡标志物的表达恢复到WT水平（图4e），综上证实了tp53被成功敲低。为了进一步研究抑制p53信号通路后在分子水平上的功能恢复，作者检测了在kars1^−/−突变体中下调的6个基因的表达（图4f），发现在kars1^−/−突变体中tp53敲除后，这6个基因的表达部分恢复。综上所述，kars1的缺失上调了p53通路，引起细胞凋亡，进而导致多种表型异常。

为了验证这一发现，作者用CRISPR/Cas9技术对kars1和tp53基因进行共敲。斑马鱼WT kars1 mRNA注射挽救了上述表型，证实了上述表型是由于kars1功能丧失引起的（图4g）。重要的是，tp53 sgRNAs注射可以恢复kars1 F0突变体眼睛和头部的大小（图4g–i）。此外，90%的kars1 F0幼鱼在10dpf时死亡，注射kars1 mRNA 或tp53 sgRNAs后，只有20%的幼鱼在10dpf时死亡（图4j）。组织学分析显示，与kars1 F0突变体相比，kars1;tp53 F0突变体的大脑中细胞的空泡状海绵体外观明显恢复，眼球体积和视网膜层组织也有明显恢复（图4k）。上述研究结果表明，kars1 F0突变体出现的表型与kars1^−/−突变体表型一致，而p53缺失可以减轻因kars1缺失而导致的形态、行为和分子表型。

图4  kars1功能缺失突变体通过

激活p53通路介导细胞凋亡

双等位基因KARS1变异是罕见的早发儿童神经退行性疾病的致病原因之一，且与肌萎缩症和非综合征性听力损失密切相关。本文利用斑马鱼模型对KARS1基因功能进行评估， kars1^−/−突变体幼鱼表型与患者中致病性变异相关的表型特征一致。ARS酶的缺失已被证明可以激活p53信号通路，而kars1^−/−突变体显示p53信号通路被激活以及细胞凋亡通路基因上调。已有的研究表明p53信号的上调与人类少突胶质细胞的凋亡和铜诱导的小鼠脱髓鞘（白质营养不良分类中的一类）有关，p53的遗传或药理学抑制降低了铜唑嗪诱导脱髓鞘的易感性，并提高了少突胶质细胞的存活率。综合已有的研究结果和本文的研究结果表明，p53通路抑制剂可能是KARS1患者的潜在治疗方法。本文的斑马鱼疾病模型为探索KARS1的双等位基因突变的疾病关联提供了新的思路，可作为一种便捷高效的方法来研究基因变异相关的各类疾病，建立基因型-表型关联，并探索病理机制和可能的治疗方法。

• 多组学数据分析表明PTEN体细胞突变导致半脑巨头畸形