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急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种临床综合征,其特征是肺泡毛细血管膜的通透性增加,导致肺水肿和气体交换功能障碍[1]。虽然对于ALI的病理生理学研究已经取得了重要进展,但由于特效药物的缺乏以及常规治疗效果不佳,ALI仍然是呼吸系统危重患者发病和死亡的主要原因。骨形态发生蛋白6(BMP-6)位点与用力肺活量之间的关联在全基因组关联研究中被发现[2]。BMP-6对铁稳态至关重要[3-4],在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的巨噬细胞中观察到铁水平增加,并与肺气肿严重程度呈正相关,表明铁蓄积可能促进肺组织损伤[5]。然而,BMP-6在ALI病理过程中的作用尚不清楚。因此,本研究通过构建急性肺损伤模型,探讨BMP-6是否通过调节铁水平参与ALI的发病机制。
脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司(货号L2630),BMP-6抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司(货号sc-57042),铁调素(hepcidin)抗体购自英国Abcam公司(货号ab30760),β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自亚科因生物技术有限公司(货号ABL1011),血清和组织铁测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(货号A039-1-1、A039-2-1)。
RM2245石蜡切片机购自德国Leica仪器有限公司,MDF-U53V型号-80℃超低温冰箱购自日本Sanyo电机株式会社,Epoch酶标仪购自美国BioTek仪器有限公司,CFX Connect荧光定量PCR仪和PowerPac Basic western blot电泳仪购自美国Bio-Rad公司。
实验所用的动物为SPF级健康Wistar大鼠,雌性,共16只,年龄8～9周,体质量180～200g,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供,其动物合格证编号为No.211002300050341。大鼠饲养于清洁环境中,温度为24℃～28℃,湿度为40%～50%,遵循12h的昼夜节律。
使用随机数字表法,将大鼠分为Control组和LPS组,每组8只。LPS组的大鼠通过腹腔注射LPS(10mg/kg)来诱发急性肺损伤,而Control组大鼠则接受等量的0.9%氯化钠溶液腹腔注射。
在LPS注射后4h,通过脊椎脱臼法处死大鼠,并立即获取左侧肺组织。随后,使用4%多聚甲醛溶液对肺组织进行固定,固定时长为24h。固定后的组织经过乙醇溶液的梯度脱水处理,用二甲苯使组织透明,石蜡包埋。石蜡包埋的组织块被切成约5μm厚的切片,经过HE染色后进行封片。最后,通过光学显微镜观察肺组织的形态学变化。
使用Trizol试剂盒并严格遵循说明书提取大鼠肺和肝组织的总RNA。通过260nm波长处的吸光度(A值)测定来计算RNA浓度。逆转录反应条件为42℃下60min,之后95℃下5min,生成的cDNA在-70℃下保存。基于大鼠BMP-6、hepcidin和β-actin的GenBank序列,设计实时荧光定量PCR引物,并由武汉擎科生物技术有限公司合成。BMP-6 mRNA引物(201bp)序列,上游:5′-GTACAGACCTTGGTCCACCT-3′,下游:5′-ATCCGAGGCAGAATCACAGC-3′;hepcidin mRNA引物(271bp)序列,上游:5′-TCTCCTGCTTCTCCTCCTG-3′,下游:5′-TGTTATGCAACAGAGACCACA-3′;β-actin mRNA引物(285bp)序列,上游:5′-GCGAGTACAACCTTCTTGCAG-3′,下游:5′-CAATGCCGTGTTCAATGGGG-3′。PCR扩增反应体系含有1.5μL cDNA模板、7.5μL 2×SYBR Green Master Mix、各0.5μL的上游和下游引物(10μmol/L)以及5μL Nuclease-Free Water。PCR反应条件包括一个变性步骤(95℃,30s),然后60℃退火30s和72℃延伸50s循环,共进行39个循环。
首先,从组织中提取总蛋白,并对其浓度进行测定。随后,将提取的蛋白与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合,在沸水中加热8min,确保蛋白完全变性。接着利用12%的分离胶和5%浓缩胶进行电泳分离,以湿法转膜技术将蛋白转移到NC膜上。使用5%脱脂奶粉对NC膜进行封闭处理,时间为90min。接下来,加入稀释比例为1∶1000的兔抗大鼠BMP-6抗体和hepcidin抗体,于4℃下孵育过夜。然后洗掉未结合的抗体,加入稀释比例为1∶10 000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗,在室温下摇床孵育60min。最后,再次洗膜后,采用增强化学发光法进行显色。
大鼠被适当固定后通过眼眶静脉丛采血,将采集好的血液静置1h,随后以2000rpm的速度离心15min,分离并吸取上层血清。准确地称量待检测肺组织的重量,按照重量与体积之比为1∶9的比例,向肺组织中加入生理盐水,在冰水浴条件下进行机械匀浆,以2500rpm的速度离心10min,收集上清液备用。在整个实验过程中,严格按照试剂盒的说明指导进行操作,并根据试剂盒提供的方法来计算血清铁浓度和组织铁含量。
应用GraphPad Prism 9.0统计软件进行数据分析。对于符合正态分布的数据,采用独立样本t检验来对比不同组别,对于不符合正态分布的数据,则应用秩和检验来进行比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
在Control组大鼠肺组织中,支气管和肺泡保持了正常的结构和完整性,同时肺间质内未见异常的炎症细胞积聚;相比之下,LPS组大鼠肺组织支气管和肺泡壁增厚,且观察到肺泡腔扩大,肺泡隔宽度增加,见图1。
图1 两组大鼠肺组织病理学变化结果(×200)
与Control组相比,LPS组大鼠肺组织的BMP-6 mRNA和蛋白表达水平明显下降,差异有统计学意义(P< 0.01),见图2。
与Control组比较,**P<0.01,n=8。
图2 两组大鼠肺组织BMP-6 mRNA和蛋白表达水平比较
与Control组相比,LPS组大鼠肝组织的hepcidin mRNA和蛋白表达水平明显下降,差异有统计学意义(P< 0.05,P< 0.01),见图3。
与Control组比较,*P<0.05,**P<0.01,n=8。
图3 两组大鼠肝组织hepcidin mRNA和蛋白表达水平比较
与Control组相比,LPS组大鼠的血清和肺组织的铁水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.001),见图4。
与Control组比较,**P<0.01,***P<0.001,n=8。
图4 两组大鼠血清和肺组织铁水平比较
ALI是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的早期阶段,是由多种因素(如感染、创伤等)引起的临床综合症。其发病机制主要涉及炎症反应和细胞损伤,炎症细胞分泌细胞因子和炎症介质,导致肺毛细血管通透性增加和肺泡上皮细胞损伤,从而引起肺水肿和气体交换障碍。此外,氧化应激、凝血与纤溶系统的失衡也在ALI的发生发展中起到关键作用,这些因素共同作用,最终导致严重的呼吸困难和低氧血症[6]。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分,它能够激发强烈的免疫反应,通过注射小剂量的LPS来模拟细菌感染,引起肺部的炎症反应,包括免疫细胞的募集和激活,以及细胞因子和炎症介质的释放。此模型可以有效地模拟人类ALI的许多特征,如肺水肿、肺泡出血和气体交换功能受损[7]。因此,本实验采用腹腔注射LPS建立急性肺损伤模型,结果显示,注射LPS后,大鼠肺组织支气管和肺泡壁增厚,且观察到肺泡腔扩大,肺泡隔宽度增加。
在CHARGE和SpiroMeta联盟最近进行的全基因组关联研究的分析中,发现了6个与用力肺活量相关的新位点,包括编码骨形态发生蛋白(BMP)-6的基因。BMP亚家族最初被认为是一个诱导异位软骨和骨形成的蛋白质家族,但在过去的几年里,越来越多的数据表明BMP参与了各种器官的发育和体内平衡[2]。BMP-6对铁稳态至关重要,因为它是hepcidin的重要调节剂[3-4]。Hepcidin是一种富含半胱氨酸的氨基酸阳离子肽,由肝脏合成分泌,并通过负反馈调控机体铁水平[8]。当BMP-6表达升高时,通过与BMP 共受体haemojuvelin(HJV)结合,促进Smad1、5和8的磷酸化,磷酸化的Smad1、5和8随后与Smad4相互作用形成Smad复合物并被运输到细胞核,该复合物在细胞核中与hepcidin启动子内的 BMP反应元件结合,使hepcidin表达增加。Hepcidin可与膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1)结合,从而诱导其在肝细胞、巨噬细胞和肠上皮细胞内泛素化、内吞和溶酶体降解,并限制铁从结合物释放入血,进而降低铁水平[9]。
Verhamme等[10]的研究发现,在COPD患者的肺部中,BMP-6 mRNA的表达和蛋白水平显著降低。本研究结果显示,LPS处理后大鼠肺组织BMP-6 mRNA的表达和蛋白水平下降,这与Verhamme的研究结果一致。且LPS组肝组织hepcidin mRNA的表达和蛋白水平也降低,而血清和肺组织的铁水平升高,提示LPS通过降低肺组织BMP-6表达,使hepcidin表达下降,并通过负反馈升高铁水平,导致肺部铁蓄积。铁在肺部的积累会通过氧化应激导致组织损伤和炎症,进而诱导急性肺损伤。
综上所述,LPS可能通过下调BMP-6和hepcidin的表达,促进肺部铁水平升高蓄积,进而诱导急性肺损伤的发生。本研究分析了急性肺损伤时BMP-6和hepcidin的表达,以及肺部的铁水平,但LPS诱导急性肺损伤的具体机制仍需进一步探究。后续研究将致力于揭示LPS、BMP-6、hepcidin和铁之间的分子交互网络,包括可能的信号传导路径和转录调控机制,通过增设更多实验组与对照组以及临床样本分析,进一步验证BMP-6在急性肺损伤中的作用,并探索其作为潜在治疗靶点的可能性,从而为干预该疾病进程提供新的策略。
