1、酶制品技术实验指导广东科贸职业学院酶制品技术实验指导书生物技术教研室适用专业：生物技术及应用廖文镇编二 0一一年三月十日实验报告的书写：i 性质实验实验名称日期%1. 实验目的与要求%1. 实验原理：用简洁语言概括实验原理。%1. 主要试剂与器材（可以省略）%1. 操作步骤、结果与解释（可用表格表示）1. 第一项实验的操作步骤、结果与解释2. 第二项实验的操作步骤、结果与解释%1. 结果分析与讨论1分析实验结果2 该实验有哪些注意事项3 实验方法有哪些地方可以改进4凝问ii 测定实验实验名称日期%1. 实验目的与要求%1. 实验原理：用简洁语言概括实验原理。%1. 主耍试剂与器材（可以省略）%
2、1. 操作步骤%1. 计算或结果%1. 结果分析与讨论1分析实验结果2 该实验有哪些注意事项3 实验方法有哪些地方可以改进4 疑问2实验一酸性磷酸酯酶的制备%1. 实验冃的1了解磷酸酯酶酶促反应的催化机理 2.学握酸性磷酸酯酶的制备方法二原理酸性磷酸酯酶广泛分布于动植物体屮，尤其是植物的种子、动物肝脏 和人体的前列腺中。他对生物体内核甘酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着非常 重要作用。酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸 酯（npp）作底物，水解产牛对硝基酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚 盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。磷酸酶磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸
3、化的酶 通过水 解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的轻基。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量 分子，如atp,将磷酸基团加到对应底物分子上。在许多牛物体中都普遍 存在的一种磷酸酶是碱性磷酸酶。磷酸酶可以被分为两类：半胱氨酸依赖的磷酸酶和金属磷酸酶（其活 性依赖位于活性位点上的金属离子）。磷酸酶催化机制：半胱氨酸依赖的磷酸酶通过形成磷酸一半胱氨酸中间体来催化磷酸酯键的断裂，具体过程如下（以磷酸化的酪氨酸去磷酸化过程为例，参见 右图）:首先，酶活性位点上的自由的半胱氨酸亲核基团进攻磷酸基团中的磷 原子并成键；然后，连接磷酸基团与酪氨酸的p0键接受
4、位置合适的酸性 氨基酸（如天冬氨酸）或水分子所提供的质子，发牛质子化，从而形成磷 酸一半胱氨酸中间体；这一中间体被另一个水分子所水解，酶的活性位点 被释放，可以继续下一个去磷酸化反应。金属磷酸酶的活性位点上结合了两个催化所必需的金属离子。而对于 这两个金属离子的性质的研究结果并不一致，因此到目前为止还没有定论。 现有的证据只能够表明，这两种金属可以是镁、猛、铁、锌的任意组合， 并且两个金属离子z间通过一个氢氧根离子相连。冃前认为这一氢氧根离 子参与了对磷的亲核攻击。根据所催化的底物特异性，磷酸酶可以被细分为如下五种。3类别例子底物酪氨酸特异性磷酸酶ptp1b磷酸化酪氨酸丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸
5、酶pp2c磷酸化丝氨酸/苏氨酸双特异性磷酸酶vhr磷酸化酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸组氨酸磷酸酶php磷酸化组氨酸脂类磷酸酶pten磷脂酰肌醇3, 4, 5三磷酸（phosphatidyl-lnositol-3,4,5-triphosphate）生物学功能磷酸酶与激酶或磷酸化酶的磷酸化作用正相反。磷酸化可以使一个酶 被激活或失活（如，激酶信号通路），也可以使一个蛋白一蛋白间相互作 用发生（如sh3结构域）；因此，磷酸酶是许多信号转导通路控制磷酸化所 必需的。值得一提的是，磷酸化或去磷酸化并不一定对应着酶的激活或抑 制，而且一些酶有多个磷酸化位点参与激活或抑制的调控。例如，周期素 依赖性激酶（cdk）
6、有多个能够被磷酸化的特定氨基酸残基，而激活或抑 制对应不同残基的磷酸化。磷酸之所以对于信号传导很重要，其原因在于 它能够对其所结合的蛋白的行动进行调控；而除去磷酸，则是一种反向作 用（如果磷酸化是激活作用，则去磷酸化就是抑制作用），磷酸酶就在这 里扮演了重要的角色。%1. 实验器材及试剂1. 材料绿豆芽、乙酸盐冲液2. 器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机，透析袋, 纱布，剪刀等。%1. 实验步骤酸性磷酸酯酶原酶液的制备（视频演示）1. 取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部2. 称取豆芽茎20g,用蒸憾水洗干净3. 用研钵研碎，加0.2mol/l乙酸盐缓冲液4ml,置冰箱中6h以上
7、4. 将上述绿豆芽浸取液倒入纱布内压榨，榨出液3000r/min离心15min5. 上清液置透析袋用蒸憾水充分透析，间隔换水10次，透析24h以 上。46. 将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎质量（g）相等，以3000r/min离心30min,所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。实验二a淀粉酶的制备%1. 实验目的1. 掌握a 淀粉酶的制备方法。2. 比较a 淀粉酶的制备酸性磷酸酯酶的制备有什么异同。%1. 实验原理淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质从而被机体利 用。淀粉酶主要包括a 淀粉酶和b 淀粉酶两种。a 淀粉酶可随机作用于 淀粉中的a-1, 4-糖昔键，生成葡萄糖、麦芽糖
8、、麦芽三糖、糊精等述原 糖，同时使淀粉的黏度降低，因此又称为液化酶。b 淀粉酶可从淀粉的非 还原末端进行水解，毎次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉 酶活力的人小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作 标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位 重量样品在定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶 活力最强，其中主要是a 淀粉酶和b 淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，a- 淀粉酶不耐酸，在ph3.6以下迅速钝化。b 淀粉酶不耐热，在70°c15min 钝化。%1. 实验器材及试剂1、材料萌发的小
9、麦种子（芽长约lcm）o 器具 离心机，离心管，研钵，电炉，50ml和200ml容量瓶各一个%1. 实验步骤1. 称取lg萌发3天的小麦种子（芽长约lcm）,置于研钵中2. 加入少量的石英砂和2ml的蒸储水，研磨匀浆。3. 将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸憾水分次将残渣洗入离心管。提 取液在室温下放置提取15至20分钟。每隔数分钟搅动一次，使其充分提 取。4. 然后在3000转/分转速下离心10分钟。5. 将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸储水定容至刻度，摇匀，即 制得q 淀粉酶原液。保存于低温冰箱屮，为以后的实验使用。6实验三 酶促反应中初速度时间范围测定%1. 实验目的了解酶促反应中初速度
10、时间范围测定的基本原理掌握酶促反应中初速度时间范i韦i测定的方法%1. 原理酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸 酯（npp）作底物，水解产生对硝基酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚 盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的 活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生 成lumol产物所需耍的酶量。要进行酶活力的测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在 初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作
11、来求出酶的初速度时间 范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下采用，采用每隔一定时 间测定产物牛成量，以酶反应时间为横坐标，产物牛成量为纵坐标绘制而 成，见图（课本）。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线, 英斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速 度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。%1. 实验材料与器材材料 绿豆芽、乙酸盐酸冲液 器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机，透析袋,纱布，剪刀等。%1. 实验步骤与要领 酶促反应71. 取试管12支，按表编号，0号管为空白。各管加入1.0ml 1.2mmol/lnpp；2. 另
12、外2支试管，各加入稀释好的酶液7ml,在酶反应前底物与酶都放入35°c恒温水浴槽中预热2min；3. 向1-11号管内各加入1.0ml预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按 时间间隔为 3min 5mim 7min 10min> 12min 15min> 20min 25min> 30min> 40min> 50min 进行反应。4. 待反应进行到上述各相应时间时,加入3.0ml 0.3mol/lnaoh终止反 应。5冷却后以0号管作空白（0号管加入l.ominpp后保温25min,然后 加入3ml 0.3mol/lnaoh,在加入1.0ml酶液），在分光光
13、度计上测定各管 a405 值。表制作酶促反应进程曲线时各物质加入量%1. 数据处理以反应时间为横坐标，a405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中 直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。实训报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速 度的时间范i韦i。8实验四ph对酶活力的影响一最适的ph的测定一.实验目的1. 了解ph对酶活力影响的机理；2. 掌握测定最适ph的基本原理；3. 掌握最适ph的测定方法。%1. 原理ph对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的ph即酶的 最适ph。通常各种酶只在一定ph范围内才表现它的活性。一种酶在不同 ph下所表现岀来的活
14、性不同。ph之所以对酶活性有很大影响，可能是因 为它改变了酶活性部位有关基因的解离状态。在最适ph时，酶分子上活 性基团的解离状态最适于酶与底物的结合。而高于或低于最适ph时酶活 性部位基团解离状态均不利于酶与底物的结合。酶活力也相应降低。ph 也可影响底物的解离及反应系统中其他组分的解离。缓冲系统的离子性质 和离子强度也可能对酶促反应产生影响。另外，ph对酶的活性有很大影响 外，对酶的稳定性也有影响。过高或过低的ph会该表酶的活性中心构象， 甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。在保持其他反应条件恒定，而在一系列变化的ph下测定酶活力，以 ph为横坐标，od405为纵坐标作图，可得到一条ph
15、酶活力曲线，从中球 的最适pho%1. 实训试剂与器材1试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶液（2）酸性磷酸酯酶酶液 将原酶液用水稀释10倍左右，是ph酶活 力曲线中第六管od405在0.60.7之间。（3）2.4mmol/lnpp水溶液 精确称取npp 0.8908g用水溶解并定容 至 looomlo（4）0.3mol/lnaoh（5）各ph缓冲液?0.05mol/l柠檬酸溶液?0.05mol/l柠檬酸三纳溶液。92器材恒温水浴槽，可见光分光光度计，试管，刻度吸管。按表12配制，并测得数据为准表12各缓冲液配制%1. 操作步骤与要领1 酶促反应取口支试管编号,0号为空白。各加入2.4mmol/lnpp
16、0.2ml,相应加入不同ph缓冲液各1.8ml,各管再加入35°c预保温（另取2支试管，各 加入稀释好的酶液56ml,在35°c恒温水浴槽中保温2min）的酶iml,立 即摇均计时，15min后加入0.3mol/lnaoh 2.0ml终止反应。2测定od405值0号管先加入0.3mol naon 2.0ml之后再加酶液，各管终极反应并冷 却后侧od405,将结果按不同ph对应记录。3 数据处理以反应ph为横坐标，od405为纵坐标，绘制ph酶活力曲线，求出酸性磷酸酯的最适pho%1. 数据处理绘出ph酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯的最适ph。10 实验五温度对酶
17、活力的影响一一最适温度的测定一.实验冃标1. 了解温度对酶活力彫响的机理；2. 掌握测定最适温度的基本原理；3. 掌握最适温度测定方法。二原理温度对酶的影响具有双重作用。一方面，温度加速酶促反应的速度; 另一方血酶食蛋白质，温度升高会引起酶蛋白的变性。因此，在较低温度 的范围内，酶促反应速度随温度升高而增大，超过一定温度后，反应速度 下降。酶促反应速度达到最大值时的温度称为酶反应的最适温度。如果保 持其他反应条件恒定，而在一系列变化的温度下测定酶活力，以温度为横 坐标，反应速度为纵坐标作图，可得到一条温度酶活力曲线，从中可求得 最适温度。 各种酶的最适温度是不同的，一般动物组织中各种酶的最适
18、温度在35-40°c,植物和微生物中各种酶的最适温度范围较大，大约在 32-60°c之间。但最适温度不是酶的特征常数，一种酶的最适温度不是一 个恒定数值，它与反应条件有关。如反应时间延长，一般最适温度降低。 因此，对同一种酶来讲，应说明是在什么条件下的最是温度。温度是影响酶促反应速度的重要因素之一。在温度较低时，绝对温度 对 vmax 的影响遵守 arrnenius 公式：lgvmax?eal()?常数 2.3rt?1?1式中，ea表示酶促反应的活化能，j mol/； r表示气体常数， 8.314j.mol.k?l；t表示绝对温度，k； vmax表示酶全部被过量底物饱和时所测得的反 应速度。实验室，测定不同温度下的酶促最大反应速度vmax,以igvmax对绝 对温度的倒数1/t作图,得一斜率等于-ea/2.3r的直线，因此可求的活化能ea.三试剂与器材1.试剂11（1）酸性磷酸脂酶原酶液（2）酸性磷酸脂酶酶液 将原酶液用005mol/l柠檬酸缓冲液稀 释25倍左右，使测定的第五管od405值在0.60.7之间。（3）1.2m
