▲第一作者：黄维      

通讯作者：陈国胜，欧阳钢锋

通讯单位：中山大学化学工程与技术学院（珠海），中山大学化学学院（广州）

论文DOI：10.1038/s41467-023-39364-x

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本研究报道了一种温和、绿色的自下而上的超分子组装策略制备杂化生物催化剂。这种超分子杂化生物催化剂具长程有序的孔道结构，可以作为门控筛分催化底物，提高融合的酶的催化选择性；同时，本研究开发一种基于超分子生物催化剂的电化学免疫传感器，实现癌症生物标志物的灵敏检测。

02

背景介绍

天然酶是一类具有催化活性的天然聚合物，通过绿色、温和、高效的方式催化细胞内的化学反应，具有人工催化剂无法比拟的高效率。然而，酶的柔性构象在外界刺激下极易发生变化，极大地限制了酶的大规模工业应用。利用多孔超分子“盔甲”对天然酶结构进行约束、保护是设计多功能杂化生物催化剂的有效手段，既能解决酶的稳定性问题，又能提高酶的可重复性。尽管该领域已取得了系列进展，但多孔超分子框架的结晶往往需要苛刻的条件，如何实现在生物相容条件下原位装配超分子晶体“盔甲”仍是技术难点。

03

本文亮点

1）报道一种氢键超分子组装策略构筑杂化生物催化剂。该策略利用具有四个甲酸臂的c2对称芘结构作为超分子构建模块，修饰的甲酸臂使芘模块在微量有机溶剂中具有高分散性，并可在几乎无有机溶剂的水溶液中，将离散的芘模块通过羧酸二聚作用在酶表面形成多孔超分子氢键网络结构；

2）共平面的芘分子提供坚实的层间π-π堆叠作用，使杂化生物催化剂在较宽的pH范围内稳定；

3）这种结构明确、孔通道排列有序的超分子“盔甲”具有门控作用筛分催化底物，从而提高酶催化的选择性，同时也可提高酶在非生理环境下的稳定性；

4）开发一种基于超分子生物催化剂的电化学免疫传感器，实现癌症标志物的超灵敏检测。

04

图文解析

氢键超分子杂化生物催化剂的制备及结构表征：通过粉末x射线衍射证明了复合结构的成功制备（图1a）。通过氮吸附/解吸等温线实验揭示了合成的氢键超分子生物杂化催化剂（HRP@HOF-100）具有微孔结构，且HOF-100的部分孔隙被酶HRP占据（图1b）。共聚焦激光扫描显微镜实验（图1d）证实了融合的HRP均匀地分布于框架内。作者使用cryo-EM观察杂化生物催化剂的微观结构（图1c），并到[011]投影方向上清楚识别到长程有序的微孔通道，宽度约为1.2 nm。此外，在[10-1]投影方向拍摄到约为0.34 nm的层间距离，说明该杂化生物催化剂具有较强的π-π堆叠作用力。

▲图1. HRP@HOF-100生物催化剂结构表征

酶构象研究：HRP是一种血红素蛋白，具有五配位、高自旋的血红素中心结构（图2a）。圆二色光谱证明， HRP在组装溶液中孵化6小时后仍能保持2级结构完整，说明该组装策略的生物相容性（图2b）。固态核磁共振波谱实验证实融合的HRP和HOF间存在特定的界面作用（图2c）。紫外-可见漫反射光谱（图2d）表明融合的 HRP的血红素中心没有发生显著的结构变化。电子顺磁共振光谱（图2e）进一步证实融合的HRP血红素中心保持五配位、高自旋的构象。图2f显示制备的超分子杂化生物催化剂继承了HRP优异的过氧化物酶活性。为了准确定位酶的空间位置，作者通过原位还原的策略在酶上标记铂纳米簇（Pt NCs，图2g）。通过高倍cryo-EM成像证实许多单颗粒PtNCs嵌于高度结晶的HOF-100框架（红色圆圈突出显示，图2h），可推断酶单分散于HOF-100。

 

▲图2.酶构象研究

有序孔道的门控效应提高酶催化选择性：脂肪酶（Lipase）是一种在工业上应用广泛的酯键水解酶，但其底物特异性差，限制了其在选择性催化中的应用。我们利用这种绿色、温和的组装策略将脂肪酶融合于HOF-100，构筑Lipase@HOF-100生物杂化催化剂。低电子剂量cryo-EM成像证实该杂化催化剂高度结晶，具有1.2 nm × 0.8 nm的菱形开放窗口（图3a）。作者首先选择分子尺寸相对较小的对硝基苯丁酸酯（NPB，约6.0 Å ×7.9 Å ×11.3 Å分子尺寸，图3b）作为底物。如图3c所示，在相同酶剂量下，Lipase@HOF-100催化 NPB的水解效率与天然脂肪酶相当。然而，当选择分子尺寸相对较大的对硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP, 6.7 Å × 10.4 Å × 18.6 Å，图3b）作为底物时，Lipase@HOF-100的催化动力学曲线斜率接近于零，表明Lipase@HOF-100对p-NPP没有活催化性（图3d）。这说明高度结晶的孔道具有严格的门控效应，排阻大尺寸p-NPP底物但允许小尺寸NPB底物的进入，提高脂肪酶的催化选择性。

 

▲图3. 有序孔道的门控效应提高脂肪酶催化选择性

稳定性研究：高结晶的超分子晶体不仅赋予酶促反应高选择性，而且还可以保护脆弱的酶分子（图4a）。作者分别将天然Lipase和Lipase@HOF-100分别孵育在蛋白水解试剂、高浓度尿素、碱性水溶液、丙酮、酸性水溶液、四氢呋喃和高温环境30分钟， Lipase@HOF-100均能较好的保持原有的生物活性（以NPB作为催化底物）。然而，天然脂肪酶会出现不同程度的变性、失活。此外，得益于HOF层间强π-π堆叠作用， Lipase@HOF-100（图4b）在pH 1-11的水溶液均能保持结构完整，展示出优异的化学稳定性。

 

▲图4. Lipase@HOF-100的稳定性研究

超灵敏电化学免疫传感器:鉴于开发的生物杂化催化剂的高活性和稳定性，我们进一步开发一种基于循环催化级联机制的电化学免疫传感器，并将其用于MUC1的灵敏检测（图5a和5b）。如图5c和图5d所示，该电化学免疫传感器具有宽的线性范围和低的检测限，并兼备出色的特异性和抗干扰能力（图5e）。

 

▲图5. 超灵敏电化学免疫传感器

05

总结与展望

作者开发一种温和、绿色的自下而上超分子组装策略制备杂化生物催化剂。层次的HOF-酶结构继承天然酶的温和、高效催化特性，并巧妙利用结晶框架的约束效应突破酶催化的稳定性瓶颈。此外，共平面的芘核提供强大的层间π-π堆叠作用，使设计的杂化生物催化剂具有优异的化学稳定性。这种结构明确、孔通道排列有序的超分子晶体具有门控作用筛分催化底物，提高融合的酶的催化选择性；还可作为“盔甲”保护酶，提高酶在非生理环境下的催化稳定性。鉴于杂化生物催化剂的优异性能，本研究开发一种基于循环催化级联的电化学免疫传感器，实现癌症标志物的超灵敏检测。这项工作克服了（部分）天然酶在大规模工业应用存在的催化稳定性和选择性问题，为设计高效的杂化生物催化剂提供了新见解。

06

作者介绍

陈国胜，中山大学化学学院副教授，主要从事新型功能材料的设计及面向生命健康应用，包括蛋白质-多孔有机框架复合材料、酶固定化新技术、生物传感、纳米催化医学等方面的研究工作。以第一/通讯作者身份在Chem. Soc. Rev.、Nat. Protoc.、Chem、Nat. Commun.、Angew. Chem. Int. Ed.、Matter、JACS Au、Adv. Funct. Mater.、Chem. Sci.等期刊上发表SCI论文36篇，主持国家自然科学基金面上项目、青年基金和博士后创新人才计划等国家级和省部级项目6项。欢迎有兴趣从事化学、材料、生物交叉研究的博士后或副研究员加入课题组。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-39364-x

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