npp底物是什么高酶活枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶phoA基因克隆表达及降解内毒素的应用

1.4.1 菌株的分离培养

采取有机质丰富的土壤环境样品，将3 g样品用7 mL灭菌生理盐水进行重悬，继续稀释300倍后，将稀释液均匀涂布于有机磷筛选培养基中，于37 ℃恒温培养箱中静置12 h。

1.4.2 产高酶活碱性磷酸酶菌株的筛选及鉴定

在无菌的96孔酶标板中依次加入100 μL灭菌生理盐水，将有机磷筛选培养基中长出的单菌落进行形态学鉴定，挑取疑似枯草芽孢杆菌的单菌落置于96孔酶标板中重悬均匀，加入50 μL底物(1 mg/mL p-NPP，pH 9.8)后于37 ℃避光反应20 min，加入50 μL终止液(0.5 mol/L NaOH)，采用多功能酶标仪在405 nm处测定OD值，选取数值高的单菌落在有机磷筛选培养基中划线纯化，重复3次后得到纯化后产高酶活碱性磷酸酶菌株。以纯菌株的单菌落为模板，用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增保守序列。PCR反应体系(50 μL)：5×PrimeSTAR^® GXL Buffer 10 μL，PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mixture 4 μL，引物27F/1492R (10 μmol/L)各1 μL，无菌双蒸水33 μL，模板用10 μL吸头蘸取单菌落在配制好的体系溶液中重悬。PCR反应条件：98 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 100 s，32个循环；68 ℃ 10 min。将扩增产物进行1%凝胶电泳检测后送测序，并将测序结果采用BLAST进行序列比对，使用MEGA 5.0构建系统发育树。

1.5.1 phoA基因克隆

分离菌株进行BLAST序列比对后，参考GenBank数据库中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HD15 (登录号为CP080508.1)的phoA基因设计扩增引物，通过SignalP 5.0信号肽预测工具预测phoA基因中信号肽片段并去除信号肽后，对无信号肽基因序列进行克隆引物设计，设计上游引物为：5′-CGCGGATCCGGAGCTGAGCTGCAGCAAAC-3′ (下划线处为BamH Ⅰ酶切位点)，下游引物为：5′-CCGCTCGAGTTTTCCAGTTTTTAAAATCTTAAATAT-3′ (下划线处为Xho Ⅰ酶切位点)。以复苏后的菌液为模板，采用PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase体系进行PCR扩增，PCR反应体系(50 μL)：模板为复苏后菌液2 μL，上述设计引物(10 μmol/L)各1 μL，无菌双蒸水31 μL，其余条件和程序参照1.4.2。扩增产物经1%凝胶电泳检测后切下含有目的条带的凝胶，使用OMEGA试剂盒进行凝胶回收DNA。回收产物以BamH Ⅰ/Xho Ⅰ为酶切位点与pET-28a(+)载体进行双酶切后转入到Escherichia coli BL21(DE3)中，在含50 µg/mL卡那霉素的LB平板中筛选阳性转化菌株，提取质粒进行测序鉴定。

1.5.2 PhoA蛋白的原核表达及纯化

将测序成功的阳性菌株低温(16 ℃)诱导表达18 h后，在4 ℃、6 000×g条件下离心5 min收集菌体，将菌体用10 mL浓度为0.05 mol/L、pH 8.5的Tris-HCl缓冲液重悬，使用超声破碎仪进行超声破碎(功率25%，工作5 s，间隔5 s，工作时长20 min)，将破碎菌体在4 ℃、12 000×g条件下离心10 min，得到ALP粗制酶液，将粗制酶液使用Ni Focurose FF (IDA)进行纯化，纯化后目的蛋白经SDS-PAGE鉴定后，使用Pierce^TM考马斯(Bradford)蛋白检测试剂盒测定纯化蛋白的浓度。

1.6.1 PhoA最适pH的测定

分别配制pH 8.0、8.5、9.0、9.5、9.8、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0的10%二乙醇胺溶液，分别加入终浓度1 mg/mL的p-NPP，溶解后作为底物备用。将1.5.2中纯化的蛋白液稀释到500 ng/mL，取100 μL蛋白液与50 μL底物，置于37 ℃下反应20 min，加入50 μL终止液(0.5 mol/L NaOH)，在405 nm处测定OD值。

1.6.2 PhoA底物最适孵育温度的测定

固定最适pH条件，其他条件不变，重复上述方法，加入底物后分别置于55、60、65、70、75和80 ℃，反应20 min，加入50 μL终止液，在405 nm处测定OD值。

1.6.3 不同浓度金属离子对PhoA活性的影响

在37 ℃条件下固定最适pH条件，在底物中分别加入终浓度为0‒25 mmol/L的Mg²⁺、0−7 mmol/L Ca²⁺和终浓度为0−0.7 mmol/L的K⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Fe²⁺与500 ng/mL的蛋白液反应20 min，加入50 μL终止液，在405 nm处测定OD值。

1.6.4 PhoA在37 ℃条件下的最大反应速率V_max、米氏常数K_m和催化常数k_cat的测定

配制pH 9.8的p-NPP底物，浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mmol/mL的底物，加入50 ng重组酶，在可控温多功能酶标仪下控温37 ℃，自动测定不同底物浓度下每分钟底物生成物的浓度，共测定20 min。结合吴梅芬等^[]、席宏波等^[]的酶促反应计算方法计算ALP的酶促反应速率，以底物浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算PhoA的最大反应速率V_max、米氏常数K_m和催化常数k_cat。

1.6.5 PhoA在最适条件下酶比活的测定

酶活力单位的定义：1个酶活力单位表示在最佳反应条件下，每分钟水解p-NPP产生1 μmol对硝基苯酚(p-Nitrophenol, p-NP)所需要的酶量为1个酶活力单位(U)；酶比活=酶活力(U)/蛋白质量(mg)。

标准曲线的绘制：用10%二乙醇胺缓冲液分别配制浓度为5、10、15、20、25、30 μmol/L的p-NP，在405 nm处测定OD值，绘制标准曲线。

将蛋白液稀释到50 ng/mL，取100 μL蛋白液与50 μL饱和底物在最适条件下进行反应，在405 nm处测定OD值，代入标准曲线中计算得出生成的产物浓度后测得酶比活，最后的结果取3组平行实验的平均值。

2.2.1 phoA基因克隆结果

以菌株35-16-1菌液为模板扩增其碱性磷酸酶phoA基因，扩增产物经琼脂糖核酸电泳鉴定后显示在约1 300 bp处有一与预期相符的条带。经BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切，与pET-28a(+)载体连接后转入E. coli BL21(DE3)，得到重组质粒pET-28a(+)-phoA。重组质粒经BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切后经过凝胶电泳鉴定，得到5 000 bp左右的空载体片段和1 300 bp的目的基因片段，如所示，重组质粒构建正确，测序后获得编码蛋白基因已上传至GenBank，登录号为PP240937.1，其推导的氨基酸序列与收录在GenBank中的phoA的相似性为98.15%‒100.00%。

2.2.2 PhoA蛋白的原核表达及纯化结果

将重组质粒转入到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，低温诱导表达破碎后得到粗酶液，并进行蛋白纯化，经SDS-PAGE鉴定后，表达后蛋白和纯化后蛋白均得到与预期53.1 kDa相符的条带()。纯化后的PhoA蛋白经Pierce^TM考马斯(Bradford)蛋白检测试剂盒测得浓度为161 μg/mL。

2.3.1 PhoA最适pH的测定结果

将浓度为500 ng/mL的蛋白液分别在pH 8.0、8.5、9.0、9.5、9.8、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0的底物下进行反应，结果显示pH 8.0‒9.8时PhoA酶活性逐渐升高，pH 9.8时酶活性到达顶峰，随着pH增大，酶活性降低，因此PhoA最适pH 9.8 ()。

2.3.2 PhoA底物最适孵育温度的测定结果

将浓度为500 ng/mL的蛋白液加入pH 9.8的底物后分别置于55、60、65、70、75和80 ℃条件下反应20 min后，结果显示，在55‒70 ℃时，酶活逐渐升高，在70 ℃处达到顶峰，超过70 ℃时酶活逐渐降低，因此PhoA最适温度为70 ℃ ()。

2.3.3 不同浓度金属离子对PhoA活性的影响结果

在pH 9.8的底物中分别加入不同浓度的金属离子，加入浓度为500 ng/mL的蛋白液反应后，结果如所示，Mg²⁺对PhoA呈激活作用，且当Mg²⁺浓度为14 mmol/L时，激活作用最大，Ca²⁺对PhoA呈抑制作用，K⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Fe²⁺对其无影响。

2.3.4 最大反应速率V_max、米氏常数K_m、催化常数k_cat和酶比活测定结果

在不同浓度下测定酶促反应速度，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，拟合曲线的线性回归方程为y=0.005 2+0.013 3x (r²=0.994 6)，计算V_max为179.86 μmol/(L·min)，米氏常数K_m为2.38 mmol/L，催化常数k_cat为246.83 s⁻¹，酶比活为6 550.00 U/mg。