在发育早期的单眼剥夺会导致弱视，这是一种严重的视力损伤。如果在早期关键期之后才开始治疗，预后不良。然而，临床观察表明，当非剥夺眼（健眼）被移除时，弱视在生命后期也可能恢复。对这一发现的传统解释是，通过解除初级视皮层的眼间抑制来改善视力。然而，另一种解释是，消除健眼的活动会在视皮层中创造条件，使来自弱视眼的微弱连接得以增强。在此，我们通过对猫和小鼠的研究表明，在常规治疗无效的年龄阶段，暂时抑制健眼足以促使弱视完全且持久地恢复。因此，服务于弱视眼的连接在关键期之后仍具有相当大的可塑性，而这种潜力可通过可逆性抑制健眼来释放。
一、介绍
弱视是一种在婴儿期出现的常见视觉障碍，当双眼输入到视觉皮层的信号不平衡时就会出现。弱视最常见的原因是斜视和屈光不正，但最严重的形式——形觉剥夺性弱视——是由视力的浑浊或阻塞（例如白内障）引起的。目前的标准治疗是恢复视力的清晰度（例如通过白内障摘除）和聚焦，然后通过暂时遮盖对侧眼来促进弱视眼的恢复。然而，遮盖疗法的效果受到依从性差、恢复结果不稳定以及复发风险较高的限制。此外，如果在10岁之后或在形觉剥夺性弱视的情况下在生命的第一年之后开始治疗，遮盖疗法的效果会大打折扣。改善弱视治疗的必要性得到了广泛认可。
数十年来在猫和猴子上的研究表明，短暂的单眼剥夺（MD）会在初级视觉皮层（V1）引发一系列变化，从而降低通过被剥夺眼的视力。与人类一样，这些变化可以通过暂时遮盖对侧眼来逆转，但这种操作的有效性同样仅限于一个短暂的关键期。啮齿动物已成为研究弱视突触基础的主要动物模型，一个重要的最新发现是，多个实验室发现，多种操作（最终都导致皮层中间神经元的抑制作用降低）可以让动物在超出传统定义的关键期之后从MD的影响中恢复。尽管这些结果令人兴奋，然而，大多数在小鼠和大鼠中用于促进成年恢复的操作在人类中的应用性有限。有些在治疗环境中不可行（例如中间神经元移植），有些需要全身暴露于对视觉皮层以外也有作用的药物（例如胆碱酯酶抑制剂和氯胺酮），而且到目前为止，没有任何一种操作在人类研究中显示出临床疗效（例如氟西汀、西酞普兰、左旋多巴、多奈哌齐）。事实上，一些在啮齿动物中效果显著的治疗方案在其他视觉系统更分化的物种（如猫）中研究时却得到了令人失望的结果（例如。现在人们认识到，仅限于单一物种（特别是视觉系统原始的鼠类）的研究可能是不可靠的人类弱视治疗指南。
在本研究中，我们采取了“从临床到实验室”的视角。在人类临床文献中有一个有趣的观察结果，即在成年时，当正常（对侧）眼因受伤或疾病而受损或被摘除（眼球摘除）时，弱视有时可以显著恢复。在猫和猴模型中的类似发现被解释为意味着弱视的一个促成机制是对侧眼的活动持续抑制对被剥夺眼的反应。然而，另一种假设是，通过眼球摘除消除强眼的活动会导致突触可塑性的属性发生稳态调整，从而使弱视眼的经验能够推动突触的强化。如果这个观点是正确的，那么仅仅暂时使对侧眼沉默就足以实现持久恢复。因此，“消除抑制”假设预测，通过暂时沉默对侧眼可以立即减轻弱视，但这种效果仅在该眼处于不活跃状态时持续，而“突触强化”假设预测恢复将逐渐出现并且会超出视网膜失活的时期。我们在两个物种（小鼠和猫）中进行了实验，以区分这些替代方案。我们的结果表明，在长期MD之后，暂时使对侧眼失活可以永久恢复双眼的视力。
二、结果
2.1 临时单眼失活增强小鼠V1中非失活眼的反应
我们首先研究了在神经发育正常的小鼠中，临时视网膜失活对视觉刺激引起的皮层反应的影响。实验从出生后第47天（P47）开始，这一时间点已超出关键期。我们在清醒且头部固定的动物的V1第4层植入记录电极，测量基线视觉诱发电位（VEPs）（图1A-B，S1）。与以往研究一致，在基线条件下，对侧眼刺激引起的反应大约是对侧眼的两倍（图1C-D）。随后，我们使用电压门控钠通道阻断剂河豚毒素（TTX）注入玻璃体腔，使对侧视网膜失活1-2天。在失活期间，对失活对侧眼的刺激反应可预测地降至噪声水平（图1C）。与此同时，对非失活的对侧眼刺激的反应显著增强（图1D）。随着TTX作用的消退和视网膜活动的恢复，我们继续跟踪对侧眼和对侧眼的VEPs数天。即使在一周后，非失活眼的反应仍显著高于基线水平（图1D-E）。重要的是，对侧眼刺激的反应恢复到基线水平（图1C，E），表明失活眼的反应性没有长期下降。这些结果表明，去除优势眼的影响会立即增强非优势眼的反应，这与双眼间抑制一致。此外，数据还表明，短暂的单眼视网膜失活也为非失活眼的反应提供了长期增强的条件。这些反应在失活期之后仍保持增强状态，且对失活眼没有长期影响。
图1.单眼视网膜的临时失活增强了清醒、青春期小鼠中非失活眼的视觉刺激反应。(A) 显示小鼠大脑中V1b的记录点和对侧眼TTX注射点的示意图。(B) 实验时间线，显示眼部操作和VEP记录会话的时间。(C) 对侧、失活眼刺激的VEP幅度的纵向测量。填充条表示平均峰-谷振幅，空心圆表示每个生物学重复。每个时间点上方显示了平均VEP波形。星号表示与基线记录相比VEP幅度的显著差异（P<0.05）。分析使用单因素重复测量方差分析（F=12.85, P=0.0013），随后进行Dunnett多重比较检验（与基线相比：1小时，P<0.0001；1天，P=0.887；2天，P=0.6037；4天，P=0.2974；7天，P=0.000）。(D) 与C相同，为非失活的对侧眼。分析使用单因素重复测量方差分析（F=9.381, P=0.0082），随后进行Dunnett多重比较检验（与基线相比：1小时，P<0.0001；1天，P=0.0638；2天，P=0.0111；4天，P=0.0218；7天，P=0.0148）。(E) VEP幅度随时间的变化，以基线为标准进行归一化。蓝色曲线表示失活的对侧眼；黄色曲线表示非失活的对侧眼；空心圆表示平均值；误差条表示标准差；蓝色和黄色星号分别表示与假设值100%相比的显著差异（P<0.05）。分析使用单样本t检验（对侧眼：与基线相比：1小时，P<0.0001；1天，P=0.7475；2天，P=0.2730；4天，P=0.0078；7天，P=0.7858）和单样本Wilcoxon检验（对侧眼：与基线相比：1小时，P=0.0078；1天，P=0.0078；2天，P=0.0156；4天，P=0.0158；7天，P=0.0150），检验方法的选择基于Shapiro-Wilk正态性检验的结果。图中所有数据均为0.2周期/度空间频率的相位反转正弦光栅刺激的结果。
2.2 对侧眼失活促进小鼠V1中长期单眼剥夺后的稳定恢复
接下来，我们研究了在弱视动物中，对侧眼的临时失活对视力的影响。为了模拟形觉剥夺性弱视，我们让小鼠在幼年眼优势可塑性的经典关键期达到高峰时开始接受长期单眼剥夺（MD），并持续两周至关键期结束（P26-47）。为了评估对侧眼失活在弱视小鼠中的影响，我们在打开单眼剥夺眼后立即监测来自V1的VEPs，然后在对非剥夺眼进行单次玻璃体腔TTX注射后数周继续监测（MD后TTX组；图2A）。同窝对照小鼠被分配到另外两组：一组接受3周MD后对侧眼生理盐水注射（MD组），另一组接受假眼睑缝合/重新打开后对侧眼生理盐水注射（假手术组）。在所有情况下，被剥夺（或假剥夺）眼与记录电极对侧，而被注射的非剥夺对侧眼与记录电极同侧。在打开被剥夺眼后，接受MD的两组小鼠的被剥夺对侧眼VEPs均明显受到抑制，反应幅度约为假手术对照组观察到的一半（图2B-C）。对这些动物进行长期跟踪发现，在接受对侧眼生理盐水注射的假手术或MD小鼠中，对侧视觉反应性在数周内几乎没有变化，证实了视觉缺陷的稳定性。然而，接受MD后对侧眼TTX注射的小鼠显示出被剥夺眼反应的显著增加（图2B），其值与假手术对照组相当（图2C）。对侧眼反应恢复到正常水平是稳定的，持续数周（图2B-C），并且在一系列空间频率上发生（图2D，表S1A）。这些结果表明，对侧眼的临时失活促进了V1中弱视眼反应的快速、完全且看似永久的恢复。
我们还测量了对非剥夺对侧眼刺激的V1反应（表S1B）。在打开被剥夺眼后，通过非剥夺对侧眼的反应幅度略高于假手术动物（图2E-G），这与在啮齿动物V1中记录良好的非剥夺眼反应增强一致。非剥夺对侧眼的初始反应增强在重新打开被剥夺眼后的几周内恢复到假手术水平（图2E-G）。这些结果表明，与MD后观察到的被剥夺眼的稳定反应抑制不同（图2B-D），MD后对侧眼反应的增强似乎是短暂的。此外，无论是否接受治疗，非剥夺对侧眼反应随时间的轨迹不受该眼短暂视网膜失活的影响；在重新打开被剥夺眼后的几周内，反应完全恢复，与假手术对照组无法区分（图2E-G）。这些结果共同表明，在小鼠接受弱视饲养后，超出幼年敏感期开始的对侧眼失活促进了双眼正常视力的恢复。
2.3 反向遮盖促进小鼠V1中长期单眼剥夺后的短暂恢复
弱视的标准治疗是在婴儿和幼儿中暂时遮盖对侧眼以促进弱视眼的视力。在动物模型中，这可以通过反向遮盖（RO）来模拟，即在单眼剥夺期后暂时缝合对侧眼。反向遮盖会降低对图案刺激的视觉反应，但不会消除神经节细胞活动。
为了直接比较对侧眼失活和反向遮盖对弱视视觉皮层的影响，我们将同窝小鼠接受长期MD，然后要么短暂失活，要么缝合关闭对侧眼1周（图3A）。我们通过在RO组中使用生理盐水注射和在TTX组中使用假眼睑缝合/打开来控制注射和眼睑缝合的效果。这些实验重复了对侧眼单次TTX注射促进被剥夺眼反应恢复的发现，这种恢复在许多周内是稳定的，并且在一系列空间频率上发生（图3B-D，表S2A）。有趣的是，1周的RO也导致通过最初被剥夺的眼的反应增强。然而，与对侧眼失活不同，RO后观察到的增益是短暂的，并随着时间的推移而消散，这可能是因为开始的年龄（P47）。对侧眼刺激的反应在打开被剥夺眼后立即增强，并在随后的几周内减弱（图3E-G，表S2B）。治疗组之间对侧眼反应幅度没有显著差异。这些结果共同表明，青少年小鼠中由RO驱动的可塑性是短暂的，而由对侧眼失活驱动的恢复是持久的。
图3.反向遮盖改善了长期单眼剥夺后的被剥夺眼视力，但恢复并不持久。(A) 实验示意图和时间线，比较3周单眼剥夺后对侧眼失活与反向遮盖的效果。(B-G) 与图2B-G相同格式，但针对两个同窝处理组。MD后TTX组：对侧眼P26-47缝合，P47对侧眼TTX注射+假缝合，P54假重新打开；MD后RO组：对侧眼P26-47缝合，P47-54对侧眼生理盐水+反向遮盖。MD后TTX组在C-D中为蓝色，在F-G中为黄色。MD后RO组在C-D中为灰色（虚线），在F-G中为灰色。除非另有说明，图中所有数据均为0.2周期/度空间频率的相位反转正弦光栅刺激的结果。B和E中的分析使用了两因素重复测量方差分析（对侧眼，处理×时间，F(4,108)=8.363, P=0.0001；对侧眼，处理×时间，F(4,108)=1.474, P=0.2152）。对侧眼的显著交互作用促使进行Dunnett多重比较检验（MD后TTX，0周与1、2、3、4周：P=0.0057, 0.0065, 0.0437, 0.0042；MD后RO，0周与1、2、3、4周：P=0.0035, 0.4119, 0.5738, 0.9831）。C中的分析也使用了Dunnett事后检验（MD后TTX与MD后RO在0周和1周：P=0.9999；在2、3、4周：P=0.5361, 0.5448, 0.0004）。D中的分析同样使用了Dunnett事后检验（0周，MD后TTX与MD后RO在0.05、0.2、0.4周期/度：P=0.9917, 0.0989, 0.9908；1周，MD后TTX与MD后RO在0.05、0.2、0.4周期/度：P=0.9995, 0.9980, 0.8989；4周，MD后TTX与MD后RO在0.05、0.2、0.4周期/度：P=0.0041, 0.0004, 0.0255）。
2.4 对侧眼失活促进猫V1中长期单眼剥夺后的稳定恢复
接下来，我们在猫中评估了对侧眼失活作为一种潜在的弱视治疗方法。猫是奠定关于眼优势可塑性和弱视发病机制大部分已知知识基础的物种。我们通过非侵入性方式在V1记录脑电图，同时使用一系列空间频率的相位反转光栅刺激进行单眼观察（图4A）。通过计算2 Hz相位反转频率及其接下来的六个谐波的总功率来量化视觉刺激的反应（图4B）。我们将这些与偏离2 Hz基频及其谐波0.45 Hz的控制频率的总功率进行比较。如预期的那样，呈现的最低空间频率（0.05 cpd）引发了最大的反应。通过这种方法，我们能够可靠地检测到高达0.5 cpd空间频率的刺激反应（图4C），其反应曲线与时域VEP分析相似（图S2）。
图4.对侧眼失活促进猫在长期单眼剥夺后功能和结构的稳定恢复。(A) 在猫中非侵入性测量视觉诱发电位的记录和视觉刺激设置。(B) 从头皮表面场电位计算视觉诱发电位的方法。左侧，V1在呈现一系列空间频率的相位反转视觉刺激时记录的场电位时间序列。灰色线条表示相位反转的时间。右侧，左侧数据经过离散傅里叶变换后的频域表示。蓝色箭头指向2赫兹（相位反转频率）及其六个谐波的功率峰值，代表视觉诱发电位。黑色箭头指向用于控制功率测量的频率。(C) 视觉驱动（相位反转）频率及其谐波（蓝色）与控制（黑色）在一系列空间频率上的总功率。值来自B中显示的相同记录。(D) 实验操作和记录会话时间的时间线。(E) 一只动物（C474，右V1）通过被剥夺的左眼（蓝色）与对侧右眼（黄色）观看视觉刺激时视觉诱发电位的总功率。箭头表示TTX注射的时间。误差条表示标准误。空间频率为0.1周期/度。(F) 同一只动物在E中所示的被剥夺左眼（蓝色）和对侧右眼（黄色）在对侧眼TTX失活前（上）、失活中（中）和失活后（下）的视觉驱动反应的总功率。黑色符号表示控制频率，如C中所示。(G) 4只猫在MD前、MD后（但失活前）、失活期间以及对侧眼不再失活后的眼优势指数。数据分别显示为右（闭合圆圈）和左（开放圆圈）V1。正值和负值分别表示对左眼和右眼的反应偏向，而虚线0表示正常动物预期的平衡V1反应。作为参考，C474的右半球指数是从E中显示的数据计算得出的。星号表示与假设值0的显著差异（P<0.05），使用Wilcoxon符号秩检验进行分析（MD前，P=0.9453；MD后，P<0.0001；对侧眼失活，P<0.0001；TTX后，P=0.8236）。(H) 左侧，3周MD后（上）或3周MD后对侧眼失活（下）的LGN经尼氏染色的低倍图像。箭头表示与被剥夺眼同侧的A1层。中间和右侧，相同条件下被剥夺（中间）和非剥夺（右侧）A1层的高倍图像。(I) 剥夺效应，对正常饲养的猫、接受3周MD的猫以及接受3周MD后对侧眼失活的猫的被剥夺和非剥夺A和A1层内神经元细胞体大小的立体学量化。星号表示与假设值0%的显著差异（P<0.05），使用单样本t检验进行分析（正常，P=0.1917；MD，P=0.0100；MD后TTX，P=0.5716）。(J) 与接受3周MD后对侧眼失活的猫相比，正常饲养动物的被剥夺左眼（L）或对侧右眼（R）下游的LGN层内神经元细胞体的平均大小。两组之间没有显著差异（Welch方差分析，W=1.426, P=0.2881）。开放和闭合符号分别表示来自A1和A层的值。黑色线条表示每组的平均值和标准误。
我们对接受3周MD的猫进行了纵向跟踪，直至P51，这一年龄时反向遮盖在逆转MD的影响方面效果甚微。在确认被剥夺眼的视觉反应性稳定丧失后，我们使用玻璃体腔TTX在8-10天内实现对侧眼失活（图4D-F）。如预期的那样，在MD之前，所有猫对任一眼的刺激都有平衡的反应，而MD后这种平衡被强烈打破（图4G，S3），这是由于被剥夺眼刺激的反应减弱（图4E-F）。在四只动物中的三只中，我们在开始失活前允许1-2周的双眼视觉，并验证了被剥夺眼反应的损害是稳定的。在失活期间，对侧眼的反应降低到控制频率和灰屏值的水平，如预期的那样（图4F）。与此同时，对先前被剥夺（未失活）眼的刺激反应逐渐增强（图4E-F）。在TTX作用消退后，对侧眼的刺激反应恢复，我们再次观察到对两眼刺激的平衡V1反应，这种平衡在许多周内持续存在，没有退化的迹象（图4E-G，S3）。这些观察结果在所有四只动物中是一致的（图4G），在高达0.5 cpd的检测极限空间频率上（表S3），并且对于在最老的出生后年龄（P65）接受对侧眼失活的动物，其疗效没有明显的下降（图4E-F，S3A；表S3A）。死后分析证实所有动物的眼睛组织学正常，与之前的观察一致。这些结果表明，在猫接受弱视饲养后，对侧眼失活促进了V1中双眼下游的平衡恢复，并且这种干预在超出先前确定的逆转敏感期的年龄也是有效的。尽管没有进行定量行为评估，但对小猫的定性观察明确显示，视力和视觉引导的行为通过治疗得到了恢复。
2.5 对侧眼失活纠正猫dLGN中单眼剥夺的解剖学影响
在猫和灵长类动物中，来自双眼的输入分布在背外侧膝状体（dLGN）的不同层中。在这些高度视觉化的物种中，单眼剥夺的一个解剖学标志是dLGN神经元大小在被剥夺眼下游的层中缩小，这一现象与眼优势柱的收缩有关，并依赖于V1中的突触修饰。为了探索对侧眼失活对眼优势可塑性解剖学标志的影响，我们将接受3周MD后对侧眼失活的三只猫的dLGN细胞大小的死后分析与年龄匹配的对照组进行了比较。仅接受MD的动物显示出与双眼部分的非剥夺层相比，被剥夺层的dLGN细胞经典性缩小（图4H-I）。相比之下，接受MD后又接受对侧眼失活的猫显示出被剥夺和非剥夺dLGN层的细胞大小相当（图4H-I）。重要的是，这并不是由于双眼下游的细胞萎缩所致，因为接受对侧眼失活的动物的细胞大小与正常饲养的对照组无法区分（图4J）。这些结果为对侧眼失活逆转猫视觉通路中眼优势可塑性的解剖学相关性提供了证据，除了从MD中恢复的生理学恢复外（图2B-G，3B-G，4E-G，S3；表S3）。
三、材料和方法
3.1 小鼠研究
实验动物：使用C57BL6/N背景的野生型雄性和雌性小鼠进行实验。动物从Charles River购买，用于实验或作为繁殖群的一部分饲养在麻省理工学院（MIT）。断奶后（P21），后代被分组饲养，每组2-5只同性别同窝小鼠，保持12小时光照-12小时黑暗的周期。所有记录均在光照周期内进行。食物和水自由供应。饲养和实验程序均按照MIT动物护理委员会批准的协议进行，并符合美国国立卫生研究院和实验室动物护理评估与认证协会的指导方针。
实验设计：所有实验中，慢性电极植入手术在P40至P44之间进行，小鼠在P42至P46之间的两天分别适应头部固定和单眼灰屏观察。在单眼失活实验（图1）中，基线记录完成后，对记录电极对侧眼进行玻璃体腔TTX注射。注射后1小时、24小时、48小时、4天和7天进行记录。在单眼剥夺（MD）实验（图2-3）中，P26进行眼睑缝合（或假缝合）。剥夺眼在P47重新打开（或假重新打开），首次从V1进行电生理记录在重新打开后45分钟进行。首次记录后不久，动物接受对侧眼的玻璃体腔TTX或生理盐水注射，部分实验中进行反向遮盖（RO）或假RO。此后每周进行一次记录，直至P75。所有记录均在不知情的条件下进行，每组同窝小鼠每周由同一位实验者处理。实验结束后，小鼠被安乐死，大脑和眼球被取出用于死后分析。为了被纳入最终数据集，小鼠需要满足以下所有预先确定的纳入标准：在整个实验期间保持良好的健康状态；在MD和RO期间眼睑完全闭合；基线时至少通过一只眼睛可检测到大于噪声的视觉诱发电位（VEP）；角膜、视网膜和眼球各部分健康且完整；电极轨迹在双眼V1的第4层内可观察到；至少有另一只同性别同窝小鼠被纳入其他实验组。
眼睑缝合：通过吸入异氟醚（1-3%）麻醉动物，体温维持在37°C的加热表面上。双眼用无菌生理盐水湿润。对于单眼剥夺和反向遮盖，首先缝合的眼球，其上下眼睑的毛被修剪，眼球表面用无菌生理盐水冲洗。在眼上涂抹一层含有杆菌肽、新霉素和多粘菌素的眼药膏。使用7-0 Prolene聚丙烯缝线进行单个褥式缝合，闭合眼睑，注意不要接触角膜表面，并在下眼睑外侧打结。在缝线针穿过眼睑的地方涂抹眼药膏。前爪的指甲被锉平或轻微修剪。对于假缝合，缝线在关闭麻醉前被剪断并移除。3周后（MD）或1周后（RO）拆除缝线，小鼠被麻醉并保持如前所述的状态。剪断并移除缝线，轻轻分开眼睑。用无菌生理盐水冲洗角膜表面，并检查是否有损伤。假手术动物被麻醉，放在与MD和RO动物相同时间的明亮显微镜下，并对其假MD或RO的眼球进行冲洗。动物在各自的笼子里从MD、RO和眼睛睁开的程序中恢复。
玻璃体腔注射：小鼠用异氟醚麻醉，保持在37°C，并如眼睑缝合所述湿润双眼。对于注射眼，在眼的颞侧角做一个约500纳米的切口，将一根无菌的7-0丝线穿过暴露的巩膜。将缝线拉向鼻侧以固定眼球并暴露眼球的颞侧。使用30号针头穿透巩膜和眼球。在将玻璃微吸管插入玻璃体腔之前，用无菌生理盐水冲洗眼睛。使用纳升注射器注入1微升的TTX（1 mM，柠檬酸缓冲液）或生理盐水。注射后1分钟移除微吸管。用无菌生理盐水冲洗眼睛，并在穿刺点涂上含有杆菌肽、新霉素和多粘菌素的眼药膏。动物在各自的笼子里从玻璃体腔注射中恢复。
V1植入手术：术前皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg），随后小鼠被麻醉（1-3%异氟醚）并保持在37°C。对双眼（或缝合闭合的眼睑表面）涂抹眼药膏。剃掉头顶的毛发，用70%乙醇和10%聚维酮碘溶液清洁暴露的头皮。沿中线切开，移除颅骨表面的结缔组织。在Bregma前方固定一个钢柱。在右前额叶皮层上方进行颅骨切开，用于在皮层表面植入银丝参考电极。另一个颅骨切开在双眼V1上方（Lambda侧3毫米），与单眼剥夺（或假MD）眼对侧，将钨微电极（300-500 kΩ；FHC 30070）降低到第4层（从皮层表面450微米）。钢柱和连接电极的雄性金插头用氰基丙烯酸酯固定在颅骨上。然后用牙科水泥（Orthojet）覆盖颅骨。动物从麻醉中移除并转移到加热的恢复室。在初始恢复阶段以及术后2天内皮下注射美洛昔康（1 mg/kg）。实验者和兽医人员仔细监测健康状况，如有需要，提供补充液体或热量。
电生理记录：所有小鼠记录均在清醒、头部固定的小鼠中进行，全屏视觉刺激呈现在双眼视野内的LCD显示器上，观看距离为20厘米。在初次记录前一天，动物适应头部约束、灰屏观察和限制一只眼睛或另一只眼睛视野的不透明遮挡器。在每个记录日，从双眼V1的第4层记录局部场电位（LFP）数据，每只眼睛的视觉刺激会话持续13.5分钟。连续LFP数据被收集、放大、数字化并低通滤波，使用Recorder-64系统（Plexon）。除了视觉刺激外，实验室内保持黑暗且无干扰（例如，实验者或其他小鼠在记录期间不在室内）。使用MATLAB编写并使用PsychToolbox扩展的自定义软件生成刺激，包括以2赫兹相位反转的正弦方向光栅。刺激以块的形式呈现，每个空间频率（0.05、0.2、0.4周期/度）的50次相位反转，对比度为100%，伪随机呈现。每块刺激之间间隔30秒，呈现与亮度匹配的灰屏。每周使用不同的方向（与之前观看的方向偏移30°），且仅选择非主方向进行呈现。所有记录均在不知情的条件下进行。
电生理数据分析：VEP被定义为相位反转触发的LFP，在每个记录会话中，对每只动物、每个时间点和每只眼睛的所有相位反转进行平均。从记录的LFP数据中提取VEP波形和振幅。VEP幅度被定义为每个双相VEP波形的峰-谷振幅。使用中等空间频率（0.2周期/度）的数据进行可视化，但较低和较高的空间频率数据见补充表S1-2。
死后分析：小鼠用异氟醚深度麻醉并迅速断头。取出双眼进行即时眼部检查和在磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖。在显微镜下检查角膜是否有损伤迹象，随后解剖眼球以寻找异常，特别是晶状体或视网膜的异常。同时，取出大脑并固定在室温下的4%甲醛溶液中。组织在固定液中保持72小时，然后储存在PBS中。使用振动切片机将V1切成50微米厚的冠状切片。切片用蒸馏水和磷酸盐缓冲液冲洗，然后安装在带电的玻璃载玻片上。安装的切片在室温下和环境湿度中干燥24小时。然后用甲苯蓝对尼氏体进行染色，并用1.5玻璃和基于甲苯的封片介质封片。切片在共聚焦显微镜上使用透射光通道成像，并保存电极轨迹的数字显微照片。将显微照片与小鼠脑图谱进行比较，以确定电极轨迹在双眼V1第4层的定位。所有描述的分析均在不知情的条件下进行。
3.2 猫研究
生理和解剖研究：在达尔豪斯大学封闭繁殖群中出生和饲养的9只雄性和雌性猫上进行。饲养和实验程序均按照达尔豪斯大学实验室动物委员会批准的协议进行，并符合加拿大动物护理委员会的指导方针。
实验设计：动物在关键期高峰（P30）开始进行为期三周的单眼剥夺。四只接受生理评估的动物在剥夺眼睁开后立即（C475）或在1周（C476, C479）或2周（C474）的双眼视觉后，对对侧眼进行4-5次玻璃体腔TTX注射。动物在实验时间线的各个时间点进行脑电图记录。三只动物（C474, C475, C476）在约P110时被安乐死，组织被取出用于解剖分析。另外两组动物作为对照组进行解剖评估。第一组对照组（n=3）正常饲养至14周龄，然后在右眼接受5次溶剂溶液（柠檬酸缓冲液）注射。第二组对照组（n=3）在P30进行三周的单眼剥夺。
眼睑缝合：在3-4%异氟醚吸入麻醉下进行单眼剥夺，涉及用无菌聚乳酸910线（Vicryl）缝合左眼的上下眼睑结膜，然后用丝线缝合眼睑。手术后，动物接受美洛昔康（0.05 mg/kg）用于术后镇痛，用1%丙帕他莫盐酸盐进行局部麻醉，并使用1%氯霉素进行广谱局部抗生素治疗，以减轻术后感染。
玻璃体腔注射：完成3周MD后，动物被3-4%异氟醚麻醉，打开眼睑。在双眼视觉期间或立即，动物的对侧眼通过玻璃体腔注射TTX（ab120055）失活，TTX溶于3 mM柠檬酸缓冲液。剂量为0.5微升/100克体重，但无论体重如何，注射体积不超过10微升。该剂量阻断受影响细胞的动作电位，而不阻断如快速轴浆运输等关键细胞功能。通过一次性无菌针头在巩膜上穿一个小孔，位于锯齿缘处。使用手术显微镜，用固定在30号针头（尖端样式4）上的无菌汉密尔顿注射器将测量体积的TTX溶液注入玻璃体腔。注射针头穿过原始穿刺点，进入腔室约5-10毫米，远离晶状体。缓慢注入全部体积的TTX溶液，完成后将针头保持原位约一分钟，然后拔出。在玻璃体腔注射后，对眼睛应用局部抗生素（1%氯霉素）和麻醉剂，以防止注射后并发症，并给予美洛昔康（0.05 mg/kg）用于术后镇痛。动物接受4-5次注射，每48小时一次，每次注射使用原始穿刺点以避免再次穿孔。在失活期间，我们采用基本的视觉行为评估和VEP测量来确认失活。我们验证了瞳孔光反射的缺失以及诸如视觉定位、视觉惊吓和跟踪移动激光点等视动行为的缺失。这些评估在非注射眼的视野被短暂遮挡时进行，使用不透明的隐形眼镜。
电生理记录：所有猫的记录均在麻醉状态下进行，全屏视觉刺激呈现在双眼视野内的LCD显示器上，观看距离为70厘米。在每次记录前，动物被1-1.5%异氟醚麻醉，并通过肌肉注射提供额外的镇静剂，包括醋酸丙嗪（0.06-0.1 mg/kg）和布托啡诺（0.1-0.2 mg/kg）。修剪头部毛发，并使用一次性剃刀剃除记录点的头皮部分，两个点位于左右初级视觉皮层上方，大约在双耳零点后2-8毫米、侧1-4毫米处，另一个点位于额叶中线上作为参考。使用Nuprep EEG皮肤准备凝胶处理电极点，然后用酒精棉球清洁。使用Ten20 EEG导电膏将可重复使用的10毫米金杯Grass电极固定在每个电极点上。测量记录电极与参考电极之间的阻抗，以确保每个电极的值低于5 kΩ。电生理信号通过Intan头部放大器（RHD2132；20 kHz采样频率）放大和数字化，然后使用Open Ephys采集板和GUI软件（Open Ephys, USA）进行记录。使用MATLAB开发的自定义软件生成刺激，包括全对比度方波光栅，对比度反转频率为2赫兹。不同空间频率（0.05、0.1、0.5、1和2周期/度）的光栅刺激块或亮度匹配的灰屏以伪随机顺序呈现，每个持续20秒，灰屏在2秒的刺激间隔中显示。每个块重复至少6次。每只眼睛分别测试，通过在记录期间在另一只眼睛前放置一个黑色遮挡器。使用小眼睑撑开器保持眼睛睁开，并频繁使用保湿滴眼液润滑眼睛。记录会话持续约1小时，动物行为在记录后至少观察1小时，以确保完全恢复。
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电生理数据分析：将原始脑电图导入MATLAB，高通滤波高于1赫兹，然后进行傅里叶分析。VEP的幅度计算为刺激基频加6个额外谐波（2-14赫兹）的功率之和。非视觉基线活动计算为视觉响应偏移0.2赫兹的频率（2.2-14.2赫兹）的功率之和。使用MATLAB的EEGLab和ERPLab工具箱进行EEG数据的平行分析。数据经过带通滤波、分段和归一化，以提取时间域VEP分析的事件相关电位。使用频率域和时间域分析的响应曲线相似（图4C, S2B），但在MD后和失活期间VEP峰值潜伏期和极性的变化使得频率域分析成为纵向比较的更实用选择。眼优势指数计算为（L-R）/（L+R），其中L是通过左（剥夺）眼的平均总功率，R是通过右（对侧）眼的平均总功率。使用中等可检测空间频率（0.1周期/度）的数据进行可视化，但较低和较高的空间频率数据见补充表S3。
组织学分析：准备组织学分析时，动物被致死剂量的戊巴比妥钠（Pentobarbital Sodium; 150 mg/kg）安乐死，随后通过心脏灌注约150毫升磷酸盐缓冲液（PBS），然后是等体积的含4%溶解甲醛的PBS。立即取出脑组织，并从大脑中解剖出丘脑，以准备LGN进行切片和组织学处理。含有LGN的组织经过冰冻保护，然后使用滑动切片机切成25微米厚的冠状切片。将部分切片安装在玻璃载玻片上，并用1%尼氏溶液染色，然后用封片介质（Permount）封片。使用计算机化立体学系统（newCAST）的核探针从尼氏染色切片中测量左、右LGN A层和A1层内神经元细胞体的横截面积。所有测量均使用BX-51复合显微镜和60X油浸物镜进行。使用既定选择标准区分神经元和胶质细胞，包括测量细胞具有深色细胞质和核仁染色，以及浅色核染色。遵循这些标准可以避免细胞帽，并仅包括通过细胞体中线切割的神经元。每只动物大约测量500-1000个神经元。对于每只动物，使用每个LGN层的平均细胞体大小计算眼优势指数：（（左A1+右A）-（左A+右A1））/（左A1+右A），这表明双眼特异性层之间的百分比差异。
3.3 统计分析
使用Prism（GraphPad）进行统计分析。使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，结果用于确定是否进行参数或非参数检验。还计算了所有数据集的方差，用于确定是否选择假设等方差的检验。与噪声水平（满足纳入标准）的比较使用配对t检验（参数）或Wilcoxon符号秩检验（非参数）。与假设均值（例如归一化数据）的比较使用单样本t检验（等方差）或Welch方差分析（不等方差）。对于单组在时间上的均值差异分析，使用具有Geisser-Greenhouse校正的单因素重复测量方差分析。对于多组在时间上的均值差异分析，使用具有Geisser-Greenhouse校正的两因素重复测量方差分析。对于两种重复测量方差分析检验，仅在存在显著时间效应（单因素）或显著交互作用（两因素）时进行事后Dunnett检验。显著性水平α设定为0.05，如有必要，在与α比较之前对P值进行多重比较调整。所有P值均在图例中报告。
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