01、实验材料
• 冻存的HCT-116细胞（人结肠癌细胞系：ATCC，CCL-247）
• 适宜的细胞培养基
• T75细胞培养瓶（Greiner，658175）
• InSphero Akura PLUS Hanging Drop System
• 无菌PBS缓冲液（无钙镁离子）（Sigma-Aldrich，D1408）
• 胰酶
• 70%乙醇
• 血球计数板
• 水浴锅（设置在37℃）
• 血清移液管（5ml和10ml）
• 离心机
• 一级生物安全柜
• 二氧化碳培养箱（设置在5% CO2浓度和37℃）
• 倒置显微镜
• 15ml无菌离心管
02、HCT-116细胞的扩增
注意：所有实验步骤遵照无菌操作规范在生物安全柜中操作。
1. 确保所有细胞培养基标记清晰并在正确的条件下存放。
2. 将培养基预热至37℃。
3. 向T75中加入5ml预热的培养基。
4. 在水浴锅中快速融化细胞。
5. 使用血清移液管吸取5ml预热的培养基，并于融化的细胞混合，将混匀液转移至15ml离心管中。
6. 室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用5ml预热培养基重悬细胞。
7. 将细胞转移至T75中。
8. 将T75转移至二氧化碳培养箱中。
9. 培养24h后，更换培养基，并在显微镜下检查细胞贴附情况。
03、制备单细胞悬液
1. 将培养基预热至37℃。
2. 将T75从二氧化碳培养箱中取出，使用血清移液管弃去培养基。
3. 向T75中加入10ml的PBS。
4. 轻轻摇晃培养瓶后弃去PBS。
5. 加入1ml的胰酶（1x），于37℃孵育5min。
6. 加入9ml的完全培养基（含FBS）终止消化。
7. 将细胞液转移至15ml离心管。
8. 室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用适量（取决于细胞压积）预热培养基重悬细胞。
9. 使用血球计数器（或其他细胞技术方法）进行计数。
04、3D细胞模型的构建-悬滴形成
1. 拆开包装之前，用70%乙醇擦拭Akura PLUS板袋；
2. 无菌条件下打开袋子，取出Akura PLUS板；
3. 向直径15cm的培养基中加入20ml 浓度为0.5% 的PBS溶液，将加湿垫放入0.5%PBS中浸湿（约5min）。
4. 将加湿垫放入到加湿槽中，并加入12ml的0.5% PBS。
6. Akura PLUS板放置在5% CO2，37℃恒温孵育箱中培养。
注意：请小心移动Akura PLUS板，以避免悬滴滴落。
05、细胞微球转移
为了长期培养和实验分析，需要把悬滴从Akura PLUS板中转移至Akura 96孔微球培养板中进行培养。
• Akura 96 Spheroid Microplate预湿润
注意事项：在使用前对Akura 384孔微球培养板进行预湿润操作，可以有效避免孔内气泡的产生。
以下操作均在无菌环境下进行：
① 将40ul含FCS或BSA的细胞系培养基小心加入到insphero 384微球培养板的每个孔中，注意吸头尖端不要触及到孔的底部。
② 轻轻上下移液孔中的介质（该过程需避免产生气泡）。
• 细胞微球转移
② 通过Akura PLUS板的孔入口缓慢加入70ul完全培养基（≤10ul/sec），吸头尖端与孔的入口接触并施加轻微压力，将悬滴转移到Akura 96孔微球培养板中（如图5）。
③ 通过导致显微镜观察来验证微球转移。
④ 微球转移后，将Akura 96孔微球培养板放置在微孔板离心机中，在250rcf条件下离心2min，是细胞微球沉降到孔的底部，并清除气泡。
06、培养基更换
InSphero Akura 96微球培养板独特的孔结构可以实现高效、便捷的换液操作，同时可以有效避免微球损失和微球丢失。培养基更换流程如图6所示。
① 将吸头尖端放置在孔边缘的平台上，以≤30ul/sec的移液速度缓慢吸出孔中的培养基；孔中将会有5-7ul的培养基残留；
② 将吸头尖端放在孔边缘的平台上，以≤50ul/sec的移液速度缓慢加入新鲜培养基。
说明：本文内容仅介绍InSphero Akura PLUS悬滴培养系统在进行3D细胞模型构建应用中操作过程的介绍，不包含结果分析。对结果分析感兴趣的读者可以参考以下资源和文章：
