许多伤口愈合缓慢且难以处理。因此，负压伤口治疗（NPWT）应运而生，该疗法通过应用聚合物泡沫并施加特定负压，以清除伤口渗液、减少细菌负荷并促进肉芽组织形成。尽管负压伤口治疗已成功应用，但其作用机制尚未完全明确。特别是，不同的负压伤口治疗敷料从未被比较过。在此，研究人员制备了一种聚酯氨基甲酸酯 Degrapol®（DP）泡沫，并将其与市售敷料（聚氨酯基和聚乙烯醇基）在表观孔径、膨胀性和泡沫孔隙有效连通性方面进行了比较。DP 泡沫含有相对较小的相互连通的孔隙；PU 泡沫表现出较大的孔径和连通性；而 PVA 泡沫则显示出不均匀且连通性差的孔隙。PVA 泡沫膨胀了 40%，而 DP 和 PU 泡沫几乎没有膨胀。通过让直径为 3、20 和 45 微米的荧光珠通过泡沫，研究人员对有效连通性进行了研究。DP 和 PU 泡沫在 4 小时内清除了 70-90% 的珠子，这与珠子直径或珠子是否预先吸附血清白蛋白无关。对于 PVA 泡沫，预先吸附白蛋白的珠子循环时间更长，96 小时后，20% 的 3 微米直径珠子和 10% 的 20 微米直径珠子仍在循环。研究表明，有效的珠子灌注不仅取决于孔径和膨胀能力，还可能取决于泡沫本身的化学成分。此外，由于泡沫的高效筛分效应，体内伤口成分的吸收可能仅在短时间内发生，这表明其他机制可能对负压伤口治疗的成功起决定性作用。
一、引言
每年，全球约有两千万人遭受由糖尿病（如七百万例糖尿病溃疡）、循环系统问题及手术部位感染等多种病症引发的慢性伤口困扰，这对医疗保健系统构成了巨大压力。负压伤口治疗（NPWT）提供了一种有效方法，可缩短治疗周期、加速感染清除与伤口愈合，并减少住院天数。因此，与传统及先进伤口敷料相比，负压伤口治疗在许多应用中是一种经济高效且多功能的方法。负压伤口治疗通过对伤口施加可控水平的负压，促进多种类型伤口的快速清创和愈合。其作用包括通过负压快速清除组织间液、减轻局部水肿、增加血流量，从而降低组织细菌负荷。然而，负压伤口治疗并不能替代清创和感染治疗等经典伤口护理方法。此外，伤口内及周围细胞的机械变形被认为会增加基质合成，最终改善伤口愈合。
本研究制备了聚酯氨基甲酸酯 Degrapol®（DP）泡沫，并探索其作为负压伤口治疗敷料的潜力。从结构上看，DP 聚合物是嵌段共聚酯氨基甲酸酯，包含两种不同的聚酯嵌段：可结晶的刚性嵌段和无定形的弹性嵌段。由于这种结构，DP 具有高弹性特性，可制成泡沫、纤维、 fleece 等不同形状，并可调节机械性能。此外，研究表明 DP 具有细胞相容性和血液相容性，表明其可作为医用聚合物使用。
目前使用的负压伤口治疗材料主要由聚氨酯（PU）或聚乙烯醇（PVA）泡沫组成，这些材料在施加负压前被放置在伤口部位。仅有极少数研究报道了碘浸渍布等替代敷料的使用。PU 基泡沫由具有硬段和软段的嵌段共聚物组成，其中硬段由形成玻璃态或半结晶域的氨基甲酸酯组成。热塑性 PU 通常用作植入材料，具有高机械强度、韧性、耐磨性和抗水溶液降解性。PU 基材料被认为具有组织耐受性，因此常用于直接接触血液的应用，如负压伤口治疗。
聚乙烯醇（PVA）通过聚醋酸乙烯酯的部分或完全水解去除醋酸基团后聚合而成。聚乙烯醇具有优异的成膜、乳化和粘合性能，兼具高拉伸强度和柔韧性。然而，这些性能依赖于湿度，在较高湿度条件下会吸收更多水分。水作为增塑剂会降低 PVA 的拉伸强度并使其变软，但会增加其伸长率和撕裂强度。因此，其已在临床上用于预防术后粘连或作为软骨替代品。
DP、PU 和 PVA 泡沫的整体材料特性无法解释负压伤口治疗的成功机制，因此本研究进行了一项对比研究以阐明其体外功能。本研究的目的是在体外系统中，将 DP 泡沫与市售的临床用于负压伤口治疗的 PU 和 PVA 泡沫进行比较。通过扫描电子显微镜分析 DP、PU 和 PVA 泡沫的膨胀性和孔径，并通过荧光珠灌注实验分析泡沫孔隙的有效连通性。此外，研究了不同大小的珠子在预吸附血清白蛋白前后的灌注情况，以模拟更接近体内的条件。
二、结果与讨论
本研究制备了 DegraPol®（DP）泡沫，并探索了其作为负压伤口治疗（NPWT）敷料的潜力。研究对比了 DP 泡沫与临床用于伤口愈合的市售负压伤口治疗泡沫在形态、膨胀性和孔隙有效连通性方面的差异，这些特性是治疗过程中通过泡沫施加负压以清除伤口渗液、细菌和细胞所必需的。
01. DP、PU 和 PVA 泡沫的形态分析与膨胀性
为了比较 Degrapol®（DP）泡沫与 PU 和 PVA 泡沫，通过扫描电子显微镜（图 1a）分析了所有材料的横截面。DP 泡沫具有多孔结构，平均孔径为 160±50 微米，且孔隙相互连通良好。PU 泡沫呈现高度多孔结构，平均孔径为 680±140 微米，孔径大小相当均匀，且相互之间连通性极佳，孔隙仅由纤细的连接排列，形成几乎三维网状结构。在 PVA 泡沫的横截面中，孔径大小不一，平均直径为 610±420 微米，孔径范围为 100-1100 微米，与 DP 和 PU 泡沫的孔隙相比，其相互连通性差得多，有些孔隙甚至与相邻孔隙封闭。
图1. 聚合物泡沫的形态分析与膨胀性。(a) DegraPol® (DP-)、PU- 和 PVA- 样品已通过扫描电子显微镜进行分析（图 a、-f）。样品经过膨胀、化学固定和临界点干燥，然后用铂溅射。DP-泡沫表现出均匀且互连的小孔径。PU-泡沫显示出具有大直径和高互连性的均匀孔径，而 PVA-泡沫显示出具有不同孔互连性的非均匀孔径。(b) DP-、PU- 和 PVA-泡沫在 PBS 中膨胀至平衡状态。显示的是在指定时间点之后直径增加的膨胀百分比。数据代表每种条件下 4 个不同样品的平均值±标准差。这些值已标准化为膨胀前的直径（= 0% 膨胀）。
形态表征后，对泡沫的平衡膨胀性进行了比较（图 1b）。在指定时间点，分析了 DP、PU 和 PVA 泡沫在磷酸盐缓冲液（PBS）或模拟体液（SFB，未显示）中膨胀后的直径增加情况。两种溶剂之间未观察到差异。PVA 泡沫的直径增加了约 41±12%，正如预期，PVA 泡沫在水溶液中膨胀后变软。相比之下，DP 和 PU 泡沫的膨胀率显著较低（<2±3%）。所有类型的泡沫均在 4 小时后达到平衡膨胀。
02. 通过珠灌注实验测定 DP、PU 和 PVA 泡沫的有效连通性
由于用于负压伤口治疗的泡沫会暴露于轻微真空（通常在 – 80 至 – 125 mmHg 之间），本研究旨在研究流动条件下孔隙的有效连通性，以模拟真空抽吸体液、细菌或细胞碎片的过程。从溶液中去除荧光珠被确定为泡沫摄取珠子的衡量标准。正如扫描电镜图像和膨胀实验所示，孔径和连通性的差异可能表明荧光珠的灌注情况不同。实验使用了不同直径的荧光珠，大致对应细菌（3 微米）、单细胞（20 微米）和小细胞团（45 微米）的大小，这些均为负压伤口治疗中需通过泡沫的物质。
为了分析珠子灌注情况，使用了一种流动装置，该装置可容纳直径 5 毫米、长度 2-5 毫米的聚合物圆柱体。流动装置连接到泵，实现荧光珠的连续供应，并配备一个储液室，通过磁力搅拌棒搅拌珠子以防止沉淀。闭环系统示意图如图 2 所示。在初始实验中，直径 3 和 20 微米的荧光珠要么在 PBS 中充分冲洗后直接使用，要么在预吸附牛血清白蛋白（BSA）后使用。该实验的目的是确定与血清中最常见的蛋白质 —— 白蛋白预吸附是否会影响珠子通过聚合物泡沫的灌注（图 3）。由于灌注实验是在 BSA 存在下进行的，泡沫也进行了预吸附，从而在一定程度上模拟了临床应用中泡沫接触血液和 / 或血清的天然情况。
图2. 灌注实验的实验装置。闭环系统示意图，该系统通过硅胶管将流动装置（容纳待分析样品）连接到泵和盛有荧光珠溶液的容器。磁力搅拌器可抑制珠子沉淀。
图3. 荧光珠预吸附牛血清白蛋白对灌注时间的影响。将直径为 3 μm 和 20 μm 的荧光珠分别灌注于 DP、PU 和 PVA 泡沫中，灌注时间为 0 至 96 小时。在循环通过泡沫之前，将荧光珠用 PBS 冲洗或用 2% 牛血清白蛋白 (BSA) 预吸附。数值代表每种条件下 3 个独立样本的平均值±标准差，其中相对荧光值 (%) 是在指定时间点测定的。
珠子灌注实验表明，BSA 吸附珠和天然珠在 DP 和 PU 泡沫中的表现非常相似，4 小时后，直径 3 微米的珠子分别有 90% 和 70% 被截留。24 小时后，溶液中直径 3 微米的珠子基本全部被去除。DP 和 PU 泡沫在 4 小时后分别吸附了 80-90% 的直径 20 微米的珠子，24 小时后溶液中所有直径 20 微米的珠子均被去除。相比之下，对于 PVA 泡沫，BSA 预吸附对直径 3 和 20 微米的珠子表现出差异，在整个 96 小时的测试期间，预吸附 BSA 的直径 3 微米珠子的循环时间明显长于未处理的珠子，即使在 96 小时后，仍有 20% 的直径 3 微米珠子在循环。对于直径 20 微米的珠子，这种效应显著，90% 预吸附 BSA 的珠子仅在 24 小时内被截留在泡沫内，而未处理的珠子在 4 小时后已从溶液中去除。在所有后续研究中，均使用预吸附 BSA 的珠子，因为体内应用需考虑血清白蛋白的存在。这些实验表明，尽管 DP 和 PU 泡沫的孔径差异很大，但荧光珠的有效连通性并未反映出形态学特征。DP 和 PU 泡沫在短时间内高效摄取荧光珠，这一发现几乎与珠子直径以及珠子和支架是否用血清白蛋白预孵育无关。
通过显微镜观察 DP、PU 和 PVA 泡沫的珠子灌注情况，在黑色 PU 泡沫和白色 DP 或 PVA 泡沫上分别可观察到强荧光珠的黄色沉积（图 4a、b 和 c）。DP、PU 和 PVA 泡沫用直径 3 和 20 微米的珠子灌注 24 小时。从珠子溶液进入泡沫的一侧（流入侧）、泡沫横截面和溶液流出的对侧（流出侧）分析 DP 泡沫。尽管 DP 泡沫的孔径最小，但直径 3 微米的珠子均匀分布在整个 DP 泡沫中，流入侧和流出侧之间无可见差异，横截面也显示均匀分布。当使用直径 20 微米的珠子时，流入侧和流出侧之间观察到明显差异，珠子在流入侧积累。横截面表明珠子在 DP 泡沫管腔内的流动分布。在 PU 泡沫中，可清楚地看到在入口处珠子积累并吸附在泡沫支柱和泡沫孔隙内，尤其是直径 3 微米的珠子。在珠子流出侧，经常可见直径 3 微米的珠子，而直径 20 微米的珠子则不太明显。令人惊讶的是，在 PVA 泡沫中，直径 3 微米的珠子穿透性很好，在 PVA 泡沫的两侧均可观察到数量相近的荧光珠（图 4c）。直径 20 微米的珠子穿透泡沫较少，在珠子流出的泡沫表面可见的珠子较少。
图4. 预吸附牛血清白蛋白且不同尺寸珠子对 DP、PU 和 PVA 泡沫的灌注情况。DP 泡沫中灌注了直径为 3 和 20 μm 的荧光珠，其大小大致与细菌或单细胞相似。这些珠子预先吸附了牛血清白蛋白 (BSA)。24 小时后，将灌注了珠子的 DP 泡沫从流动装置中取出并进行形态学分析。左图显示暴露于来自储液容器的珠子（流入）的泡沫，而右图显示泡沫对面位置的泡沫表面（流出）。DP 泡沫还显示了穿过泡沫中部的横截面。下面两幅图显示未暴露于任何珠子溶液的泡沫；左图：顶视图，右图：侧视图。所有图像的比例尺均为 2 毫米。(b 和 c) 将 3 个和 20 个荧光珠灌注于 PU 和 PVA 泡沫，并按照 (a) 的步骤进行分析。左图显示暴露于来自储液容器的荧光珠（流入）的泡沫，而右图显示泡沫对侧表面（流出）。下方两幅图显示未暴露于任何荧光珠溶液的泡沫；左图：顶视图，右图：侧视图。所有图像的比例尺均为 2 毫米。(d) 展示了使用直径为 3、20 和 45 微米的荧光珠进行灌注实验的量化结果。荧光珠预先吸附了牛血清白蛋白 (BSA)，并比较了给定荧光珠直径的 DP、PU 和 PVA 泡沫的灌注时间。实验结果表示每种条件下三个独立样本的平均值±标准差。
对珠子灌注实验进行定量和比较时，可清楚地看到 DP 泡沫的表现与 PU 泡沫非常相似（图 4d）。对于直径 3 微米的珠子，4 小时后 DP 和 PU 泡沫截留了 70% 的珠子，24 小时后基本吸附了所有珠子；而在 PVA 泡沫中，4 小时后 60% 的珠子仍渗透，96 小时后仍有 20% 残留。对于直径 20 微米的珠子，4 小时后 DP 和 PU 泡沫吸附了 90% 的珠子，24 小时后几乎所有珠子均被吸附。在 PVA 泡沫中，直径 20 微米的珠子循环时间明显更长，96 小时后仍有 10% 的珠子在循环。对于直径 45 微米的珠子，观察到三种泡沫材料的灌注时间差异很小，4 小时后 DP 泡沫基本截留所有珠子，PU 泡沫 4 小时后截留 90% 的珠子，PVU 泡沫 4 小时后截留 80% 的珠子。
这些发现得出的结论是，孔径、膨胀性和孔隙连通性并非决定珠子有效穿透的唯一参数，泡沫的化学性质导致珠子与聚合物之间的不同亲和力也需要考虑。与我们的发现一致的是，PU 泡沫在体内可诱导非常强的肉芽组织形成，这通常会导致负压伤口治疗期间组织紧密长入 PU 泡沫（个人交流）。使用 PVA 泡沫时，这种情况较少见。其他研究小组在使用 PVA 膜或泡沫用于不需要组织长入的应用（如预防术后粘连）时，已探索了 PVA 的化学特性。
我们的研究试图将负压伤口治疗的有效性分解为有助于其在伤口愈合中成功应用的不同方面。在这里，我们仅分析了与材料相关的特性，即有效的泡沫连通性、膨胀性和小颗粒的摄取。治疗时间因伤口类型和大小而异，通常在 2 至 15 天之间或更长，每 2-3 天更换一次泡沫。在此期间，通常对伤口施加 – 80 至 – 125 mmHg 的负压和正常压力交替的方案，这已被证明是最有效的。这可能有两个原因：一是当施加真空和非真空交替阶段时，负压伤口治疗敷料可能更少凝结。我们的研究很好地表明，市售 DP、PU 和 PVA 泡沫非常快速地摄取荧光珠，并且珠子积聚在泡沫的孔隙内。因此，真空和非真空交替阶段可能会降低筛分效应，从而延长负压伤口治疗敷料的真空功能。另一个原因可能是，基础细胞通过负压和正常压力的交替循环受到机械刺激，形成肉芽组织，分泌生长因子和胶原蛋白，形成新血管并启动愈合过程。这一假设已通过伤口有限元模型研究施加应变后的细胞变形与负压伤口治疗后组织的组织学切片进行了比较分析。他们的研究结论是，这些压力差异以及伤口与负压伤口治疗敷料之间的弹性不匹配会导致伤口的机械刺激，从而诱导细胞增殖。伤口活检的组织学切片反映了这些发现，显示高变形区域的组织形成和血管化增加。值得庆幸的是，最近的一项研究展示了一种生物反应器型装置的开发，该装置允许在低于大气压的压力下进行三维细胞培养。此外，最近刚刚建立了一种用于负压伤口治疗的啮齿类动物体内模型。因此，未来的研究可以在更明确的条件下分析与解释负压伤口治疗机制相关的材料和生物学问题。
三、实验部分
01. DP 泡沫
聚酯氨基甲酸酯 DP（商品名 DegraPol®）按照研究人员描述的程序生产。简而言之：对于嵌段共聚物的合成，将 40 wt% 的聚（3-（R）- 羟基丁酸酯）- 共 -（ε- 己内酯）- 二醇 Mn=2,660 和 60 wt% 的聚（ε- 己内酯）- 二醇溶解在 1.4 – 二氧六环中，并通过加热和回流溶剂（在安装在反应容器上的索氏提取器中的分子筛（孔径 0.4 nm）上）干燥，直到水含量低于 20 ppm。将反应混合物冷却至 83°C，然后加入相对于两种二醇化学计量的二异氰酸酯（TMDI）。反应约一天后，在一天内分三次加入三部分二月桂酸二丁基锡（20 ppm），以达到 60 至 110 kDa 的分子量。将聚合物在干冰冷却的甲醇中沉淀，随后通过溶解在氯仿中并通过硅胶 60（Fluka）柱过滤进行纯化。在干冰冷却的甲醇中进行第二次沉淀，结束该过程。DP 泡沫通过冷冻浸没沉淀技术生产。制备 DP 在二氧六环作为溶剂（5 wt%）中的溶液，并冷却至 10°C 保持 2 小时。将冷溶液倒入具有所需多孔体形状的不锈钢模具中。然后将模具中的溶液在实验室冰箱中冷却至 – 25°C 并在此温度下保持过夜。之后，将固化的结构从模具中取出，并在室温下真空风干，直至完全除去二氧六环。将聚合物圆柱体在膨胀至平衡后冲压出来用于灌注实验。
02. PU 和 PVA 泡沫
无菌黑色聚氨酯泡沫敷料（V.A.C.® GranuFoam®，10×7.5×3.3 cm）和聚乙烯醇泡沫敷料（V.A.C.® WhiteFoam，10×7.5×1 cm），将聚合物圆柱体在膨胀至平衡后冲压出来用于灌注实验。
03. 膨胀实验
为了确定 DP、PU 和 PVA 泡沫在暴露于磷酸盐缓冲液（PBS）或模拟体液（SFB）时直径和长度的增加，使泡沫膨胀至平衡。测定直径 5 毫米、长度 5 毫米或直径 5 毫米、长度 3 毫米的 DP 和 PU 泡沫的膨胀时间和膨胀量。使用直径 5 毫米、长度 3 毫米或直径 5 毫米、长度 2 毫米的圆柱体分析 PVA 泡沫。将样品浸入 PBS（P3688-10PAK）中，用双蒸馏水或 SFB 填充至 1 升。SFB 通过在使用前以 1:1 的比例混合 “Ca²⁺储备溶液” 和 “PO₄³⁻储备溶液” 制备。这些溶液的组成如下：Ca²⁺储备溶液（15.99 g NaCl；0.4474 g KCl；0.6099 g MgCl₂×6 H₂O；1.0955 g CaCl₂×6 H₂O）；PO₄³⁻储备溶液（0.3222 g Na₂SO₄×6 H₂O；0.7057 g NaHCO₃；0.4565 g K₂HPO₄×3 H₂O）。两种储备溶液均用双蒸馏水定容至 1 升。在 0、1、2、4 和 24 小时后测定泡沫的膨胀情况，并与干燥泡沫的直径和长度（=0% 膨胀）相比，确定直径和长度的增加量。数据表示每种条件下 4 个不同样品的平均值 ± 标准差。
04. 流动装置
使用定制的流动装置，该装置由 A 和 B 两部分组成，可通过螺纹连接，留下内径 5 毫米、长度可调（2-5 毫米）的样品容器，通过在 A 和 B 部分之间插入不同数量的 O 形环实现。每个部分由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成，允许对流动室进行光学检查。为确保室的不泄漏性，用于连接 tubing 的配件直接制造并连接到 A 和 B 部分。使用以下尺寸的 TYGON R3607 硅管：外径 1.62 毫米，内径 0.76 毫米。
05. 测定 DP、PU 和 PVA 泡沫中孔隙的连通性
为了测定泡沫孔隙的连通性，在闭环系统（图 2）中，将不同直径的荧光珠循环通过 DP、PU 和 PVA 泡沫。通过珠子溶液荧光的降低来评估珠子在泡沫上和泡沫内的吸附。实验使用 3 µm Fluoresbrite™ YG 微球（编号 17155）、20 µm Fluoresbrite™ YG 微球（编号 19096）和 45 µm Fluoresbrite™ YG 微球（编号 18242）。荧光珠在 PBS 中直接使用或在预吸附牛血清白蛋白后使用。为此，将 100 µL 珠子溶液在 1 mL 含 2% 牛血清白蛋白（BSA，A 9418）的 PBS 中预吸附，并孵育 15 分钟，在室温下以 10,000 rpm 离心 5 分钟。此过程重复三次。将泡沫在室温下用 PBS 预膨胀，并切成直径 5 毫米、长度 5 毫米的圆盘，插入定制的流动装置中，该装置允许用荧光珠灌注。使用 Ismatec instruments 泵（编号 7610-20），流速为 8.1 mL/min。由于循环溶液的荧光与荧光珠的数量相关，在循环时间为 5、20 分钟、1 和 4 小时以及 1 和 3 天时，提取两次 200 µL 样品，转移到白色 96 孔板中。在 PerkinElmer LS 55 发光光谱仪中，使用提供的软件 Flwinlab，在 441nm 激发和 486 nm 发射波长下（狭缝宽度均为 2.5 nm）测定荧光。通过泡沫的溶液中荧光珠的数量分别为：3 µm 直径珠子 8.4×10⁷个，20 µm 珠子溶液含 284,000 个珠子，45 µm 珠子溶液含 24,950 个珠子。实验开始时的荧光对应于珠子数量（针对相应大小的珠子），并用作参考。在指定时间点测定实际荧光，并计算相对荧光 =（实际荧光 / 初始荧光）×100。数值表示至少三个独立实验的平均值 ± 标准差，每个实验条件重复三次。所有数值均扣除仅溶剂（PBS）获得的值。
06. 聚合物泡沫的形态表征
0601. 宏观显微镜图像
将 DP、PU 和 PVA 泡沫圆柱体（直径 5 毫米，长度 5 毫米）在 PBS 中膨胀，按上述用 3 或 20 微米直径荧光珠灌注 24 小时，或仅留在 PBS 中。将泡沫在室温下用溶于 PBS 的 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，然后用 PBS 充分冲洗，放置在干净的玻璃板上。使用 Leica MZ 16A 宏观显微镜，采用直立光和 1 号前透镜对样品进行分析。
0602. 扫描电子显微镜（SEM）
将 DP、PU 和 PVA 泡沫圆柱体（直径 5 毫米，长度 5 毫米）在 PBS 中膨胀，在室温下用溶于 PBS 的 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，再用 3% 戊二醛的 PBS 溶液固定 30 分钟。样品在梯度乙醇系列中脱水，从无水乙醇中通过 CO₂临界点（Tk=31°C，Pk=73.8 bar）使用临界点干燥器（CPD 030 Critical Point Dryer，Bal-Tec AG，Balzers，Liechtenstein）干燥。样品用 10 nm 铂进行溅射涂层，使用 Zeiss SUPRA 50 VP 在 1 kV 和 5 kV 下利用二次电子信号记录图像。
四、结论
本研究表明，不同负压伤口治疗敷料的几何形状（即使在非压缩形式下）并非决定珠子有效穿透的唯一参数，泡沫本身的化学性质导致珠子与聚合物之间的不同亲和力也需考虑。此外，由于泡沫的高效筛分效应，体内真空抽吸的伤口成分摄取可能仅在短时间内发生，这表明生物学机制而非材料特性对负压伤口治疗在伤口愈合中的临床成功起决定性作用。
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