在临床检测中，我们更关注的是具有诊断和治疗价值的突变型DNA信息，但是这些突变型序列常常与大量的野生型序列共存，给临床检验带来巨大挑战。在肿瘤基因检测领域，新型的液体活检场景中，因突变型的ctDNA在cfDNA中的占比很低，需要有更低检测下限的技术才能准确识别ctDNA；在生殖遗传领域，胎儿的cfDNA在母亲血液中的占比很低，如何更好地识别胎儿cfDNA是孕期筛查领域的重要关注问题；在感染领域，除了对未知病原微生物的检出，医生们也非常关心耐药型突变菌株的问题，但对患者产生巨大影响的耐药型突变菌株在早期比例很低，若能更早地识别出耐药位点，可以及时选择更合适的治疗药物，减轻患者痛苦。
解决以上问题的关键是提高信噪比，而降低噪音的一种有效方法就是抑制背景或者本底噪音，针对性地放大或者富集目标信号。临床上，检测低频突变位点的技术进步对于推动近几年液体活检领域非常热门的耐药监测、MRD监测以及早期复发监测等细分领域具有重大的意义。
低频突变检测的底层逻辑是基于PCR blocker阻断野生型DNA扩增，特异扩增突变型DNA，从而实现富集低频靶标的方法。
BDA（blocker displacement amplification）是一项极具代表性的基于PCR blocker方法的低频突变检测技术，是阅尔基因的专利技术，在博采众长的基础上做了不断优化，包括提高富集效率、提高温度适应性、降低试剂成本、提高引物设计效率、提高多重反应能力等方面。BDA技术已授权ONT、 Bio-Rad、C2i genomics等国际一流生物公司，开展低频突变位点检测的产品研发。
今天我们了解一下BDA及其它低频突变检测技术，包括WTB-PCR （Wild-Type blocking PCR），COLD-PCR （co-amplification at lower denaturation temperature PCR），ice-COLD-PCR （Improved and Complete Enrichment COLD-PCR），E-ice-COLD-PCR （Enhanced ice-COLD-PCR ），MEMO （mutant enrichment with 3’-modified oligonucleotides）等几种方法，了解一下这几项技术未来谁能在临床应用层面走得更远。
WTB-PCR
WTB-PCR在PCR的过程中多加一条LNA blocker引物，LNA blocker与上游引物没有重叠区域。在PCR反应过程中，LNA blocker与野生型DNA分子结合，妨碍了上游引物对野生型DNA的扩增；相反，LNA blocker与突变型DNA分子不结合，突变型DNA分子可被扩增（图1）1。
LNA blocker在野生型和突变型分子之间的差异结合是基于LNA blocker在核苷酸的2‘-O和4’-C之间存在亚基连接，使得其与DNA分子结合的退火温度（Tm）大大提高2。例如，8碱基的寡核苷酸序列的Tm只有35℃，而LNA 八聚核苷酸的Tm达到71℃，DNA的单碱基对错配使Tm降低10℃，而LNA的单碱基错配的△Tm达到26℃。另外，为防止LNA blocker作为引物进行延伸，在其3’端引入3个不匹配的碱基；为防止Taq酶的5’→3’外切酶活性在blocker结合到野生型模板上后形成的双链而对LNA blocker进行水解，WTB-PCR用了不具备5’→3’外切酶活性的Stoffel聚合酶进行延伸。
图1 WTB-PCR的技术原理
虽然 LNA的优势在于核苷酸的修饰使得△Tm在一个较大的范围内给实验优化提供了足够的空间，然而，LNA的核苷酸修饰使得其成本昂贵，难于在实际应用中推广。另外，Stoffel酶不含5’→3’外切酶活性，因此无法应用在类似于Taqman探针法的定量PCR场景中，一定程度上也限制了其临床应用。
COLD-PCR，ice-COLD-PCR 和Enhanced-ice-COLD-PCR
ice-COLD-PCR 和Enhanced-ice-COLD-PCR是在COLD-PCR基础上进行优化的技术。 COLD-PCR利用错配杂交的wt-mu与完全杂交的wt-wt之间的微小的Tm的差异，通过控制变性温度，抑制完全杂交的野生型DNA分子之间的模板解链，实现抑制野生型分子扩增的目标（图2）3。
图2 COLD-PCR的技术原理
COLD-PCR没有使用blocker序列，而是利用DNA分子间错配差异引起的Tm差异实现差异扩增。Tm差异是相当微弱的，给不同位点的引物设计带来较大难度。另外，COLD-PCR虽然也能扩增wt-mu双链分子，最终的PCR产物中含有一半的野生型分子（图3，红色箭头所示），但富集效果通常只有几十倍，不足以应用到更低频的检测领域。COLD-PCR的Tm差异随着扩增子长度的延长效果愈显微弱，所以仅适用于较小片段的扩增，无法应用到真假基因鉴定等这些需要较长DNA扩增的应用场景中。
图3 COLD-PCR的突变富集效果
ice-COLD-PCR在COLD-PCR的基础上加入了一条参考序列（reference sequence, RS），应用的Tm差异从COLD-PCR的wt-wt与wt-mu的差异，转变为RS-wt和RS-mu的差异。RS在3’端进行磷酸基团修饰，防止其发生延伸。RS序列与双端引物有6碱基和5碱基的重合，因此RS和DNA模板形成的双链无法被Taq酶的5’→3’外切酶活性活性所降解（图4）4。
ice-COLD-PCR一定程度上提升了COLD-PCR的富集效率，但是较长长度的RS较大程度地提高了序列合成成本，更重要的是，ice-COLD-PCR依然没有解决利用微弱Tm差异而进行的野生型和突变型的区分，对于条件优化、扩增子长度选择，依然有较大的局限。
图4 ice-COLD-PCR的技术原理
Enhanced-ice-COLD-PCR技术在ice-COLD-PCR的基础上进行进一步的优化，将长度较长的PS更改为长度较短的LNA blocker5。用LNA blocker的优势在于显著的Tm差异大大降低了优化难度，但是具备了WTB-PCR的缺点，即LNA blocker合成成本昂贵及无法在基于Taqman探针法的qPCR平台应用。
图5 Enhanced-ice-COLD-PCR的技术原理
MEMO
MEMO技术是用3’修饰的blocking引物抑制野生型DNA的扩增，从而达到突变型DNA的富集。MEMO技术原理类似WTB-PCR，不过引物仅在3’端做了修饰，例如C3间臂修饰，C6氨基修饰或磷酸化修饰，成本有所下降，并且设计难度有所降低。MEMO的blocking引物与上游扩增引物存在几个碱基的重叠，重叠区域与突变位点相邻，blocking引物对扩增引物形成阻滞效应（图6A）。Blocking引物序列与DNA分子结合的退火温度更高，在体系中的浓度更高，与扩增引物相比，优先抢占了野生型模板；然而其与突变型模板存在错配，blocking引物序列与突变型模板的亲和力下降，无法优先抢占突变型模板，因此，扩增引物更容易特异性地扩增突变型模板（图6B）。MEMO-PCR的结果在突变型DNA未稀释和少量稀释时仅可见突变型碱基的峰，几乎不可见野生型碱基的峰，当稀释倍数更高时，可见突变型碱基和野生型碱基的双峰（图6C）6。
图6 MEMO的技术原理
引物设计是MEMO的难点，包括blocking引物序列的长度，以及blocking引物序列和扩增引物的重叠碱基数。仅1或2个碱基重复一般是不够的。作者针对EGFR， BRAF，JAK2三个基因的4个位点设计了51条blocking引物，与扩增引物的重复碱基数从5-17个不等，针对这51条blocking 引物逐一进行模板稀释梯度实验，才可获得各blocking引物的最佳反应条件。MEMO技术对于突变型模板的富集效率取决于blocking primer-wt和blocking primer-mu的Tm差异，然而MEMO无法根据Tm值理论体系有效地指导扩增引物和blocking引物序列的设计和优化，低成本高通量地设计最佳blocking引物成了MEMO难以实现的目标，使得基于该技术的多重PCR的研发和产品开发的难度和成本都比较大，这对技术和市场的推广是非常不利的。
BDA
BDA技术是阅尔基因的联合创始人David Yu Zhang教授于2017年发表于nature biochemical engineering 杂志的新型低频突变富集技术。BDA与MEMO类似，blocker和上游扩增引物存在一定的重叠，两者竞争性地结合DNA模板实现差异富集。BDA不再通过计算Tm值筛选最佳引物和blocker，而是关注于更底层的DNA分子结合的吉布斯自由能，从分子热力学角度解决了引物设计、dimer生成的难题，blocker和上游扩增引物序列的竞争性来源于三个部分的吉布斯自由能差异，一是blocker和扩增引物重叠部分，另一个是扩增引物中除了重叠部分之外的特异性部分，最后一个是blocker中除了重叠部分之外的特异性部分。Blocker与野生型DNA分子完全匹配，结合更稳定，DNA分子较不容易与扩增引物结合，扩增效率较低；Blocker与突变型DNA分子不完全匹配，结合稳定性较低，DNA分子更容易与扩增引物结合，扩增效率更高。两者差异的扩增效率经过30轮的扩增，突变型分子的富集可达上万倍（图7）。
图7 BDA的技术原理
另外，值得注意的是，blocker与DNA分子结合的吉布斯自由能差异，是随着温度的差异而恒定不变的，这使得BDA不再受温度的巨大限制，在56-64℃范围内的退火，都可以达到极佳的富集效果（图8）。此外，BDA与MEMO利用3’修饰基团抑制blocker的扩增不同，BDA简单地加4个未经修饰的且不匹配的碱基而实现这个目的，大大降低了blocker合成成本。通过高通量地计算不同引物和blocker的吉布斯自由能，可以从计算层面获得最佳的blocker序列，大大提升了BDA的应用潜能7。
图8 BDA反应不受退火温度影响
2021年，阅尔基因于nature biochemical engineering 杂志发表了多重BDA扩增技术（mBDA，multiple BDA），在提高突变型序列检出率的同时，降低了野生型序列的检出率（图9）。利用mBDA技术对18个样本的黑色素瘤队列的肿瘤组织进行145个位点的检测，在这些样品中检出最低0.2% VAF的突变8。mBDA的多重扩增能力使得低频突变富集技术可以应用于肿瘤液体活检、孕期筛查等多基因多位点的应用场景，大大拓展了低频突变技术的临床应用前景。
图9 mBDA的野生型和突变型序列的检出率
总结而言，随着低频突变富集技术的不断发展，在技术原理层面有了不断的改善，向着设计更便捷、成本更低廉、多重检测能力更高、应用场景更广泛的方向发展。BDA在众多低频突变富集技术中，具有最完整的理论模型，具备完整的引物设计软件，能够指导新位点的开发，同时开展多重PCR产品的研发，是唯一一种在富集领域做到100重以上的多重PCR技术。目前在实验室中，已经可以稳定做到数百重的多重BDA（mBDA）反应体系，产品即将面市。同时，结合了UMI标签的qBDA技术，以及结合了TaqMan探针的As-BDA技术，也在不断丰富BDA技术的使用场景。
此外，阅尔基因基于BDA检测技术，推出了BDA定制化整体解决方案，利用NGSure平台，提供临床和科研中感兴趣的低频突变位点的检测方案，共享技术革新福利。
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关于阅尔基因
阅尔基因是一家技术创新驱动的全球基因组学公司，拥有多项革命性的分子检测技术，可将所有NGS平台的测序成本降低98%以上，并将qPCR、Sanger和纳米孔测序的灵敏度提高100倍以上。阅尔基因在美国休斯顿、中国上海和中国苏州均设有分部。阅尔基因的愿景是创造负担得起的、及时的和准确的基因分析工具，与诸多合作伙伴一起实现精准医疗并改善患者预后。
