师妹给我发来一张流式图：「师兄，我的 FSC-SSC 里细胞全在左下角，是不是跑光了？」我一看，那是典型的碎片+死细胞 —— 她忘了第一道门。
流式细胞术的图不难认，难的是：拿到图之后不知道该看哪里、门怎么圈。下面直接上干货 —— 9 个常见实验场景，一张图一个解法。
插个题外话，下期想看看什么，告诉我呗
FSC-SSC 散点图
（按照细胞大小和类型分群）
X：FSC（前向角散射）：反映细胞大小，信号越强细胞体积越大。
Y：SSC（侧向角散射）：反映细胞内部颗粒度 / 复杂度，信号越强颗粒越多。
是所有后续分析的「第一道门」，用于去除碎片、粘连体并初步分群。
淋巴细胞：FSC 小、SSC 小（左下群）
单核细胞：FSC 中、SSC 中（中间群）
粒细胞：FSC 中、SSC 大（右上群）
碎片/死细胞：FSC 极小、SSC 极低（最左下）
图 1: 源自丁香园
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FSC-A vs FSC-W：去除粘连细胞（仅保留对角线的单细胞群）。
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SSC-A vs SSC-W：同理，用于颗粒度高的样本（如粒细胞）去粘连。
单参数荧光直方图
X：荧光强度（线性 / 对数轴），反映目标分子表达水平
Y：细胞数量，反映各荧光强度对应的细胞数。
图 2: 源自丁香园
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双参数荧光图：散点图 / 密度图 / 等高线图
1. 双参数散点图
横、纵坐标各代表一种荧光标记，将细胞分为四个象限
左上（Q1）：X- Y+
右上（Q2）：双阳性（共表达）
左下（Q3）：双阴性
右下（Q4）：X+ Y-
2. 密度图 / 伪彩图
图 3：源自普拉特泽生物官网
用颜色深浅表示细胞密度，适合展示稀有细胞亚群。优势：比散点图更易识别细胞群边界，减少噪音干扰。
3. 等高线图
图 4：源自普拉特泽生物官网
用等高线勾勒细胞密度分布，清晰区分弥散亚群。适用场景于细胞数量少、亚群分散的样本（如外周血稀有细胞）。
设门系列图
一级门（P1）：FSC-SSC 圈活细胞、去碎片
活力染料门（PI/7-AAD/Zombie）
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阴性峰：活细胞
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强阳性峰：死细胞
谱系/次级门（如 CD3→CD4/CD8→ 亚群）
凋亡分析（Annexin V-FITC / PI）
Q1：左上为早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）
Q2：右上为晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）
Q3：右下为细胞核碎片或机械损伤细胞（Annexin V-/PI+）
Q4：左下为正常（活）细胞（Annexin V-/PI-）
图 5：小编自己的
细胞周期
G0/G1：2N DNA，主峰
S 期：两峰之间（DNA 复制中）
G2/M：4N DNA，G1 右侧约 2 倍强度
图 6：小编自己的
细胞增殖（CFSE 稀释法）
每分裂 1 次，荧光强度减半
峰越右：未分裂/少分裂
峰序列左移：第 1、2、3… 代
可算增殖指数、分裂次数、增殖率
图 7：源自百萤生物官网
特殊应用图
1. 调节性 T 细胞（Treg）分析图
典型方案：CD4+CD25+Foxp3+
圈门流程：淋巴细胞 → CD3+ → CD4+ → CD25/Foxp3 双参数图。
右上双阳群为 Treg 细胞，需使用 FMO 对照消除非特异染色。
图 8：小编自己的
2. 胞内细胞因子染色（ICS）图
用于检测活化 T 细胞分泌的细胞因子（如 IFN-γ、IL-2、TNF-α）。
示例：CD8+ vs IFN-γ 双参数图中，右上双阳群为抗原特异性 CTL 细胞。
对照图的重要性
1. 未染色细胞对照
确定细胞自发荧光基线，设置阴性门位置。
2. 同型对照（Isotype）
使用与一抗同物种、同亚型的非特异性抗体，排除非特异性结合。
3. FMO 对照（Fluorescence Minus One）
多色流式必备：仅缺少目标荧光通道的染色管，用于精准圈定弱阳群。
4. 单阳管对照
用于调节荧光补偿，消除荧光通道间的光谱重叠。
补偿异常表现：细胞群倾斜、跨象限、拖尾。
常见异常图形及问题排查
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降低通道电压、优化样本制备 |
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降低对应通道电压 |
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1. 细胞群整体倾斜 → 重新设置单阳管，调节补偿矩阵：荧光补偿不当时，阳性群与阴性群在双参数散点图中呈斜向分布（非垂直或水平），需通过单阳性对照计算溢出系数（Spillover Coefficient）。
专业步骤：
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制备高质量单阳管：分别使用各荧光染料的单染细胞（或补偿微球），确保阳性群荧光强度与实验样本相近。避免使用强表达抗原的细胞，以免补偿过度。
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采集单阳数据：保持电压与实验管完全一致，记录每个单阳管的各通道荧光强度。
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自动/手动调节：
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验证补偿矩阵：将补偿应用于混合染色样本，检查双阳性细胞群是否与坐标轴平行。若仍倾斜，需重新调节补偿或检查是否存在光谱重叠未完全校正（如 PE-Cy5 与 APC）。
常见误区：
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使用死细胞或聚集细胞制备单阳管，导致非特异性荧光。
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补偿矩阵应用于不同电压设置的样本，需保持电压恒定。
2. 细胞呈线状/拖尾 → 降低通道电压、优化样本制备：线状拖尾通常源于电压过高导致信号饱和（进入非线性区），或死细胞自发荧光及非特异性染色。降低电压可恢复信号线性；优化样本制备减少死细胞。
专业步骤：
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电压调整 ：
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优化样本制备：
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检测后验证 ：重新上样，观察 FSC-A/SSC-A 图中细胞群是否呈紧凑椭圆形，且荧光散点图拖尾消失。
3. 边界截断层 → 降低对应通道电压：细胞信号超出检测器量程时，细胞群在散点图边缘被「切断」，导致数据丢失。常见于高表达抗原或高自发荧光样本。
专业步骤
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识别过压通道：查看单参数直方图，若峰形在最大道数处突然截止，即为饱和。
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逐步降压 ：
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替代方案：若降低电压后弱阳性信号过低，可改用低灵敏度检测模式（如对数放大器）或稀释样本。
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记录变更：调整后需重新设置补偿和阈值，并在实验记录中注明电压值，确保批次间可重复。
注意事项：
边界截断层也可能由阈值（Threshold）设置不当引起，需检查 FSC 阈值是否过低导致电子噪声饱和。若降压后仍截断，应检查 PMT 或更换仪器通道。
4. 大量弥散点 → 优化裂解、固定步骤，使用活力染料：弥散点通常对应碎片（FSC 小、SSC 低）或死细胞（非特异性染色强）。优化裂解和固定可减少碎片产生，活力染料则能直接排除死细胞干扰。
专业步骤：
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裂解步骤优化：
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固定步骤优化：
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活力染料应用：
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碎片去除：若碎片仍多，可在洗涤后使用密度梯度离心（如 Ficoll-Paque）或商业碎片去除试剂盒（如 Dead Cell Removal Kit, Miltenyi）。
5. 双峰粘连 → 使用 FSC-A/FSC-W 设门：细胞粘连体（双联体或多联体）在流式检测中会产生异常的双峰或拖尾，影响细胞周期、倍体分析及免疫分型。FSC-A（面积）与 FSC-W（宽度）联合设门可有效排除粘连体。
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正确设门顺序 ：
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替代参数：也可使用 FSC-H vs FSC-A，单细胞呈线性关系（斜率 ≈1），粘连体偏离。
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验证：对于 DNA 倍体分析，建议同时使用 PI 染色，并在 FL2-A vs FL2-W 图中再次设门，排除粘连体。
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注意事项：
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进阶技巧：对于粘连体比例极高的样本（如贴壁细胞），可改用 FSC-H vs FSC-A 联合 SSC-H vs SSC-A 双参数设门，提高排除效率。
编辑：冷漠小 z
题图来源：自制
