伤口愈合是一个主要的临床和公共医疗保健问题，经常受到感染风险、对周围组织的不利后果以及难以监测愈合过程的挑战。
近日，以色列理工学院Hossam Haick团队、上海交通大学崔大祥教授团队联合中山大学袁苗苗团队报告了一种用于无缝伤口闭合和实时监测愈合参数的新型自愈、抗菌和多功能伤口敷料。自修复弹性体含有十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），具有高机械韧性（35 MJ m-3）、生物相容性和出色的抗菌活性（12 h 杀菌率≈90%），使伤口敷料能够有效抑制细菌生长并加速感染的伤口愈合。基于全层皮肤切口模型的体内测试表明，多功能伤口敷料可以帮助收缩伤口边缘并促进伤口闭合和愈合，这可以通过显着致密且组织良好的胶原蛋白沉积来证明。该测试证明，多功能伤口敷料内的集成传感器阵列可以实时监测伤口区域的温度、pH值和葡萄糖水平，提供可靠、及时的伤口状况信息。最终，所报道的多功能敷料在通过个性化监测和治疗方法、数字化和其他以人为本的医疗保健解决方案来管理与伤口愈合相关的负担方面具有很高的价值。该研究以题为“Highly Efficient Self-Healing Multifunctional Dressing with Antibacterial Activity for Sutureless Wound Closure and Infected Wound Monitoring”的论文发表在Advanced Materials上。
1. 多功能伤口敷料的制备和表征
细菌生长，通过具有自愈能力的生物相容性弹性体以无缝方式闭合伤口，并通过检测与伤口相关的生物标志物监测愈合状态。生物相容性弹性体的合成，首先是通过缩聚羟基封端的聚丁二烯 (HTPB)、1,10-癸二醇 (DE) 和异佛尔酮二异氰酸酯 (IPDI) 来生产预聚物 (PUIDE)并由二月桂酸二丁基锡 (DBTDL) 催化。随后，将与PUIDE质量比为1%的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，溶于MeOH）加入PUIDE溶液中，形成均匀混合物，然后倒入聚四氟乙烯模具中，使溶剂缓慢蒸发。此后，将所得弹性体在真空烘箱中在80 oC 下干燥 24 h以去除残留溶剂，最终获得没有任何气泡的 PUIDE-CTAB 弹性体。
合成弹性体中的 HTPB 部分充当软组件，这有助于提供良好的柔韧性。DE 和 IPDI 一起被认为是硬链段，通过在尿素/氨基甲酸酯键的形成中贡献氢键（图 1b），在弹性体的机械和自修复性能中起关键作用。同时，在傅里叶变换红外（FTIR）光谱中，N=C=O伸缩键在2264 cm-1处的峰可以忽略不计，表明二异氰酸酯单体完全转化为氨基甲酸酯键，这也是形成许多氢键的前提 在弹性体中（图 1c）。PUIDE-CTAB 在高达240 oC 的温度下表现出很好的稳定性（图 1d）。接触角测量表明，与 PUIDE 相比，PUIDE-CTAB 薄膜具有良好的亲水性（图 1e）。厚度为 200 μm 的 PUIDE-CTAB 薄膜在可见光波长（400-750 nm）下的平均透射率 >97%（图 1f）。
图1 基于弹性体的自修复 MFWD 示意图
图2 a)外层、b)传输层和c)内层的SEM图像。d)PIL膜的平均直径分布。e)不同层数PIL膜的XPS谱
2. PUIDE-CTAB 的机械和自愈性能
出色的机械和自愈特性是实现无缝伤口闭合的关键。对于 PUIDE-CTAB，尿素/氨基甲酸酯键中的氢键在拉伸过程中充当物理交联点，保持机械坚固且可拉伸的聚合物网络。断裂的氢键可在外力释放后逐渐重建。为了评估 PUIDE-CTAB 样品的机械性能，对哑铃试样进行拉伸试验，变形率为 100 mm min-1。图 2a 显示原始 PUIDE-CTAB 具有 7.34 MPa 的极限拉伸强度和 ≈1400% 的有利拉伸应变。特别是，该弹性体显示出 35.98 MJ m-3 的出色韧性，高于先前报道的值。通过一锅法合成的 PUIDE-CTAB 的强机械性能可归因于形成层级 H 键组合和硬段和软段更好的相分离，这可以极大地提高材料的机械性能。PUIDE-CTAB 的杨氏模量从其低应变计算为1.45 MPa 区域，该弹性体的屈服点出现在79.5% 的应变处，表明非共价氢键开始解离。当变形速率较慢时，样品具有较高的拉伸性。为了量化弹性体的抗撕裂性能，在预先损坏的试样上进行了拉伸试验，试样的侧面有 1 mm的缺口（缺口的大小是原始试样宽度的一半）。在伸长过程中，缺口变钝，可以承受高达 440% 的应变（图 2a）。使用 Greensmith 计算的断裂能方法为 11.8 kJ m-2，表明该弹性体具有良好的缺口不敏感性。
弹性体在第一个循环中具有明显的滞后回线，表明能量耗散显着（图 2b）。然而，由于第一个循环中断裂的牺牲键没有足够的时间重建到其原始状态，因此第二个循环中的磁滞回线面积显着减小。这种下降趋势在连续周期中略有下降，意味着牺牲债券的持续重组。样品在室温下静置 1 h 后，显示出与原始曲线相似的加载/卸载曲线，表明 PUIDE-CTAB 具有良好的抗疲劳性。第一次循环试验后静置30 min，样品的拉伸强度和滞后回线面积可以恢复到初始水平，表明断裂键重新形成，表明PUIDE-CTAB具有优异的自恢复能力。
图3 PUIDE-CTAB弹性体的机械和自愈性能
3. PUIDE-CTAB 的体外和体内生物相容性
理想的伤口敷料应具有良好的生物相容性，因为它实际上会与血液和组织。因此，为了全面评估我们 MFWD 的生物相容性，进行了体外（细胞相容性和血液相容性）和体内试验。使用正常人肝 L02细胞评估细胞相容性。进行活/死细胞活力测定以测量共培养48 h后PUIDE-CTAB对L02细胞活力的影响。PUIDECTAB 治疗组和对照组之间没有显着差异。令人欣慰的是，荧光分析表明，在与 PUIDE-CTAB 孵育 48 h后几乎所有细胞都有强烈的绿色信号和正常的纺锤状形态（图 3a），表明弹性体在长期生物应用中对生物生长没有影响。此外，将聚合物在培养基中浸泡48 h，然后将一定量的培养基加入培养的人L02细胞的96孔板中。通过将不同量的 PUIDE-CTAB 与含有 2% v/v 红细胞 (RBC) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 一起孵育来进行血液相容性测试。所有弹性体组、阳性对照组（去离子水）和阴性对照组（PBS）的宏观颜色显示在图 3b 的插图中。如图所示，所有弹性体组均为浅粉色，与阴性对照组相同。这与呈鲜红色的阳性对照组明显不同。所有聚合物组的溶血率均<3%（100 mg PUIDE-CTAB为2.83%），表明其具有优异的血液相容性。
对于体内生物相容性测试，将一个 PUIDE-CTAB 样品植入小鼠皮下 10 天。此后，对血清中的血液学参数进行了研究和比较，包括白细胞（WBC）、红细胞、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血细胞比容（HCT）、血红蛋白（HGB）等血液生化参数。此外，苏木精和伊红（H&E）染色用于研究主要器官（心、肝、脾、肺、肾和皮肤）是否有任何损伤，但 PUIDE-CATB 似乎没有造成任何组织缺陷 （图 3d）。这些结果表明 PUIDECTAB 是一种生物相容性弹性体，具有明确的体内医学应用潜力。
图4 PUIDE-CTAB 的体外和体内生物相容性测试
4. 多功能伤口敷料中传感器阵列的体外评估
由于PUIDE-CTAB优异的机械性能、自愈能力和生物相容性，在其上制备了传感模量以监测伤口相关生物标志物。MFDW 的传感部分由三层组成（图 4a、b）：厚的 PUIDE-CTAB（作为基材并用于无缝伤口闭合）、传感层（葡萄糖、pH 和温度）和薄的PUIDE -CTAB（用于防止感应区外的电极部分直接接触创面床）。蛇形电极是由银纳米线（AgNWs）通过喷涂制成的。此后，以确保防止交叉污染的方式对相应电极进行选择性和图案化功能化。尽管电极的电气特性在拉伸条件下会发生变化，但与传感器的总电阻相比它很小。在该传感系统中，葡萄糖和 pH 传感器包含一个双电极系统，该系统包含一个单独的工作电极和一个通用的 Ag/AgCl 参比电极。这些工作电极上的传感材料分别是普鲁士蓝/葡萄糖氧化酶 (PB/GOx) 和聚苯胺 (PANI)，它们通过电沉积在相应的电极上制备。MFWD 可以监测伤口部位或周围的最小生理变化，提供信息以确定感染的严重程度并防止伤口退化。鉴于愈合或感染过程的复杂性，我们研究了葡萄糖、pH 值和温度传感器的性能，以确保准确可靠的伤口监测。
葡萄糖传感器在 200 × 10-6 和 4 × 10-3 M 之间的浓度范围内校准（图 4c），这对应于慢性和愈合伤口的典型伤口环境中的葡萄糖浓度在 0 到 2×10-3 M 范围内，该葡萄糖传感器表现出优异的线性度；从线性拟合曲线的斜率计算的灵敏度系数 (SC) 等于 ≈1.72 μA mm-1，其中回归系数 (r2) 为 0.968（图 4d）。葡萄糖传感器在连续测试十次后稳定，显示出良好的可重复性。在选择性方面，传感器在伤口环境中存在几种潜在干扰物质（包括尿酸和抗坏血酸）的情况下与葡萄糖发生特异性反应（图 4e）。葡萄糖传感器可以保持活跃数天，不使用时存放在 4 oC 的黑暗中。
pH 传感器在环境条件下使用实时开路电流电位 (OCP) 测量进行校准。图 4f 显示了 pH 传感器在 4 到 10 之间的 pH 范围内的 OCP 与时间曲线，它涵盖了感染伤口渗出液的相关 pH 范围。pH 传感器显示出出色的线性响应，SC 和 r2 分别为 -30.8 mV pH-1 和 0.991（图 4g）。液体的体积对 pH 传感器的性能没有影响。由于 GOx 的效率以及葡萄糖传感器的灵敏度会受到 pH 变化的影响，因此 pH 传感器还用于校准基于 GOx 的葡萄糖传感器的 pH 依赖性偏差，以确保实际操作中的准确性 应用程序。因此，具有高灵敏度和可靠性的校准 pH 传感器显示出监测伤口部位 pH 变化的潜力。
图5 MFWD传感性能的体外表征
5. 多功能伤口敷料的抗菌活性
MFWD 的抗菌活性，主要由 PUIDE-CTAB 部分控制，在体外针对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）进行测量，这两种细菌是大多数感染的罪魁祸首。为此，细菌悬浮液在 37 oC 下用 PUIDE-CTAB 培养，并在不同的孵育时间后提取，以测试光密度值（630 nm）并确定杀菌率。正如预期的那样，即使在培养 12 h内，PUIDE-CTAB 聚合物也具有明确的抗菌特性（大肠杆菌为 89.3%，金黄色葡萄球菌为 90.4%），表明有效的抗菌活性。与聚合物孵育 6 h后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活/死染色如图 5a、b 所示。碘化丙啶 (PI) 是膜不可渗透的，只能与死膜受损细胞的 DNA 结合，因此这里的荧光结果表明 PUIDE-CTAB 可能会破坏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的膜完整性。因此，扫描电子显微镜（SEM）用于观察PUIDE-CTAB处理后细菌细胞形态和膜完整性的变化（图5c，d）。值得注意的是，在没有 PUIDE-CTAB 干扰的情况下，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞形态均正常，表面光滑（图 5c-i，d-i）。然而，在用弹性体处理后，观察到显着的形态变化和破坏。事实上，细菌的表面变得皱纹和不完整，表明弹性体对膜完整性有重大影响（图 5c-ii、d-ii）。弹性体的有效抗菌活性主要是因为CTAB带有许多正电荷。这使得阳离子共聚物通过静电粘附优先被带负电的细菌吸引，导致细胞跨膜电位的有效破坏并最终导致细菌死亡。进一步验证 CTAB 对 PUIDE 抗菌活性的作用 CTAB 大肠杆菌悬浮液与 PUIDE 一起培养 24 h。PUIDE处理组的光密度值远高于PUIDE-CTAB组，表明PUIDE没有抗菌活性，即聚合物的抗菌活性确实与CTAB有关。当 CTAB 的质量比高于 1% 时，聚合物在体外对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率显着提高。但是CTAB本身具有一定的毒性，含有高浓度CTAB的聚合物对生物体是外来物。因此，就报道的敷料系统而言，PUIDE-CTAB在保证良好抗菌效果的条件下含有适量的CTAB。
为了检查 MFWD 在促进感染伤口愈合方面的抗菌活性，进行了透气性测试（图 S25，支持信息）。为此，将完全密封容器的 PUIDE-CTAB 与在边缘留下小间隙的 MFWD 进行了比较，MFWD 的两片连接在此处。结果表明，与纱布相比，MFWD的透气性较差。尽管如此，这种较差的渗透性足以维持伤口处的潮湿环境，这对于促进恢复是必需的。在感染伤口恢复实验中，使用金黄色葡萄球菌感染性皮肤缺损模型与医用胶带和 PUIDE 治疗组进行比较（图 5e；图 S26，支持信息）。结果表明，MFWD 治疗后感染皮肤伤口面积在 3 天后显着减少。伤口面积的定量分析（图5f）显示，MFWD组7天后的平均伤口面积仅为9.9±2.5%，而医用胶带和PUIDE组的平均伤口面积保持在48.9±3.8%和27.8% 分别为 3.2%。这些观察结果清楚地表明，与医用胶带和 PUIDE 相比，MFWD 在加速伤口愈合方面具有更好的效果。
这种促进伤口愈合的能力可归因于添加 CTAB 的聚合物的抗菌特性，它通过保持伤口适当湿润和无菌来抑制细菌生长。为了评估再生皮肤伤口组织的组织病理学结构，对第 3 天和第 7 天收集的伤口皮肤进行 H&E 和 Masson 三色染色（图 5g）。显然，MFWD 组表现出较弱的炎性细胞浸润、更多的成纤维细胞迁移和更厚的肉芽组织。胶原蛋白沉积是伤口愈合的重要指标；用马森染色使纤维呈蓝色，相对强度表示胶原蛋白含量。在第 3 天和第 7 天，与两个对照组相比，MFWD 组的胶原蛋白沉积最高，这反过来可能导致伤口组织重建和愈合速度加快。为了证实 MFWD 的炎症调节，进行了血管内皮生长因子 (VEGF) 的免疫荧光染色和中性粒细胞检测（图 5h）。MFWD组再生创面组织VEGF表达最高，定量分析Ly6g-Ly6c比例表明MFWD组小鼠血液中中性粒细胞表达最低，表明创面愈合较好，炎症较少。
图6 MFWD 抗菌性能的评价。活/死染色的共聚焦显微镜，以评估细菌的生存能力
6. 无缝缝合伤口和感染伤口监测
以上结果表明MFWD具有优异的自愈性能、抗菌活性和生物相容性。所有这些特性都非常有利于治愈感染的伤口。为了估计 MFWD 的无缝伤口闭合和感染伤口监测行为，在愈合过程中记录了闭合速率和伤口相关参数（温度、pH 值和葡萄糖）。图 6a 给出了原位动物研究的示意图。使用全层皮肤切口模型测试 MFWD 的无缝伤口闭合能力。小鼠背部切口用缝线和MFWD封闭，用胶带覆盖的切口作为对照组。9 天后，胶带处理的皮肤切口明显有部分保留的间隙，而缝合和 MFWD 处理的组中没有间隙（图 6b），即缝合和 MFWD 处理的皮肤切口有痊愈了。还测量了切口断裂强度；图6c显示MFWD处理皮肤切口的断裂强度与缝合处理组几乎相同，但远高于胶带处理组，表明MFWD可以有效闭合伤口并促进伤口愈合一种无缝的方式。组织学分析表明，缝合组和MFWD处理组的真皮组织几乎完整且增厚，并且可以看到一些皮肤附属物（例如毛囊），表明伤口几乎完全愈合（图6d）。Masson 染色还显示致密且组织良好的胶原纤维沉积在 MFWD 处理的切口周围。
为了探索感染/未感染愈合过程中伤口相关参数的变化，测量了有/无细菌感染的伤口的葡萄糖、pH 和温度（图 6e-g）。第二天记录的结果显示感染和未感染伤口之间的葡萄糖、pH 值和温度存在显着差异。以往的研究表明，感染伤口的葡萄糖浓度范围低于正常愈合伤口，并且感染会升高温度并将pH值从酸性变为碱性。然而，未感染的温度和pH值升高伤口可能是由于正常的炎症反应或伤口部位微环境的变化引起的轻度感染/炎症反应。此外，伤口表面的 pH 值和温度峰值出现在第 2 天，主要是因为白细胞在炎症阶段被吸引到损伤部位。葡萄糖浓度在第 4 天急剧上升，很可能是因为小鼠的饮食和实验前活动。但随着感染创面的恢复，葡萄糖浓度保持在相应的正常范围内，说明MFWD对感染创面有一定的治疗作用。第二天后，未感染/感染伤口的温度和pH值下降。虽然感染创面的生理指标高于未感染创面，但呈下降趋势。这表明受感染的伤口正在逐渐愈合，很可能是由于 MFWD 的抗菌特性。
图7 MFWD无缝线伤口闭合和感染监测特性的原位评估
本文报告了基于新型自修复弹性体的 MFWD 的设计和开发，用于无缝缝合和实时温度监测愈合区域的 pH 值和葡萄糖。自修复弹性体 (PUIDE-CTAB) 具有出色的机械强度、柔韧性和生物相容性。CTAB 中的阳离子含量赋予 MFWD 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（分别为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌）的有效抗菌活性。这样，12小时内杀菌率可达≈90%，赋予MFWD促进感染伤口愈合的能力。体内动物研究证明了 PUIDE-CTAB 的出色自愈特性以及 MFWD 通过机械力收缩伤口边缘以实现有效无缝伤口闭合的能力。借助集成传感系统，MFWD 可以通过监测温度、pH 值和葡萄糖浓度来全面报告伤口状态，以确保伤口恢复正常。考虑到这些特点和优势，这种新型的基于弹性体的自修复 MFWD 具有成为独特的医疗保健设备的巨大潜力，可通过无创伤口闭合和及时伤口监测来辅助伤口管理。
文章来源：
https://doi.org/10.1002/adma.202106842
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