气管是一个单一的软骨和膜性管道，对通气和清除上呼吸道分泌物至关重要。部分气管位于颈部区域，一小部分则穿过胸骨切迹进入胸腔。成年男性气管的结构平均长度为 11.8 厘米（范围为 10 – 13 厘米），从环状软骨下缘到隆突顶部的宽度为 1.6 – 2.4 厘米。气管近似圆柱形，后部扁平，由 18 – 22 个 C 形透明软骨环组成（图 12.1）。气管的后部是一个肌肉结构（膜部），在流入和流出压力下伸展。在隆突水平，气管分为左右两个主支气管，使呼吸系统保持连续。右主支气管更垂直，而左主支气管相对于气管更水平，婴儿的两个支气管则更横向。一般来说，婴儿超过一半的气管位于颈部，而成年人的气管一半位于胸骨切迹上方。由于气管的运动，在颈部屈伸时这一比例会发生变化。儿童时期，软骨比成年人更薄，侧向更容易压缩。随着年龄的增长，气管的横截面形态可能会发生显著改变，特别是在患有慢性阻塞性肺疾病的情况下，可能会导致不同形状的畸形，具有潜在的临床意义。
图12.1.人类气管示意图。
气管是一个单一的软骨和膜性管道，对通气和清除上呼吸道分泌物至关重要。部分气管位于颈部区域，一小部分则穿过胸骨切迹进入胸腔。成年男性气管的结构平均长度为 11.8 厘米（范围为 10 – 13 厘米），从环状软骨下缘到隆突顶部的宽度为 1.6 – 2.4 厘米。气管近似圆柱形，后部扁平，由 18 – 22 个 C 形透明软骨环组成（图 12.1）。气管的后部是一个肌肉结构（膜部），在流入和流出压力下伸展。在隆突水平，气管分为左右两个主支气管，使呼吸系统保持连续。右主支气管更垂直，而左主支气管相对于气管更水平，婴儿的两个支气管则更横向。一般来说，婴儿超过一半的气管位于颈部，而成年人的气管一半位于胸骨切迹上方。由于气管的运动，在颈部屈伸时这一比例会发生变化。儿童时期，软骨比成年人更薄，侧向更容易压缩。随着年龄的增长，气管的横截面形态可能会发生显著改变，特别是在患有慢性阻塞性肺疾病的情况下，可能会导致不同形状的畸形，具有潜在的临床意义。
气管的血液供应对气管外科治疗至关重要，主要来自甲状腺下动脉的三个气管食管分支。第一个分支供应下颈部气管，第二个和第三个分支分别供应中部和上部。发自主动脉的支气管动脉供应隆突和气管的最下部。从到达气管的血管可以看到一个侧向纵向吻合，这对器官的整个血液供应至关重要。从这里，几条前横向软骨间动脉深入气管，在中线与对侧动脉吻合。这个血管网络到达气管内部和黏膜下层，形成黏膜下丛，为软骨提供唯一的营养，也是膜壁和黏膜的重要血液来源。在超微结构上，气管由透明软骨（形成气管环）、平滑肌细胞（形成膜部）组成，再深入是容纳血管丛的黏膜下层，如前所述。管腔表面覆盖着呼吸黏膜，由具有纤毛和杯状细胞的假复层柱状上皮构成。这两种不同类型的细胞对于产生黏液以湿润气道和利用摆动的纤毛排除异物至关重要（图 12.2）。
图12.2.气管壁的超微结构切片，显示透明软骨（A）、黏膜下血管丛（B）和黏膜层（C）.
02. 外科关注的病理
大约一半的气管可以通过端端吻合成功切除和重建，这是气管手术的基本概念。另一方面，涉及超过一半气管的病变需要生物或合成的气管替代品，但在一些临床情况下，会导致器官切除和气管造口，进而导致失声和潜在的气道感染。
一般来说，可以说所有涉及气管的病变都可能由于疾病的扩展而导致气管切除和替代。如研究人员所述，气管疾病可分为两大类：恶性和良性。气管肿瘤主要是恶性的，原发性肿瘤是鳞状细胞癌和 “圆柱瘤”（腺样囊性癌），而继发性气管肿瘤是隆突的支气管源性癌和甲状腺癌（由于其解剖关系）。在良性病变中，可以区分先天性疾病（气管发育不全、狭窄、食管气管瘘和喉气管裂）和获得性疾病（插管后病变和狭窄、声门下喉狭窄、气管食管狭窄和气管创伤）。
二、组织工程气管（TET）
01. 组织工程与气管替代
气管病变（如狭窄或癌症）的治疗通常需要气管重建。切除后进行原发性端端吻合是首选方法，通常对于长度不超过 50% 的缺损可以成功进行。不幸的是，在一些情况下，如广泛烧伤、创伤、肿瘤切除或插管后损伤，原发性吻合是不可能的。此外，先天性气管闭锁或狭窄的治疗可能因缺乏足够的组织进行手术重建而受到阻碍，因为涉及的气管长度可能较长。
在过去的 60 年里，临床和实验中尝试了多种气管重建方法，包括使用假体、自体移植物、同种异体移植物和异种移植物。如涤纶聚氨酯网、聚四氟乙烯、聚丙烯网、硅橡胶甚至玻璃管等假体都曾被尝试，但常常伴有感染、挤出和狭窄等并发症（表 12.1）。
表12.1：气管替代常用方法。
也使用过来自筋膜、皮肤、骨、骨膜、软骨、软骨膜、气管同种异体移植物、肌肉、食管、心包、硬脑膜和小肠等来源的自体和异质组织。无论如何，所有这些移植物的主要问题仍然是假体后期狭窄的发展。由于这些困难，研究人员仍在寻找理想的气管替代材料，这种材料能够满足气管假体模型的要求，并且在实际使用中安全耐用。
首先，如研究人员在 20 世纪 50 年代所述，气管替代品应该是一个侧向刚性和纵向灵活的管，尽管后一个要求被证明是理想的，但不是必需的。气管导管必须最初是密封的，并与相邻组织整合，以避免慢性炎症、肉芽组织、感染和侵蚀的发生。我们也不能忘记，由于不同的原因，特别是在需要移植的广泛气管癌中，免疫抑制方案是不利的。此外，为了使一种方法在实际中被考虑，导管的构建或插入技术必须在手术上简单直接，并且结果必须可预测地成功。最后，气管替代材料必须具有生物相容性、无毒、无免疫原性、无致癌性，随着时间的推移不会移位或侵蚀，理想情况下应提供或促进上皮重新覆盖，应避免狭窄或后期屈曲，抵抗细菌定植，避免分泌物积聚，并且必须是永久性结构。
自 1988 年以来，多个研究小组成功进行了软骨组织工程。研究人员使用内部涂有硅橡胶的长针织涤纶管，接种自体成纤维细胞，在静态培养后对 10 只杂种狗进行了气管替代。动物的长期存活率令人满意，结果令人鼓舞。同年，研究人员使用分离的牛软骨细胞和可生物降解的缝合材料（聚乳酸 910 和聚乙醇酸（PGA）），在无胸腺小鼠中创造了新的透明软骨，这些材料作为临时支架，细胞附着在上面，直到它们产生自己的基质。
这种方法的主要限制之一是气管的特定机械要求。气管必须在纵向保持灵活性，以允许头部自由运动，同时保持必要的刚性，以防止呼吸时气管塌陷。在天然组织中，这是通过软骨环的存在来实现的，而软骨管并不能充分模拟这一点。出于这些原因，研究人员设计了另一项研究，以评估具有螺旋形状的自体组织工程软骨为功能性气管替代物提供结构成分的能力（图 12.3a）。
图12.3.（a）用硅胶模具制作工具包制作的螺旋模板。（b）将接种软骨细胞的基质放置在模板的凹槽中（箭头），并用接种成纤维细胞的网包裹整个模板。
软骨细胞和成纤维细胞分别接种在直径为 14 毫米的 PGA 纤维无纺网上。将接种软骨细胞的网放置在用硅橡胶模具制作工具包制成的螺旋模板的凹槽中，然后用接种成纤维细胞的网覆盖（图 12.3b）。这些植入物被放置在裸鼠的皮下袋或绵羊的颈部。8 周后从绵羊颈部取出组织工程气管，并吻合到绵羊气管 5 厘米的缺损处。大体形态和组织形态与天然气管相似，组织学显示存在成熟的软骨，周围有结缔组织。其他生物材料也与软骨细胞结合使用，以生产高质量的组织工程软骨，包括藻酸钙凝胶、胶原蛋白凝胶、纤维蛋白胶和琼脂糖凝胶等。
研究人员评估了使用绵羊气管和鼻中隔软骨来源的软骨细胞，创建呈圆柱形软骨结构形状的工程气管等效物的可行性。气管和鼻软骨细胞分别接种在 PGA 基质上，然后将这些细胞 – 聚合物构建体皮下植入裸鼠体内 8 周。这种方法表明，气管和鼻软骨细胞的细胞产量和所得工程软骨的特性非常相似（图 12.4）。
图12.4.接种在聚乙醇酸（PGA）纤维无纺网上 8 周的气管软骨细胞（a）和（c）以及鼻软骨细胞（b）和（d）的外观，用于创建组织工程气管（TET）。
在后续研究中，同一研究小组评估了用鼻上皮细胞衬里其管腔来生产复合工程气管等效物的可行性。首先将软骨细胞悬浮液接种在 PGA 基质上。将细胞 – 聚合物构建体包裹在硅管周围，在体外培养一周，然后植入裸鼠背部的皮下袋中。6 周后，将上皮细胞悬浮在水凝胶中，在取出硅管（此前用作工程构建体的内部支撑）后，注入嵌入的软骨圆柱体中。4 周后取出植入物，植入物的形态类似于天然绵羊气管，而组织学显示存在成熟的软骨和假复层柱状上皮的形成。在随后的研究中使用了其他聚合物，也取得了同样的成功，包括 PGA 和 PGA / 聚 – L – 乳酸共聚物的无纺网。
最近，研究人员进行了一项研究，使用可生物降解的水凝胶和不可生物降解的高密度聚乙烯（HDP）作为内部预定形状的支架，用人鼻中隔软骨细胞重建气管。体内植入 8 周后，收获 TET 构建体。TET 构建体的宏观外观表明，HDP 构建体 80 – 90% 被淡黄色有光泽的软骨样组织覆盖，没有任何炎症迹象。
研究人员设计了一种轴向生物合成预制皮瓣，用于重建 10 只兔子的环形气管缺损。用从近端耳朵获得的无毛上皮替代内部黏膜衬里，用聚丙烯网替代气管软骨，用胸外侧筋膜替代气管外膜，以确保良好的血液供应。然后将上皮移植物、聚丙烯网和胸外侧筋膜围绕硅胶导管放入管中，并放置在颈部皮下区域 2 周。取出硅胶导管，将预制的新气管适配到天然气管形成的缺损处并进行吻合。4 周后通过放射学、宏观和组织学检查评估构建体。
在高水平的积极研究中，基本上有三个新兴概念：使用和开发动态体外培养系统（生物反应器）、使用和开发微制造技术来创建血管化组织和器官，以及在组织工程中寻找和使用合适的多能未分化干细胞。为组织产生动态体外微环境可能是引导具有特定结构和功能特征的组织形成的重要方面。已经研究了通过动态细胞接种和生物反应器对软骨形成的体外调节。研究人员发现，对流组织培养生物反应器中的流体动力学条件可以调节组织工程软骨的组成（基质成分）、形态、机械性能和机电功能。这些初步结果对于人类 TET 替代品的开发是令人鼓舞的，并且组织工程已成为解决器官短缺问题的一种迅速扩展的方法。
02. 首例人体组织工程气管假体移植
基于之前的成功研究，研究人员进行了管状气管人体移植。一名 30 岁患有终末期气道疾病的女性患者接受了左主支气管的完全切除，并用生物工程人体气管进行了替代。这是通过使用从活检中分离的自体上皮细胞和软骨细胞，随后在体外培养来实现的。汇合的细胞以每毫升 1×10^6 个细胞的相同密度，分别接种在从一名 51 岁女性移植供体获取的脱细胞气管段基质上，软骨细胞接种在外部表面，上皮细胞接种在内部。新接种的气管段在生物反应器中孵育 96 小时，以控制细胞增殖和基质沉积。之后，患者接受了重建手术，结果良好。术后过程顺利，在 14 天、1 个月、2 个月和 3 个月时，移植物看起来健康。这是生产组织工程气管替代品的一个非常重要的步骤，为气道重建的未来带来了很大希望。
03. 气管软骨、结构和生物力学
由于器官的结构和功能复杂性，为了实现可行的气管类似替代品，必须分别考虑各种组织成分。显然，气管环的软骨成分将在功能性组织的发展中发挥核心作用，它能够抵抗吸气塌陷，同时具有足够的灵活性。
气管软骨是一种透明软骨，是一种复合材料，其中胶原蛋白纤维（主要是 II 型）浸没在水合蛋白聚糖基质（聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、透明质酸）中。其主要功能是在呼吸过程中，尽管胸内压存在差异，但仍能保持气道壁开放，否则气道壁会塌陷并限制气流。此外，软骨环对于确定气管的尺寸和顺应性至关重要；实际上，当跨壁压力为正时，软骨环限制膜部脱垂，当跨壁压力为负时，限制其内陷。人类气管软骨由富含胶原蛋白的外层浅表区、富含蛋白聚糖的核心和富含胶原蛋白的内层浅表区组成。在每个表面，软骨的浅表区与胶原性软骨膜之间存在逐渐过渡。软骨细胞位于陷窝中，被细胞外基质包围，在浅表富含胶原蛋白的区域中，细胞靠得更近，并与最近的软骨表面平面平行扁平排列。浅表区的胶原纤维与软骨表面平面定向，而在软骨的更深层，胶原纤维的定向不太规则，蛋白聚糖含量减少（图 12.5）。
图12.5.气管软骨不同区域的扫描电子显微镜图像（SEM）：（a）管腔表面在左侧，可见软骨细胞陷窝在基质中大量规则分层（比例尺：40μm）。（b）（a）中框选区域的高倍视图，显示管腔浅表区。成排的胶原纤维（箭头）相互垂直定向（比例尺：10μm）。（c）外周外层的 SEM 图像，左侧为软骨膜（比例尺：100μm）。（d）（c）中框选区域的高倍视图，显示该侧沉积的垂直纤维（比例尺：10μm）。
气管软骨的生物力学特性是其结构特征的结果。气道软骨的任何生物力学变化都可能影响最大呼气流量和咳嗽的力学。与年龄相关的气道软骨生物力学特性和生化组成的变化，可能由于气道平滑肌的缩短而影响气道动力学。
气道软骨的平衡拉伸模量可能与正常呼吸最直接相关，在正常呼吸中，软骨为气管肌提供相对恒定的负荷，并在气管肌张力在数分钟到数小时内发生变化而产生的一系列气道直径范围内保持气道壁的刚度。此外，如对关节软骨的研究所表明的，这种组织中的平衡拉伸模量可能与蛋白聚糖无关。相比之下，在用力呼气或咳嗽时，跨壁压力在不到一秒的时间内发生变化，气道软骨的粘弹性特性可能对维持气道口径最为重要。在持续力或瞬态力作用下，气管软骨的抗弯曲能力取决于离中性轴最远的层（即外层浅表区）的拉伸模量和软骨中心区的压缩模量。拉伸模量主要是胶原纤维组织的函数，而压缩模量是聚集蛋白聚糖的函数，聚集蛋白聚糖在中心区含量丰富。文献中有大量关于气管软骨杨氏模量值（E）的实验数据，其值因年龄相关的个体变化或软骨部分和层的不同而差异很大，导致结构不均匀，而泊松模量（v）通常是恒定的（表 12.2）。
表12.2.人类气管软骨的力学特征（拉伸性能）。E 是杨氏模量值；n 是泊松模量值
三、静电纺可生物降解管状气管支架
01. 支架与组织工程
本节描述了通过静电纺丝制备的可生物降解微结构管状支架的开发过程，该支架模拟兔天然气管的形状和功能特性，并对其进行体外和体内实验评估。工程组织替代物的结构在调节组织生长中起着重要作用。支架的主要功能是组织传导，因此，它必须允许细胞附着、迁移到支架上或支架内、细胞增殖和细胞分化。它还必须提供一个环境，使细胞能够维持其表型，并合成所需的蛋白质和分子。支架的特性包括高孔隙率、高表面积、结构强度和特定的三维（3D）形状。
尽管已开发出多种用于气管替代的工程组织支架结构，但生产出临床有用的组织支架这一目标仍远未实现。理想的工程组织支架应具有机械稳定性，并能够在植入部位发挥生物学功能。机械稳定性主要取决于生物材料的选择、支架的结构设计以及细胞与材料的相互作用。支架设计的最终目标是生产出一种理想的结构，能够替代天然细胞外基质（ECM），直到宿主细胞重新填充并合成新的天然基质。为了实现这一目标，必须仔细选择支架材料，并设计支架结构，以确保接种的细胞与工程支架具有生物相容性。组织工程支架的表面化学性质取决于材料的类型，范围从天然生物聚合物到合成聚合物。最常用的天然生物聚合物包括脱矿骨基质、琼脂糖和胶原蛋白、透明质酸、基底膜或藻酸盐。使用的合成聚合物包括可降解聚酯，如聚乙醇酸（PGA）和聚乳酸（PLA）及其共聚物，聚（D，L – 丙交酯 – 共 – 乙交酯）（PLGA）。这些可生物降解的聚合物在临床上使用历史悠久，目前用于各种组织工程应用。此外，宿主组织在植入物周围形成纤维包膜的趋势是支架生物相容性面临的一个重要挑战。
多孔植入物的包封部分取决于其材料结构特征。一般来说，多孔生物材料植入物有两种结构：由相互连接的纤维制成的（纤维多孔网）和由相互连接的孔隙制成的（多孔网）。软组织对它们的几何特征都很敏感。基本上，孔径较小（<50 – 80μm）的材料比孔径较大（>80 – 100μm）的材料经历更少的组织向内生长和更多的包封。研究人员证明了纤维直径和孔径尺寸对静电纺纤维多孔网上细胞粘附和增殖的重要作用（图 12.6）。
图12.6.包封率与纤维间距的关系。只有 6μm 间距的网在周边显示出包封。所有网都显示出单个纤维的一些包封。
然而，很明显，严格控制纤维直径很重要。文献中的一些研究表明，大直径纤维网被包封的原因与网内单个纤维周围的包膜形成有关。相邻纤维的包膜最终可能相互作用，在植入物的整个周边形成单个包膜。只有在纤维间距较大的情况下，相邻纤维周围包膜之间的相互作用以及随之而来的周边包封才会避免。对于小直径纤维，大多数纤维不会被包封，相邻包膜之间的相互作用减少，避免周边包封所需的纤维间最小间距也会减小。因此，根据文献报道，理想的纤维多孔网纤维直径为 6 – 25μm，纤维间距为 30 – 80μm，可促进细胞粘附、活力、增殖以及营养物质的交换（图 12.7）。
图12.7.二维模型显示纤维多孔网理想的纤维内间距（30 – 80μm）和纤维直径（6 – 25μm），使其更适合细胞的粘附、增殖和分化。
静电纺丝技术能有效制备直径在 0.05 – 5μm 的极细纤维，可用于多种领域，如分离膜、伤口敷料材料或人造血管。在我们的研究中，选择了 DegraPol® 聚合物，因为它结合了传统聚酯的优点，具有高加工性和显著的弹性；对其应用的研究已开展很长时间，尤其在软骨组织工程领域成果显著，可促进细胞的附着、生长和增殖。研究人员指出，DegraPol® 以不同形式（如泡沫）在体外和体内进行了成功测试，使用了多种细胞。
东莞市富临塑胶有限公司是Degrapol在中国的代理商，富临塑胶为中国客户提供植入级可吸收聚氨酯Degrapol。
02.DegraPol®：用于组织工程的可降解嵌段聚酯氨酯
DegraPol® 是一种可降解的嵌段聚酯氨酯，由聚（（R） – 3 – 羟基丁酸）二醇的结晶嵌段和聚（ε – 己内酯 – 共 – 乙交酯）二醇的嵌段通过二异氰酸酯连接而成。作为一种嵌段共聚物，DegraPol® 兼具传统聚酯的高延展性和显著弹性。长期以来，人们一直在研究将 DegraPol® 泡沫和多孔膜用作组织工程支架，尤其在软骨、气管和平滑肌组织工程领域成果斐然。大量证据表明，DegraPol® 在体外和体内均具有良好的生物相容性。研究人员在其研究中描述了体外培养的成纤维细胞、巨噬细胞和 osteoblasts 对该材料结晶区域的反应。据报道，巨噬细胞对结晶片段的吞噬作用会导致剂量依赖性的细胞激活、细胞损伤和细胞死亡，但成纤维细胞不受影响。此外，这些研究表明，DegraPol® 表现出良好的细胞相容性，不会对 osteoblasts 和软骨细胞产生细胞毒性作用。在另一项研究中，研究人员还将通过压缩成型制成薄膜（直径 5mm，厚度 150μm）的聚酯氨酯样品皮下植入大鼠体内；体内实验结果显示，植入两个月后，包膜厚度低于 30μm。研究人员描述了 DegraPol® 作为神经引导通道管状结构的体内性能，表明与聚合物降解相关的炎症反应不会干扰神经再生过程。最近，研究人员通过静电纺丝制备了新型微纤维膜形式的 DegraPol® 支架，纤维直径约为 10μm，纤维间距约为 10μm。这一进展，结合上述关于该聚合物生物相容性的研究结果，表明 DegraPol® 有望用作气管软骨组织工程的支架。
03.DegraPol® 的特性
通过凝胶渗透色谱（GPC）测量，所用电纺聚合物的分子量为 60765Da，其化学组成包括硬段（40%）和软段（60%），这使得该材料在 37.5°C 的水中具有特定的长期降解行为，如图 12.8 所示。
图12.8.DegraPol® 在 37°C 缓冲水溶液中的降解情况。水合 4 周后，聚合物的平均 Mp 降至初始值的约 45%。12 周时，该值进一步下降，接近起始值的 25%。25 周内，平均 Mp 值低于 10000Da（Mp 为峰值平均分子量，Mw 为重量平均分子量）。
04.DegraPol® 电纺管状支架
通过在直径 5mm 的实心圆柱形旋转铁制收集器（转速约 300rpm）上收集纤维，获得了一种小管状结构，该收集器固定在钻头上，与移液器相距 20cm（图 12.9）。
图12.9：收集器纺锤体，由一个直径 5mm 的金属圆柱体固定在钻头上。纺锤体上可见一层薄（白色）纤维。
首先将 DegraPol® 氯仿溶液（默克公司）加热至最高 40°C，防止聚合物固体颗粒在熔化过程中降解。改变静电纺丝和 / 或溶液参数时，观察到收集的纤维有显著变化：
0401.溶液流速
流速增加时，纤维直径增大，如图 12.10 所示。流速为 1.19ml/h、2.38ml/h 和 3.57ml/h 时，平均纤维直径分别为 10μm、20μm 和 25μm。
图12.10.三种 DegraPol® 氯仿溶液在不同流速下进行静电纺丝：纤维直径随流速增加而增大。（a）1.19ml/h，（b）2.38ml/h，（c）3.57ml/h（比例尺 = 50μm）。
0402.温度
图 12.11 为不同环境温度条件下制备的网状纤维的扫描电子显微镜（SEM）图像。由于纤维的相互连接和熔化，电纺支架的孔隙率似乎随环境温度（T）而变化，即温度升高，孔隙率降低。第一张照片（SEM）拍摄于夏季，环境温度约 25°C，湿度 60%；中间一张拍摄于冬季，环境温度约 20°C，湿度 40%。第三张图像中，收集器纺锤体预先浸入液氮（ – 170°C）中，纤维完全分离，孔隙率显著增加。
图12.11.在不同热条件下获得的三种支架表面，温度越高，相互连接的纤维越多。（a）25°C，（b）20°C，（c）预先浸入液氮中（比例尺 = 50μm（a，c）和 100μm（b））。
0403.浓度
溶液浓度在形成具有特定尺寸、纤维内空间和孔隙率的网状纤维过程中起主要作用。聚合物含量越高，溶液粘度越大，导致平均纤维直径和孔隙率增加，纤维间连接减少，如下所述。25 – 27% 的溶液浓度完全符合我们的要求。
经过各种测试，得到了直径为 10 – 25μm、纤维内空间为 30 – 70μm 且孔隙率良好的网状纤维，这是由于纤维间连接较差所致。图 12.12 表明，在表 12.3 所列条件下获得的网状纤维与图 12.7 所示模型相似。
图12.12.静电纺支架截面的 SEM 图像，纤维间距根据文献标准测量。
表12.3.制备静电纺网状纤维所使用的操作条件和溶液性质。
四、支架的完善
01. 支架轮廓的选择
在哺乳动物中，气管的结构和轮廓在身体、头部和颈部运动导致的极端弯曲情况下，能保持气管固定的横截面积，防止其内腔阻塞和由此导致的呼吸骤停。这种特殊的生理行为源于沿气管和支气管规则分布的软骨环，促使我们创建具有这种特定结构特征的支架。因此，我们研究了三种不同的轮廓模型：螺旋形、环形和齿形，它们具有相同的功能特性，尽可能模拟哺乳动物气管的解剖特点和功能需求，如图 12.13 所示。目的是确定这三种轮廓模型中哪种在形状和功能上表现最佳，然后可在临床前动物模型中进行测试。
图12.13.研究的三种气管支架模型及相关尺寸（mm）。所有模型的内腔直径均
02. 螺旋形轮廓的开发
在受到弯曲应力时，螺旋形轮廓可防止结构扭结，因为线圈相互碰撞填充环间空间，同时保持内腔不变。首先，将一个直径 0.8mm 的极细管状结构螺旋缠绕在收集器丝（直径 0.5mm）上，然后再覆盖一层直径为 6 – 25μm 的纤维，为结构提供稳定性和坚固性。得到的螺旋形支架（图 12.14）显示出图 12.13 中描述的所有设计特征。这种静电纺结构的实际问题在于纤维沉积不均匀，主要发生在线圈附近，导致局部高孔隙率（>80 – 100μm）结构，不利于细胞存活。内部螺旋缠绕管也存在同样问题，尽管它在细胞培养过程中有利于生长因子的通过。最后，结构的组装也带来许多问题，如手动从丝上取出小管或在特定距离将管缠绕在纺锤体上。
图12.14.静电纺制备的气管支架类型 1：螺旋形轮廓。展示结构抗扭结性能。外部结构（a）和手动弯曲（b）。
03. 环形轮廓的开发
最初使用直径 5mm、厚度 1mm 的静电纺管状支架来开发环形支架。该支架用环己烷覆盖并缓慢浸入干冰中冷冻后，垂直固定在刀片上进行下一步处理。使用低温环境（ – 20°C）下运行的冷冻切片机（英国 Shandom “Microtome” 5030）将管状支架切割成 2mm 长的环。将相同的 5mm 收集器纺锤体插入间隔 1mm 的环中，并再涂覆一层直径为 6 – 25μm 的静电纺纤维。这种情况下出现的问题与螺旋形支架相同，环附近孔隙率不一致和组装问题是主要问题。环形支架如图 12.15 和图 12.16 所示。
图12.15.环形轮廓。显示支架环水平纵向截面的图像。
图12.16.静电纺制备的气管支架类型 2：环形轮廓。外部结构（a）和手动弯曲（b）展示结构抗扭结性能。
04. 齿形轮廓的开发
静电纺丝设备和溶液的起始条件（表 12.3）保持不变，包括使用直径 5mm 的收集器纺锤体。首先，将收集器纺锤体浸入液氮中几秒钟，然后立即进行静电纺丝纤维沉积。大约 30 分钟后，获得了一层 2mm 厚（直径 6 – 25μm）的纤维，然后对支架进行机械车床加工。在这种情况下，使用 1mm 厚的金属切割刀片，沿支架纵向切割 2mm（图 12.13），在纺锤体上留下 0.5mm 厚的纤维层。通过一次加工获得的纤维层克服了前两种支架中孔隙率不一致的问题。此外，该方法在可控的自动化操作步骤中进行。齿形支架如图 12.17 所示。
图12.17.静电纺制备的气管支架类型 3：齿形轮廓。外部结构（a）和手动弯曲（b）展示结构抗扭结性能。
05. 内层
为了获得一个内部均匀的表面，避免组织过度生长、表面倾斜和狭窄，我们决定在气管支架的内腔安装一个极薄的静电纺微孔层（厚度约 100μm，纤维直径 20 – 25μm），该层能够允许气体、生长因子和细胞营养物质渗透，同时避免细胞增殖和软骨组织生长，否则会导致内腔阻塞。这个微孔层是通过静电纺丝一种不同的溶液制备而成，该溶液由 16%（w/w）的 DegraPol® 溶解在 90% 的氯仿中，并添加 10% 的甲醇。在冷冻和涂覆最终纤维层之前（见 12.4.4 节），通过在环境温度约 25°C 下对收集器纺锤体进行约 1 分钟的静电纺丝纤维沉积处理，获得了这个特殊的层。图 12.18 为得到的内层的 SEM 图像。
图12.18.由溶解在氯仿和甲醇（90:10 混合）中的聚合物溶液制备的 DegraPol® 静电纺微孔内层的 SEM 图像。
五、细胞和组织反应的体外和体内评估
如前所述，组织工程的主要方法之一是在植入前将细胞接种并培养在三维支架上。与支架几何形状相关的其他基本要求，如孔隙率、孔隙连通性或孔径大小，对于确保细胞接种、附着和迁移后在体外形成功能性组织非常重要。此外，研究表明，在单层培养中扩增时，软骨细胞会去分化，呈现更扁平的外观，并产生 I 型而非 II 型胶原蛋白；然而，通过将细胞转移到三维培养系统中，可以挽救软骨细胞的表型。
我们最初的体外实验研究了软骨细胞在静电纺微结构支架上的静态培养，以确定我们的支架是否为细胞粘附和增殖提供了良好的三维环境，以及软骨细胞表型是否得以保留。随后，我们研究了动态培养 14 天对体外构建气管组织的影响和可靠性。最后，我们确定了哪种组织采集技术最简单、最安全且侵入性最小，以及软骨细胞的最佳来源。因此，我们研究了从新西兰白兔不同解剖部位分离和扩增软骨细胞，以确定理想的细胞接种浓度。
01. 体外静态培养
简要来说，从新西兰白兔的剑突、肋软骨和股骨软骨中获取自体软骨细胞，用 0.3% 的胶原酶 II 进行消化，然后对细胞进行连续传代培养。在扩增期（6 – 8 周）后，将软骨细胞以每毫升 25×10⁶个细胞的接种密度，接种到半切开的支架外表面，并在体外静态培养细胞 – 聚合物构建体（图 12.19）。静态细胞接种 5 天后，扫描电镜图像显示软骨细胞在支架上均匀分布，这表明气体和营养物质能够进行适当的交换（图 12.20a 和 b）。
图12.19.扫描电镜显微照片显示软骨细胞在 DegraPol® 齿形轮廓基质的接种区域表面进行 5 天静态培养（放大倍数 12 倍）。
图12.20.扫描电镜显微照片显示静态培养 5 天后，软骨细胞在支架表面的粘附和浸润（a）以及在三维支架纤维内空间的情况（b）。
02. 体外动态培养
我们设计了一个带有特制生物反应器的培养模型系统，以便更好地使静电纺气管支架被细胞定植，通过严格控制培养参数，促进营养物质从培养基运输到附着的细胞。简要地说，将支架安装在生物反应器上，将软骨细胞悬液接种到支架外表面，并缓慢旋转以覆盖支架的整个圆周。接种后的支架转移到培养箱（37°C，5% CO₂）中，在培养基中培养约 2 小时以增强细胞附着。之后，逐渐开启生物反应器，使其转速达到 5 转 / 分钟，再过 2 小时后转速提高到 7 转 / 分钟，直至培养期结束。
在生物反应器中培养 14 天后，通过环境扫描电子显微镜（ESEM）对支架进行成像。图像显示细胞附着在支架上，其扁平的形状、细胞铺展以及细胞边缘的模糊表明了这一点。图像还显示细胞通过许多丝状伪足附着在材料纤维上，这些丝状伪足在纤维间隙中清晰可见（图 12.21）。
图12.21.生物反应器中动态培养 14 天后支架的 ESEM 图像。（a）细胞铺展和纤维间定植表明细胞成分与支架纤维的良好附着；（b）为（a）中白色矩形框的放大图。
支架设计和加工的有效性得到了证实，因为附着的细胞仅限于支架的外环：在凹槽底部和环壁上形成的孔隙堵塞有效地阻碍了细胞附着（图 12.22）。
图12.22.支架凹槽底部微结构的 ESEM 图像：加工过程中形成的孔隙堵塞有效地阻碍了细胞附着。
对支架纵向切片的检查表明，细胞对基质厚度的定植情况令人满意：大量细胞深入渗透，在距外表面约 570μm 处观察到大量细胞聚集体。使用抗 II 型胶原单克隆抗体对动态培养后的支架样本进行免疫细胞化学检查，结果显示在 DegraPol® 纤维的表面和内部均存在软骨细胞（图 12.23）。II 型胶原阳性细胞数量较多，在支架外表面形成一层薄的细胞层，随着向支架内部深入，细胞数量逐渐减少。
图12.23.免疫细胞化学图像显示支架表面有大量阳性细胞（白色箭头），且细胞有向纤维内部深入渗透的趋势。II 型胶原阳性细胞数量在支架外表面较多（a）和（c），随着支架厚度增加数量减少（b）（比例尺 = 50μm）。
为了研究机械刺激对细胞的潜在影响，通过聚合酶链反应（PCR）测定 II 型胶原、I 型胶原、聚集蛋白聚糖和甘油醛 – 3 – 磷酸脱氢酶（GADPH，作为对照）的基因表达。对软骨细胞在接种前和在生物反应器中动态培养后的基因表达进行初步测试，半定量结果如图 12.24 所示。结果表明，两个样本中 II 型胶原的表达均保持恒定，而动态培养后的样本中 I 型胶原的表达显著下降。聚集蛋白聚糖基因表达在生物反应器培养前后的样本中表现相似。生物反应器培养后的样本中信号较弱，这可能与软骨细胞产生的细胞外基质较少有关。对天然软骨组织、接种前和生物反应器培养后的样本进行比较，结果显示这三种组织类型之间存在显著差异，但仅在 I 型胶原的表达上（p < 0.001）。II 型胶原的表达在天然组织和组织工程气管（TET）之间具有统计学意义，但在动态培养前后的组织之间无统计学意义，这与动态刺激后的预期结果相反。
图12.24.软骨细胞在两个不同时间点的基因表达：接种前和在生物反应器中动态培养后。GADPH 相关频带的存在表明扩增反应结果良好，证实了 I 型和 II 型胶原的预期结果。
03. 体内实验过程
在兔子体内，将特制的齿形轮廓气管支架植入以颈总动脉和颈外静脉为血液载体的独立血管皮瓣中（图 12.25），实验数据展示了静电纺聚合物在自然生物环境中的表现，重点包括降解性、生物相容性以及诱导血管生成的能力。该支架由三个长度为 2.0mm 的 360° 环组成，环间间隔 0.5mm。管状支架的外径为 6mm，内径为 5mm，整个长度由 1cm 的静电纺 DegraPol® 构成，纤维直径为 6 – 25μm，纤维间距为 30 – 80μm，分子量为 60765Da。
图12.25.兔子的颈总动脉（箭头）和颈内静脉（箭头头）形成的血管轴。小心地保留了迷走交感干的完整性。
为防止组织向内生长，在支架管腔内插入了特氟龙圆柱体。兔子被分为 3 组：第 1 组、第 2 组和第 3 组分别代表植入 2 周、6 周和 8 周。组织从血管轴开始侵入，并随着时间向远离血管蒂的区域发展。在所有动物中，气管支架周围均明显存在一层薄的纤维结缔组织（图 12.26）。
图12.26.对用于血管生成（星号）和新组织形成（箭头头）的复杂血管蒂支架的宏观评估。兔子分为三组：G1、G2 和 G3，分别代表植入 2 周、6 周和 8 周。图像清晰显示从血管轴向支架上和通过支架的新血管组织随时间逐渐生长。
在 8 周的植入期内，聚合物并未完全吸收。在所有检查样本中，成纤维细胞和纤维状基质直接与 DegraPol® 支架接触（图 12.27a – h）。最初（第 1 组），只有少数细胞和纤维状基质附着在支架上并在其中延伸（图 12.27a – d）。随着时间推移，细胞和纤维状基质的数量和量显著增加，8 周后（第 3 组），支架外表面部分被覆盖（图 12.27e），而聚合物纤维被纳入密集的纤维组织中，其间有细胞分布（图 12.27f，h）。
图12.27.扫描电镜图像显示（a） – （d）植入 2 周后，DegraPol® 支架部分被细胞和纤维状基质覆盖，细胞与支架纤维紧密接触（箭头头），并通过可见的丝状伪足在纤维间桥接（箭头）。植入 8 周后（e） – （h），细胞和纤维状物质的数量和量增加，覆盖了 DegraPol® 支架更大的面积（比例尺：（a）50μm，（b）5μm，（c） – （h）20μm）。
组织学检查显示，从支架外侧开始，有明显的细胞和细胞外纤维状基质，向管腔内延伸（图 12.28）。
图12.28.组织学分析。早期可见散在的纤维血管侵入迹象（a）。大血管腔（白色星号）的存在证明了新血管生成过程（b，c），其中填充有不同数量的红细胞（黑色星号）（苏木精 – 伊红染色）。
细胞侵入贯穿支架厚度（图 12.29a – c），在组织沉积最多的区域，可见明显的新生血管（图 12.29c）。正如预期的那样，靠近血管载体的支架区域比距离较远的区域更早被成纤维细胞样细胞侵入。血管蒂区域通过组织沉积和新血管形成，早期就出现了新血管生成的迹象。在所有植入的支架中，在靠近血管蒂的位置观察到充满红细胞的大血管腔。少量巨噬细胞（炎症细胞）参与了反应过程，主要集中在血管附近。没有证据表明存在其他参与免疫过程的细胞，这证实了聚合物及其纤维结构具有良好的生物相容性。
图12.29.切除的气管支架的半薄横截面（a） – （c）。细胞和纤维状物质逐渐向 DegraPol® 支架中心侵入。透射电子显微镜图像显示被细胞和纤维状物质覆盖的 DegraPol® 支架的细节。可见大量纵向切片的胶原束（d），成纤维细胞样细胞（e）被横截面的胶原束包围（箭头头），还有小肌纤维（f）和微小血管（g）。假体横截面（h，i）显示胶原沉积增加，填充生物聚合物网络（h）并围绕新血管（i，v）。免疫荧光（j，k）使用抗 CD31 单克隆抗体、抗 SMA（l）、抗 CD14（m）和抗组织蛋白酶 B（n），可见肌纤维（l）、巨噬细胞（m）和产生组织蛋白酶 B 的细胞（n）（白色箭头头）。DegraPol® 支架在与组织蛋白酶 B 酶在 37°C 孵育 1 小时前后的冷冻切片（o）和（p）。由于酶的降解作用，生物聚合物纤维断裂并尺寸减小（p）（比例尺：（a） – （c），（i） – （p）100μm，（d） – （f）2μm，（g）4μm，（h）50μm）。
透射电子显微镜（TEM）评估显示细胞被胶原纤维包围（图 12.29d 和 e）。新合成和分泌的胶原组织成紧密堆积的纤维，排列规则且平行，形成束状（图 12.29d 和 e）。具有铺展表型的成纤维细胞样细胞侵入周围的细胞外基质（图 12.29e）。随着细胞增殖并向中心迁移填充支架孔隙，可见小肌纤维（图 12.29f）和形成毛细血管结构的内皮细胞（图 12.29f 和 g）。光学免疫荧光染色显示，从支架表面开始，胶原沉积逐渐增加并填充生物聚合物网络（图 12.29h）。在侵入过程结束时，胶原也在新血管周围沉积（图 12.29i）。为此使用了光学显微镜、电子显微镜、免疫组织化学和免疫细胞化学方法。检测祖细胞（活化内皮细胞 – ECs）的单克隆 CD31 抗体分析表明，阳性细胞明显聚集在支架外表面（图 12.29j），而在细胞侵入后不久，CD31 的表达定位于形成血管壁的内皮细胞（图 12.29k）。细胞数量随时间增加，许多细胞分化为肌纤维，通过 α – SMA（α 平滑肌抗体）的表达得以验证（图 12.29l）。在所有样本中，可见少量表达 CD14 的炎症细胞（图 12.29m），而大多数具有明显迁移和铺展表型的细胞对组织蛋白酶 B 呈强阳性反应，组织蛋白酶 B 是一种参与多种生物学机制（如新生血管生成）的蛋白水解酶（图 12.29n）。
我们的分析表明，随着时间推移，CD31 阳性细胞发生迁移，CD31 通常由早期的共同髓系祖细胞或造血干细胞衍生的内皮祖细胞表达。基于 CD31 是内皮分化早期指标的假设，CD31 阳性细胞被确定为从血管蒂迁移并随后定植于 DegraPol® 支架全层的前体细胞。支架显示出大量的新组织形成，通过用细胞和由胶原组成的细胞外纤维状基质填充纤维间隙，逐渐替代生物聚合物纤维。形态学和免疫细胞化学特征与内皮细胞迁移、迁移干细胞在不同细胞类型中的空间分布和分化一致。
组织蛋白酶 B 在现有细胞中的阳性表达表明其具有通过迁移和侵入过程促进血管生成的特性，这在之前的体外和体内研究中已有描述。组织蛋白酶 B 似乎参与了多种病理过程，如肿瘤血管生成、神经退行性变或腹主动脉瘤，但它如何调节血管生成、细胞增殖、侵袭和凋亡仍知之甚少。此外，我们简单的酶活性分析表明，组织蛋白酶 B 可能与生物基质的降解类似，对聚合物的降解也有作用。我们的数据显示组织蛋白酶 B 在前体细胞中的表达以及 CD31 和 SMA 的表达，这与细胞的迁移和血管生成阶段一致。
据我们所知，这是首次在体内评估聚合物支架降解过程中发现组织蛋白酶 B。进一步研究组织蛋白酶 B 与 DegraPol® 在化学结构方面的相互作用，将有助于我们了解聚合物的哪一部分会发生降解过程。
六、结论
基于天然气管的解剖结构，利用静电纺丝技术设计了一种新型管状气管构建体。该方法使我们能够制备出具有优化几何结构的微结构支架，有利于细胞的粘附、生长和增殖。齿形轮廓具有理论上的功能特性，可防止植入的支架在生理运动时发生扭结或塌陷。静电纺丝过程形成了三维微纤维网络，其纤维直径最佳（6 – 25μm），纤维间距为 30 – 80μm，表面具有开放孔隙，这被视为允许适当气体流动以及生长因子和细胞营养物质交换的黄金标准。此外，在支架内添加了一层极薄的微孔内层，以防止组织向内生长，避免支架管腔缩小。
在动物体内植入后未出现异物反应，证实该结构的架构与天然细胞外基质相似，表明静电纺支架适合作为组织替代品。这种气管工程支架具有特定的轮廓，环表面具有开放孔隙（接种区域），环间壁上具有封闭孔隙，可控制和引导细胞附着和增殖，随着聚合物纤维随时间水解和降解，驻留细胞能够构建自身的细胞外基质。极薄的微孔内层在允许气体流动以及生长因子和细胞营养物质交换方面非常有用，同时防止组织向内生长，从而避免支架管腔缩小。
使用动态培养生物反应器系统证明了细胞接种过程的高效性。支架的运动不会妨碍细胞粘附到纤维表面，反而似乎促进了细胞在支架纤维厚度方向上的迁移，这有利于维持细胞表型。
体内研究结果表明，这种可生物降解的聚合物为纤维组织沉积和整个管状支架厚度内的新生血管形成提供了良好的底物，这对于支架的稳定性和上皮生长至关重要。展望未来，可以设想一种新的支架设计，利用宿主的生物过程来引导更复杂和生理性的组织再生。
公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810
