目录
《过继性细胞疗法》
目录
一、 过继性细胞疗法概述
1.1 肿瘤免疫的生物学背景
1.2 过继性细胞疗法
1.3 过继性治疗细胞的制备
二、 过继性细胞疗法市场分析
2.1 过继性细胞疗法技术优势
2.2 不同过继性细胞疗法比较
2.3过继性细胞疗法市场分析
2.4过继性细胞疗法产业模式和阻力
2.5 过继性细胞疗法的监管
三、过继性细胞疗法及产品
3.1 过继性细胞疗法市场当前竞争格局
3.2 过继性细胞治疗相关国外公司
3.3 过继性细胞治疗相关国内公司
四、 小结
一、过继性细胞疗法概述
1.1 肿瘤免疫的生物学背景
1.1.1 肿瘤微环境
在肿瘤治疗过程中，肿瘤微环境显着影响治疗结果与预后。肿瘤或基质细胞分泌的可溶性因子可以诱导肿瘤微环境产生耐药性和免疫抑制性。肿瘤细胞与基质成纤维细胞或细胞外基质成分的粘附也会减弱治疗反应。微环境靶向治疗策略集中在抑制细胞外配体-受体相互作用和下游通路。免疫细胞在肿瘤微环境中的激活状态可能会有所不同，可以改善也可以阻碍治疗效果。因此，免疫反应的重编程将有益于肿瘤治疗。
肿瘤微环境（TME）包括各种细胞类型（内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞等）和细胞外成分（细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质等），它们围绕在肿瘤细胞周围并由血管网供给营养。TME不仅在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着关键作用，而且对肿瘤的治疗效果也有深远的影响。肿瘤细胞与其周围基质之间持续相互影响的环境往往产生耐药性。
肿瘤微环境中的免疫细胞包括：先天免疫细胞（巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、树突细胞、髓源性抑制细胞和自然杀伤细胞）和适应性免疫细胞（T 和 B 淋巴细胞），他们之间通过直接接触或趋化因子与肿瘤细胞相互作用，通过细胞因子信号传导塑造肿瘤的行为及其对治疗的反应。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是 TME治疗反应的关键调节因子。在实体瘤中，TAM的主要来源是循环单核细胞，而不是肿瘤内增殖的常驻巨噬细胞。骨髓中的单核细胞来源于骨髓祖细胞，它们可以通过血液循环进入肿瘤，随后分化为巨噬细胞。巨噬细胞根据其极化状态可分为M1和M2亚型。M1巨噬细胞可被Th1细胞因子干扰素γ(IFNγ)和微生物产物激活。相比之下，M2巨噬细胞响应Th2细胞因子而分化，例如IL-4、IL-10和 IL-13。在TAM的背景下，M1巨噬细胞被认为发挥杀肿瘤作用，而 M2 巨噬细胞促进肿瘤发生。M1和M2 TAM都具有可塑性和可逆性，TME在调节TAM的功能极化中起主要作用。在癌症治疗期间，化疗药物会引发由TAM协调的误导性组织修复反应，导致促进肿瘤生长和抑制抗肿瘤功效。髓源性抑制细胞 (MDSCs) 是一种异质的髓源细胞群，包括髓系祖细胞和未成熟巨噬细胞、未成熟粒细胞和未成熟树突状细胞。这些细胞在肿瘤发生过程中扩增，并抑制各种T细胞反应。MDSCs 也可以主动迁移到肿瘤部位，在那里它们迅速分化成TAMs。
肿瘤相关内皮细胞(TECs)与正常内皮细胞的很多特征不同，包括增殖、迁移和对生长因子（即 EGF、VEGF）和化疗药物的反应。越来越多的证据表明，肿瘤细胞会触发TECs的免疫抑制活性，从而影响抗肿瘤免疫和治疗反应。TME中的 TECs 可以通过抑制分子的表达来抑制T细胞功能，例如程序性细胞死亡配体 1 (PDL1) 和 PDL2 。TECs的血管细胞粘附分子1(VCAM1)、E-选择素、细胞间粘附分子1 (ICAM1)、ICAM2的表达降低，阻止了肿瘤特异性细胞毒性T 细胞募集到肿瘤病灶中，影响了免疫细胞的浸润。
图1 肿瘤与微环境相互作用关系
图片来源：公开文献
1.1.2 免疫检查点
免疫检查点分子，包括抑制性和刺激性免疫检查点分子，被定义为对免疫反应发挥抑制或激活作用的配体-受体对。迄今为止描述的大多数免疫检查点分子都在适应性免疫系统的细胞中表达，特别是在T细胞和先天免疫系统的细胞中。它们对于维持自体耐受性和调节不同组织中免疫反应的时间长度和强度幅度以最大程度地减少组织损伤。越来越多的证据表明，抑制性或激活性免疫检查点分子在相当大一部分肿瘤类型中表达。虽然肿瘤细胞相关免疫检查点分子的主要功能被认为是介导免疫逃避，据报道，肿瘤细胞上表达的免疫检查点分子在维持许多恶性行为中也发挥着重要作用，包括自我更新、上皮-间质转化、转移、耐药性、抗细胞凋亡、血管生成或增强的能量代谢。免疫检查点的数量越来越多，如 PD-L1、PD-1、B7-H3、B7-H4、LILRB1、LILRB2、TIM3、CD47、 CD137 和 CD70。抑制性免疫检查点和激活性免疫检查点都因其在免疫逃逸中的独特作用而成为药物研究的主要靶点，例如申请PD-1和PDL-1单克隆抗体可以在多种类型的肿瘤中有效地重新激活休眠的免疫反应。
图2 主要免疫检查点
图片来源：公开文献
PD-L1（也称为 B7-H1 或 CD274）是 B7 家族的成员，是一种290个氨基酸的I型跨膜蛋白。PD-L1可在T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、髓树突细胞、B细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和多种肿瘤细胞上表达。PD-L1通过与免疫细胞上的PD-1结合，抑制T细胞活性和增殖，促进T细胞无能和耗竭，诱导活化的 T 细胞凋亡，帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的监管。PD-1是一种288个氨基酸(aa)的I型跨膜蛋白，PD-1是肿瘤特异性免疫的重要检查点受体，PD-1的阻断抗体在治疗多种实体瘤中显示出显着的疗效。在黑色素瘤细胞表面表达的PD-1会触发 mTOR 的胞内下游效应子，该效应子不依赖于 PI3K-AKT 信号传导，以促进肿瘤发生和免疫逃避。B7-H3，也称为CD276，是一种I型膜蛋白，其序列与PD-L1的细胞外结构域相似。它主要在抗原呈递细胞 (APC) 上表达，刺激 T 细胞反应和 IFN-R 产生，参与 T 细胞的抑制。
1.2 过继性细胞疗法
图3 TAA 特异性和 TAA 非依赖性过继免疫疗法的示意图
图片来源：公开文献
图4 过继性细胞疗法分类
图片来源：公开资料
1.2.1 LAK
虽然近年来基于T细胞（TAA 依赖）的 ACT 方法已得到广泛研究，但不依赖TAA的过继治疗的技术细节仍未阐明。临床应用中大多数不依赖 TAA 的 ACT 策略可以划分为一些主要的细胞类型，称为自然杀伤 (NK)、淋巴因子激活的杀伤 (LAK) 细胞、细胞因子诱导的杀伤 (CIK) 细胞和细胞因子诱导的 NK (CINK) 细胞。它们都是从体外发育而来的PBMCs在类似的细胞因子环境中孵育，并且都依赖于类似于NK 细胞的杀伤机制。
对于LAK细胞，白细胞介素2(IL-2)是最广泛使用的用于杀伤细胞离体扩增的细胞因子。与未引发的淋巴细胞相比，用 IL-2 引发淋巴细胞可增强其对肿瘤细胞的杀伤能力。第一个用于癌症治疗的离体扩增杀伤细胞始于 1980 年代 Rosenberg 及其同事，他们首先证明了淋巴细胞与高剂量（800-1000 U/ml）IL-2 的孵育会产生一组效应子对同基因和自体肿瘤具有有效体外细胞毒性的细胞。该小组将这种细胞群定义为淋巴因子激活杀伤 (LAK) 细胞。在IL-2制剂中培养PBMC导致异常杀伤细胞亚群的激活与扩增，即淋巴因子激活的杀伤细胞，具有不同于CTL介导的细胞毒性的针对肿瘤的非经典细胞毒性。这种现象被称为 LAK 活性，以区别于CTL介导的细胞毒性。尽管最初的报道声称 LAK 细胞是不同于 NK 或 CTL 的细胞群，但最新研究表明NK 细胞仅占 LAK 细胞的 50%。，进一步的表征显示它们主要由 CD3 – CD56 +细胞（经典的自然杀伤细胞）、CD3 + CD56 +细胞（后来称为自然杀伤 T 细胞或 NKT）和 CD3 + CD56 – T的一小部分组成。并且它们的抗肿瘤活性不受 MHC 限制。有趣的是，祖细胞的表型分析产生 LAK 细胞，表明在培养过程中从缺乏T细胞和NK细胞标志物的祖细胞转变为具有 T 细胞标志物的效应细胞。有证据表明，CD3 T 细胞在 LAK 制剂中的比例和效应贡献受细胞暴露于 IL-2 的时间段的影响，特别是当这些 T 细胞通过添加抗 CD3 抗体进一步刺激时。与长期暴露于 IL-2 相比，CD3 + T 细胞对 LAKs 杀伤活性的总体贡献小于在 IL-2 中培养 3-5 天的 PBMC 中较小。
目前LAK 细胞的临床应用不如体外和临床前结果那样有希望。虽然在肾癌和黑色素瘤患者的第一次临床试验中过继转移自体 LAK 细胞和大剂量施用 IL-2 的结果似乎非常有希望，但该效果归因于高剂量的 IL-2，并且使用 IL-2 本身可以获得类似的反应。这种失败促进了杀伤细胞离体扩增制备培养基的进一步改进，并研发出更有效的杀伤细胞，即CIK 细胞。
CIK细胞在体外和体内都比LAK细胞具有增强的细胞毒性和扩增/增殖率。Schmidt-Wolf 等人首先报道了CIK细胞的体内抗癌潜力。证实 CIK 细胞可抑制肿瘤负荷并延长人类淋巴瘤小鼠模型的存活时间。多项临床研究表明 CIK 治疗后高效、低毒和延长生存期。迄今为止，CIK 细胞是临床试验中最成功的不依赖TAA的杀伤方式。CIK细胞治疗已在肝细胞癌患者中取得极佳疗效。在肾细胞癌患者中也报道了成功的希望。
为了增加 CIK 制剂中CD3- CD56+ NK 细胞的比例，Carlens等提出了一种离体扩增方案，该方案可从未选择的PBMC群体中产生更高纯度的具有最高单细胞细胞毒性能力的NK细胞。该方法依赖于在IL-2和重组抗人CD3抗体OKT3存在下将未选择的PBMC置于补充有5%人血清的无血清CellGro SCGM培养基中21天。最终产物平均包含55%的NK细胞，这种升级版CIK细胞被命名为“细胞因子诱导的自然杀伤 (CINK) 细胞”。CINK 细胞在体外显示出有效的抗肿瘤活性。已经表明，使用含有细胞因子和抗 CD3 抗体 OKT3 的培养基，可以从骨髓瘤患者的未分离PBMC中扩增高度活化的CINK细胞。2008年，该小组报告说，如果从骨髓瘤患者中获得PBMC，该方案可实现NK细胞在培养20天后平均扩增1600 倍，而其他方案只有100-200 倍扩增。
图5 LAK/CIK细胞作用机制
图片来源：公开文献
1.2.2 CAR-NK
图6 种系编码的激活和抑制受体控制 NK 细胞的激活
图片来源：公开文献
图7 CAR的设计方案
图片来源：公开文献
CARs的设计必须考虑到 NK 细胞的独特特性，才能进行 CAR-NK 细胞治疗。DNAX激活蛋白(DAP12)在 NK 细胞上表达并参与NK 激活受体NKG2成员C（NKp44）的信号转导。具有DAP12胞内结构域的CAR在启动下游信号方面与CD3ζ-CAR 一样有效。在另一个 NK 激活受体 NKG2 成员D (NKG2D)连接后，通过磷酸化 DAP10发生信号转导，进而募集下游信号效应分子，最终导致NK 细胞分泌细胞因子。这些表达 CAR 的 NK (NKG2D-DAP10-CD3ζ) 细胞对骨肉瘤和前列腺肿瘤具有很强的抗肿瘤作用。
图7 CAR-NK 作用机制
图片来源：公开文献
1.2.3 TIL
肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 疗法是一种过继性细胞疗法，利用患者自身的免疫系统来治疗肿瘤。在TIL治疗中，通过活检或手术从肿瘤部位分离出TIL，在体外用白细胞介素 2 (IL-2) 刺激并扩增，然后回输到患者体内。1982 年，该领域的先驱 Steven Rosenberg 博士和美国国立卫生研究院(NIH)的同事首次从多个小鼠肿瘤模型中分离出TIL，在MC38结肠腺癌模型中，TIL和IL-2 同时给药治愈了100%的肝转移小鼠和50%的肺转移小鼠，为TIL在人类晚期癌症治疗中的应用奠定了基础。临床上最早的TIL治疗尝试可以追溯到1988年，在转移性黑色素瘤中取得了60%的客观缓解率（ORR）。
TIL主要由T细胞、B细胞和NK细胞组成。在不同时期激活的 TIL 具有不同的表型和异质性。在 TIL 中，大多数细胞是CD3阳性的。新鲜分离的TIL中CD25+细胞比例较低，加入IL-2后CD25+细胞比例增加。CD4 或 CD8 在同一病变的独立培养物中的表达表现出多样性。
图8 肿瘤中的TIL
图片来源：公开资料
临床免疫治疗中除了T细胞的效应，B淋巴细胞在免疫治疗中也起到关键作用，它们的存在与不同癌症类型的预后改善有关，包括乳腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、CRC、肝细胞癌和头颈部鳞状细胞癌。在功能上，B细胞可以作为T细胞的 APC，促进局部肿瘤相关的T细胞反应。对人类癌症中B细胞克隆扩增和免疫球蛋白表型转换的观察进一步表明，由分泌抗体的浆B细胞促进，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在抗肿瘤体液免疫反应中可能发挥作用。肿瘤浸润性 B (TIL B)细胞还可以通过分泌毒性细胞因子（如 IFNγ 和颗粒酶B）直接杀死肿瘤细胞，或通过促进肿瘤特异性 T 细胞分泌免疫刺激性细胞因子间接杀死肿瘤细胞。
图9 TIL中的B细胞
图片来源：公开文献
图10 TIL治疗策略
图片来源：公开资料
1.3 过继性治疗细胞的制备
1.3.1 LAK的制备
单采技术和磁性细胞分离方案的出现带来了NK细胞纯化和培养的巨大转变，因此大量NK细胞很容易从白细胞产品中分离出来。2000年，实现了通过即时输注纯化的 NK 转化为临床应用细胞。单采产品通常含有 5-15% 处于非激活状态的NK细胞。因此，从单次采样获得大量纯NK细胞的富集过程是不可避免的。富集方案可能包括用CD3- CD56+严格纯化细胞获得高纯度 NK 细胞或可能仅包含一种或两轮 CD3+细胞消耗。这种用于 NK 细胞的快速富集方案在用于 cGMP 应用的 CliniMACS (Miltenyi) 细胞富集系统出现后成功实施，并首次被 Miller 等人在在过继性 NK 细胞治疗临床试验中使用。
虽然通过这种方法得到的NK细胞制剂对肿瘤细胞具有细胞毒性，但是最终产品中存在高水平的 T 细胞污染，NK 纯度几乎无法达到 60-70% 以上。为了避免 T 细胞污染，CD3 消耗后来被添加到该方法中，以防止在同种异体环境中发生GVHD。CD3+ T 细胞是单采产品中最常见的污染细胞类型。单步CD3 消耗可以将NK细胞纯度从PBMC中的仅5%提高到最终输出的25%中位数，甚至最多超过40-50%。虽然 CD3+ 细胞从最终产品中大量耗尽，但残留的CD19+ B 细胞和 CD14+单核细胞在产品中富集，占产品的70%以上，这可以通过额外消耗CD19+ 细胞来解决，从而使 NK 细胞的纯度达到40%，或者可以合并消耗CD19 +细胞和CD33 +细胞，从而将 NK 细胞纯度提高到大于90%。尽管 NK 细胞的比例相对增加，但在富集策略中实现的NK细胞总数依然不足，因此单次输注需要大量的单采产品。大多数情况下，仅一种单采产品无法实现这一点。因此，随后在短期或长期内扩大阴性筛选的细胞群。由于新鲜分离的 NK 细胞通常处于非激活状态，因此通常通过与IL-2 孵育过夜来激活细胞。Shikava 及其同事首先证明了这些短期扩增的富含NK细胞的效应细胞在胶质瘤患者中的临床疗效和安全性。也有报道用 IL-15 隔夜激活。此后，在存在多种细胞因子的情况下，在有或没有饲养细胞的情况下长期扩增富含 NK 细胞的 PBMC，已在数百项研究中进行了研究以产生足够数量具有肿瘤杀伤活性的杀伤细胞。具体而言就是，在CD3耗尽后，将富集的 NK细胞在细胞因子或经改造以表达细胞因子或共刺激分子的饲养细胞的存在下培养 1-3 周。根据初始纯化的程度，最终的 NK 细胞产品显示出不同的纯度，并且可能仍包括污染的 B 细胞和单核细胞，最终产品中 NK 细胞的比例在67%到90%。
图11 从外周血中富集 TAA 非依赖性杀伤细胞
图片来源：公开文献
1.3.3 CAR-NK的制备
1.3.2.1 NK细胞的获取
与T细胞不同，NK细胞降低了GVHD的风险，因此打开了生产预先准备好的同种异体细胞治疗产品的可能性，这些产品可以提前制备并随时可供多名患者按需使用。目前，临床级 NK 细胞可以从多种来源大规模生产，包括 NK92 细胞系、PBMC、UBC、CD34 +造血祖细胞 (HPC) 和 iPSC。
目前大多数使用CAR-NK细胞的临床试验都使用NK92细胞系，因为它具有无限的体外增殖能力，并且对重复循环冻融的敏感性较低。这些特性为制造临床使用的“现成”CAR-NK产品提供了明显的制造时间更短，成本更低的优势。然而，作为肿瘤细胞系的NK92细胞具有固有的缺点，包括潜在的致瘤风险、缺乏CD16 和NKp44表达，以及输注前需要灭活而导致体内扩增潜力的丧失，使其不太可能成为理想的CAR-NK细胞治疗方法的细胞来源。人PBMC是原代NK细胞的重要来源，已用于许多临床试验。使用 NK 细胞分离试剂盒，可以轻松地直接从健康供体的PBMC中分离出足够数量的NK细胞，然后在NK细胞特异性扩增培养基中用细胞因子刺激和扩增，用于临床前或GMP级临床应用。激活的 PBMC 衍生的 CAR-NK细胞表达广泛的激活受体可以在没有辐射的情况下给药，这允许它们在体内扩增。PBMC 衍生的NK (PB NK)细胞，其中高达90%是 CD56lowCD16+ NK 细胞，通常表现出成熟的表型，具有较强的细胞毒性和较低的增殖能力。由于不存在GVHD风险，PB NK细胞可以从HLA 匹配或不匹配的供体中分离出来，这为捐助者提供了更多选择，从而提高了最终产品的质量。类似地，NK细胞也可以以同样的方式从UCB中分离出来。UCB库提供了选择具有某些HLA类型和特定NK受体谱的供体优势。然而，由于单个UCB细胞的体积有限，UCB NK细胞数量较少，这成为获得足够数量的 NK 细胞用于临床的主要障碍。此外，与 PB NK 细胞相比，UCB NK细胞表现出较不成熟的表型和对肿瘤细胞的较低细胞毒性，某些粘附分子、CD16、KIR、穿孔素和颗粒酶 B 的表达较低，而抑制分子如 NKG2A 的表达较高。此外，PBMC 和 UCB 衍生的 CAR-NK 细胞并非来自同质来源，因此难以标准化产品。
NK细胞与CD34+ HPC的分化是另一种获得大量成熟NK细胞用于临床应用的方法。CD34+ HPCs 可以从骨髓、胚胎干细胞、PB或UCB中分离出来，然后在培养系统中使用细胞因子混合物进行扩增和分化成成熟的 NK 细胞。这种方法产生的CD56+ CD3- NK 细胞大多类似于PB NK 细胞，表达激活的NK细胞受体，并在体外和体内表现出对白血病细胞的有效细胞毒性。
最近，iPSC已成为CAR-NK 细胞有吸引力的来源，这归因于其无限的增殖能力。与分化的NK细胞相比，iPSC 可以更有效地设计以稳定表达CAR。CAR-engineered iPSCs可以在含有干细胞因子 (SCF)、血管内皮生长因子(VEGF) 和骨形态发生蛋白4 (BMP4)的培养基中培养以分化成造血祖细胞，然后用IL3、IL-15刺激它们、IL-7、SCF 和 FLT3L 在培养基中分化成CAR-NK细胞，可以在经过辐照的表达mIL-21的人工抗原呈递细胞存在的情况下收获和扩增所得的CAR-NK细胞。在这个过程中，只需一个CAR-engineered iPSC细胞就足以分化成大量高度同质化的CAR-NK细胞产品供临床使用。然而，与UCB NK 细胞相似，iPSC 衍生的NK细胞通常以不成熟的表型为特征，与PB NK细胞相比，KIR和CD16表达较低，NKG2A表达较高。然而，iPSC NK细胞表达NK定制的CAR，而不是为T细胞设计的常规CAR，在体外和体内都显示出有效的抗肿瘤活性，因此为“现成的” CAR-NK 细胞产品最好的候选来源。
图12 CAR-NK产品的来源与制造
图片来源：公开文献
1.3.2.2 CAR的设计
到目前为止，大多数CAR-NK细胞研究使用专为CAR-T细胞设计的CAR构建体。最近，专门为NK细胞设计了新的CAR结构。然而，这些不同的CAR构建体对NK细胞的细胞毒性和细胞因子表现出不同的影响。今井等人，报道了含有4-1BB 共刺激结构域 (scFv-CD8 TM -4-1BB-CD3ζ)的第二代抗CD19 CAR可以在原代NK细胞中表达，从而克服抑制信号并诱导NK细胞特异性杀伤CD19+急性淋巴细胞白血病 (ALL)。含有 CD28 共刺激结构域的 CAR 结构也已被开发用于针对 HER2、EGFR 或 EGFR 变体 III和 CS1。但是与带有常规 4-1BB CAR 的转导 NK 细胞相比，含有 CAR 的2B4（NK 特异性共刺激结构域）的 NK 细胞获得显著增强的对肿瘤细胞的细胞毒活性、诱导快速增殖、增加细胞因子产生和减少细胞凋亡，表明 NK 细胞特异性激活信号会影响 CAR 性能。此外，具有不同信号域（包括 CD3ζ、DAP10 和 DAP12）的 CAR 构建体在原代 NK 细胞或 NK92 细胞系中诱导了不同的抗肿瘤活性：具有CD3ζ信号域的CAR显著优于含有 DAP10 信号域的 CAR，而基于 DAP12 的 CAR 又优于包含 CD3ζ 信号域的 CAR。为了优化NK细胞的CAR构建，Li及其同事在NK92细胞中表达了十种不同的抗间皮素CAR，并评估了它们在改善 NK 细胞介导的杀伤方面的作用。他们发现只有三个含有NKG2D TM结构域和2B4共刺激结构域的CAR（CAR4、CAR7 和 CAR9）表现出抗肿瘤活性的最大增加。提高这些含有 NKG2D TM 和 2B4 的 CAR 性能的可能机制是它们在间皮素高A1847 刺激条件下通过募集内源性 DAP10 来激活信号传导的能力。
表1 CAR-NK的CAR结构
1.3.2.3 CAR的表达
基于NK细胞的免疫治疗方法的主要障碍之一是在原代NK细胞中缺乏有效的基因转导方法。最近的许多研究表明，用逆转录病毒载体成功转导扩增的 NK 细胞，单轮转导后效率从27%到52%不等。用编码分泌型IL-15或膜结合型IL-15 (mIL-15)的基因对体外扩增的NK 细胞进行逆转录病毒转导，可实现70%的高转导效率。由于在 NK92 和活化的原代 NK 细胞中基因转移的这种高效性，逆转录病毒在最近的临床前和临床研究中已被广泛用于生成 CAR-NK 细胞。然而，外源基因插入引起的基因型改变和逆转录病毒转导引起的原代NK细胞活力下降是这种方法在临床应用中的主要限制。
与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转导代表了一种更安全的选择，因为它具有较低的基因毒性和插入诱变。但原代NK细胞中慢病毒转导的效率很低，通常需要多轮转导。最近，巴里等人用修饰的狒狒包膜糖蛋白（BaEV-gp）假型的慢病毒载体表现出比VSV-G假型对应物高20倍的转导效率。使用这种转导方法，CD19-CAR在平均70%的来自不同供体的原代人类NK细胞中成功表达，这些 CD19-CAR NK细胞可以有效且特异性地杀死 CD19 阳性肿瘤细胞。编码肿瘤特异性CAR的BaEV-gp假型慢病毒在NK92细胞中表现出近100%的转导效率，在活化的原代 NK 细胞或 iPSC 衍生的 NK 细胞中表现出 50~80% 的转导效率。因此，BaEV-gp 慢病毒可作为 NK 细胞中 CAR 基因转移的有前景的载体。同样，用长臂猿白血病病毒的包膜蛋白假型化的慢病毒也能有效地转导原代 NK 细胞。
鉴于原代 NK 细胞中遗传转导的困难，电穿孔和脂质转染等转染方法也已被用于将外源基因递送到 NK 细胞中。与病毒转导相比，NK 细胞转染可以实现基因表达更快、细胞凋亡水平更低、个体间差异更小、基因转移效率更高。然而，外源DNA通常不会整合到靶细胞的基因组中，因此转基因的表达是短暂的，并且在转染后约3-5天下降。已经开发了将转染方法与DNA整合技术相结合以产生稳定的转基因表达细胞。DNA转座子是可移动的DNA元件，可以通过“剪切和粘贴”机制在载体和染色体之间有效转座。PiggyBac (PB)和睡美人(SB)是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他转座子系统相比，哺乳动物细胞中的转座活性最高。PB 和 SB 转座子系统由两部分组成：介导“剪切和粘贴”功能的转座酶和两侧是两个末端反向重复序列 (TIR) 的 DNA 载体。通过将含有 CAR 的质粒与转座酶DNA组合转染到 iPSC 中，产生稳定表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。与病毒载体相比，这些转座子系统具有以下几个优点，包括低免疫原性、提高生物安全性、降低生产成本、以及转导长度大于100 kb的大基因片段的能力，使其成为一种有吸引力的选择CAR 插入 NK 细胞基因组并具有持久表达。尽管如此，转座子系统在转导原代 NK 细胞中的适用性仍需要进一步修改，以克服诸如质粒 DNA 电穿孔对 NK 细胞的低转导效率和致细胞病变效应等障碍。
基因转导方法通常会导致 DNA 随机整合到靶细胞基因组中，从而导致脱靶效应的潜在风险，例如可能引发细胞凋亡或恶性转化的必需基因或肿瘤抑制基因的沉默。CRISPR/Cas9技术已被开发用于具有高靶向特异性的靶向基因整合。CRISPR/Cas9系统可以在基因组的特定位点诱导永久性修饰，利用引导RNA将Cas9核酸酶引导至靶位点，产生双链断裂，然后通过同源定向重组插入新基因。CRISPR/Cas9 系统已被用于通过用 T 细胞中的 CAR 构建体替换内源性 TCR 基因座来生成同种异体通用 CAR-T 细胞。在 NK 细胞中，CRISPR/Cas9 系统可用于通过靶向 CAR 插入和稳定敲除或整合参与 NK 细胞耗竭、激活、耐受或记忆的感兴趣基因来增强 NK 细胞抗肿瘤功能。
1.3.2.4 体外扩增 CAR-NK 细胞
NK 细胞仅占外周血白细胞的一小部分，因此产生足够数量的 NK 细胞是患者过继性免疫治疗的主要挑战。几种细胞因子，如 IL-2、IL-15、IL-12、IL-21 和 IL-18，已用于体外扩增原代NK细胞。然而，这些细胞因子在体外诱导的NK 增殖通常是有限的。与刺激细胞共培养，例如 Wilms 肿瘤衍生细胞系，自体 PBMC， Epstein-Barr病毒转化的类淋巴母细胞和慢性骨髓性白血病衍生的细胞系 K562 细胞，可以诱导 NK 细胞快速和持续的增殖。用 mIL-15 和/或 4-1BB 配体 (4-1BBL) 转导的 K562 细胞比未转导的 K562 细胞获得了更大的增殖反应，这已适应产生大量临床级 NK 细胞。然而，由这些饲养细胞激活的原代 NK 细胞最终会变得对刺激无反应，并在连续增殖 8-15 周后衰老。与 K562 细胞相比，共表达CD64、CD86、4-1BBL、截短的CD19和膜结合的IL-21 (mIL-21) 的 K562 细胞可以促进对数期NK细胞扩增而没有衰老迹象长达6周。该方法还适用于大规模 GMP，最近成功用于生成大量 NK 细胞或 CAR-NK 细胞，用于 1 期和 2 期临床试验。在与 NK 细胞共培养之前，必须对 K562 饲养细胞进行致死照射，以确保在最终产品中检测不到增殖和存活的饲养细胞。
表达mIL-15的 NK 细胞在体外和体内表现出优异的增殖和存活率，并且对肿瘤细胞具有更高的细胞毒性。由 mIL-15 提供的顺式刺激甚至略优于在 K562 饲养细胞上表达的相同 mIL-15 的反式刺激。由于自分泌信号传导，NK 细胞表达 mIL-15 可以允许 NK 细胞治疗，而不会产生由外源性细胞因子给药介导的潜在副作用。共表达 mIL-15 的 CAR-NK 细胞在没有饲养细胞的情况下比没有 mIL-15 表达的 CAR-NK 细胞具有四倍的扩增效率。此外，用 IL-12、IL-15 和 IL-18 的细胞因子组合进行的短暂（12-16 小时）预激活诱导记忆样 NK 细胞，其在预激活后刺激数周至数月表现出对细胞因子或激活受体的增强反应。
1.3.3 TIL的制备
在TIL制备的早期，只有分离、扩增和输血三个阶段。随着研究的深入，在扩增前增加了筛选步骤，大大提高了TIL的有效性。医生首先通过手术获得新鲜的肿瘤组织。获得的组织要足够大，大于1cm3，并及时处理。然后，克隆不同类型的 T 淋巴细胞并与白细胞介素 2 一起培养。T淋巴细胞在白细胞介素2刺激下增殖形成细胞群。然后，它们与肿瘤细胞对增殖的 T 淋巴细胞发生反应。然后扩增肿瘤特异性 TIL。患者则是在接受了化疗后接受细胞输注。化疗可以增强肿瘤的免疫原性，从而增强免疫治疗，提高患者的治愈率和长期生存率。
图13 TIL产品的制造与使用
图片来源：公开文献
从肿瘤中分离 TIL 是 TIL 制备的第一步。目前，TIL可以通过实体瘤、癌性胸腔积液和转移性淋巴结的手术切除获得，然后可以通过机械法或酶消化法制备单细胞悬液。以往的TIL分离方法大多采用组织酶进行分离，但分离后的TIL功能较差，并伴有表面分子表达的变化。不同的肿瘤具有不同的特性，单个肿瘤可以很容易地分离出所需的TIL。肿瘤特异性TIL在PD1阳性CD8+TIL中比在PD1阴性CD8+TIL中更容易分离，筛选数百个T淋巴细胞克隆足以获得肿瘤特异性TIL。
TIL在使用之前要经过纯度测试。可以使用流式细胞术代替免疫组织化学。为了进一步提高TIL杀伤肿瘤细胞的能力，科学家们进行了相关研究。目前，在黑色素瘤中有一些方法可以提高 TIL 到达肿瘤部位的效率。CXCL1 和 CXCL8 在黑色素瘤细胞中高度分泌。黑色素瘤中TIL的趋化因子受体表达低于CXCR1。因此，可以选择CXCR1作为基因操作的靶点，以增强T细胞的迁移能力。Th9 细胞通过产生 IL-9 介导的 CD8 + T 细胞和表达 CCR6 的树突状细胞来破坏肿瘤。Th9细胞以IL-9R依赖性方式促进CD8+T细胞增殖。肿瘤中Th9细胞的数量与CD8 + TILs的数量呈正相关。研究人员提出设计肿瘤特异性CD8+T细胞瞬时表达IL-12，这在保持功效的同时降低了毒性。进一步从TIL获得的肿瘤特异性T淋巴细胞中获取其T淋巴细胞受体（TCR）的遗传信息，通过基因改造的方式转化患者外周血中的T淋巴细胞，然后转染回接受治疗的患者的方法解决了TIL寿命短，样品中TIL太少或没有的问题。细胞增殖、分化、氧化应激和DNA损伤状态是决定T细胞是否具有抗肿瘤能力的四个表型特征。T细胞增殖和CD62L标记的记忆T细胞比例与细胞治疗效果呈正相关。T细胞中活性氧（ROS）和gH2AX越少，T细胞的抗肿瘤能力越强。.
图14 提高TIL能力的方法
图片来源：公开文献
二、过继性细胞疗法市场分析
2.1 过继性细胞疗法技术优势
在过去的几十年中，免疫系统在癌症发展和治疗中的效力一直是研究的主要焦点。尽管靶向治疗和免疫检查点阻断的免疫治疗极大地提高了黑色素瘤和非小细胞肺癌等患者的生存率，但大部分患者在接受这些治疗后仍会出现疾病复发或没有疗效。过继细胞疗法 (ACT) 可以为这些患者提供额外的治疗选择，包括将肿瘤驻留或外周血修饰激活的免疫细胞回输静脉，转移到癌症患者体内，以增强抗肿瘤功能。目前，ACT可根据各自的作用机制分TAA依赖型和TAA非依赖型，主要有：嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）、T细胞受体疗法（TCR-T）、肿瘤浸润T细胞疗法（TIL）、CIK细胞、DC疗法、LAK疗法、NK疗法等。ACT已经成为继手术、传统化疗、放疗、分子靶向治疗之后的第五种肿瘤治疗方式。
传统治疗方法均具有局限性，他们通常作用于肿瘤细胞本身，一般在治疗初期会产生一定效果，但在长期治疗后的癌症晚期常出现复发和耐药。手术治疗癌症治疗中最传统的方法之一，但存在一定缺点，如手术的同时也切除一定的正常组织，术后亦有后遗症及功能的障碍，手术还存在一定的手术创伤所带来的加速转移和复发的风险。放疗是利用高能X射线或其他颗粒来破坏癌细胞并减缓肿瘤生长，且不会伤害附近的健康组织。放射治疗可被作为癌症的一线治疗，也可在手术或化疗后将放射治疗作为辅助治疗清除剩余的癌细胞，但使用放疗杀死癌细胞的同时也会杀死正常细胞。化疗是通过药物杀灭快速繁殖的细胞，其中包括癌细胞，但有时也包括健康组织。健康细胞和组织的破坏，常常会导致治疗相关的副反应，包括脱发、恶心和呕吐，以及血细胞减少等。靶向治疗是另一种常见的治疗方法，主要是针对癌细胞的基因发生的特定突变来发挥功效。虽然已经证实，靶向治疗可针对癌细胞产生显著的反应，且不伤害正常细胞，但是癌细胞具有很强适应能力会随着时间的推移产生抗药性，最终影响药物的疗效，并且靶向药物目前只能针对特定的肿瘤类型。
免疫细胞疗法相比于传统疗法具有如下优势：
生物安全性：利用改造自患者自体的免疫细胞治疗肿瘤, 无创伤且毒副作用相对较小，副作用轻，也无过敏排斥反应，能使患者得到更好的生活质量。
个体化治疗：不同个体体内生物学特性存在显著差异，同一种肿瘤在不同个体中甚至同一个体内都存在一定的异质性，因此，同一种治疗药物对于不同个体所患的同一种癌症可能会产生完全不同的治疗效果。免疫细胞疗法区别于传统治疗，可对单一特定患病个体提取其免疫细胞并进行针对性的改造，进而对疾病开展个性化治疗。
药效持久：改造后的免疫细胞可以在体外体内无限培育、增殖的潜力，一定周期的免疫细胞治疗结束后，可以持续为病人提供抗癌细胞免疫细胞，癌症抑制的效果可持续存在，并且不需要依靠持续给药维系。
无耐药性：耐药性指病原体与肿瘤细胞对化学治疗药物的敏感性降低，产生耐受性，是恶性肿瘤治疗过程中的一大障碍。从目前临床效果的统计数据来看，免疫细胞疗法产生耐药性的概率要远低于化药和靶向药物。
2.2 不同过继性细胞疗法比较
目前众多过继性细胞疗法中也存在各自的优势与弊端。
表2 不同过继性细胞疗法比较
2.3过继性细胞疗法市场分析
根据全球市场情报机构Fiormarkets发布的新报告，2017年全球细胞治疗技术市场大概达112亿美元。2018年至2025年的复合年增长率为16.81%，预计到2025年市场值将超过340亿美元。2014至2018年中国细胞免疫治疗行业市场规模从 570.6 亿元增长至 925.4 亿元，年复合增长率达到 12.9%。政府和私人组织对细胞治疗临床试验的资金投入增加，以及引进有效的细胞疗法制造指南正在推动着市场的快速发展。
目前，免疫细胞疗法基本被用于癌症患者的末线治疗，且由于价格、可及性等方面的原因，短期内免疫细胞疗法很难向更早阶段癌症的一二线治疗大范围渗透，因此，可将免疫细胞疗法视为癌症患者二线治疗失败后的市场治疗需求。在此基础上，通过潜在客户群体、免疫细胞疗法的价格和渗透率三项数据进行估计，可大致测算出未来免疫细胞疗法的市场空间。
GLOBOCAN 2020数据库显示，2020年全球新发癌症19,292,789例，9,958,133例癌症患者死亡。大约一半的新癌症病例和58%的死亡病例发生在亚洲。其中，中国占全球新诊断病例的24％，占全球癌症死亡人数的30％。约有457万新发病例。假设所有癌症患者中接受手术、化疗等一线治疗的比例为90%，需进一步接受二线治疗的患者比例为70%；接受二线治疗后仍会有80%的患者出现转移或者复发，这部分患者群体即为免疫细胞疗法的潜在客户，占每年新增癌症患者的比例为50.4%。
定价和渗透率方面，目前在已在国内上市的自体CAR-T免疫细胞治疗成本约120万元/例，但随着更多产品的获批上市，市场竞争加剧，同时考虑自体CAR-T免疫细胞治疗的生产成本（20~30万元/例），预计几年内其终端价格有望降至50万元/例。与此同时，随着通用型免疫细胞疗法的不断成熟，未来采用通用型免疫细胞疗法的终端价格最终有可能降至10万/例，此时的渗透率和患者使用意愿也将大幅提升。综合考虑未来医保和商保对免疫细胞疗法的覆盖，当定价为50万元/例时，免疫细胞疗法的渗透率为20%；当定价为20万元/例时，其渗透率为40%；当定价为10万元/例时，其渗透率可达到70%。
2.4过继性细胞疗法产业模式和阻力
根据免疫细胞治疗的流程，CAR-T产业链可划分为上、中、下游产业3个环节，以及贯穿整个流程的生产规范及冷链物流配送体系。上游为关键设备、试剂、耗材、细胞库等；中游为免疫细胞治疗技术的研发及临床研究，下游为免疫细胞治疗的产业化及应用。
目前我国整个免疫细胞疗法的产业链并不完善，特别是上游的关键设备、试剂、耗材仍然依赖进口，价格的居高不下，导致细胞治疗产品的生产成本很难下降，终端价格高昂。国内产品虽然具有价格优势，但质量参差，难以满足临床应用和科研研发的生产要求。
近两年，中国在细胞免疫治疗领域研究快速发展。从研发总量来看，在细胞免疫治疗研究领域，中国研发总量仅次于美国，位居全球第二。而免疫细胞疗法的临床试验大部分用于治疗CD19 阳性的血液学肿瘤。除靶向CD19 外，越来越多的新型靶点的CAR结构开始应用于临床治疗，如CD22、CD20、ROR1、IgK、CD30、CD123、LeY、BCMA、CD138等等。根据https://clinicaltrials.gov/的数据，目前我国CAR-T 临床试验已达469项，但是CAR-NK的临床研究只有13项，TIL的临床研究只有12项。
免疫细胞治疗产业链的下游——细胞治疗，实施主体为三甲医院；开展下游产业的模式一般有两种：一种为三甲医院自行开展此业务，另一种为三甲医院和企业合作，企业提供技术服务和技术支持，医院提供临床平台进而实施治疗行为。
免疫细胞治疗产品的制备过程非常复杂，而其生产工艺的标准化进程却较为缓慢。生产过程标准化程度直接关系到产品有效性、稳定性和一致性，以CAR-NK为例，从最初的NK细胞分离和富集、NK细胞活化与扩增，到CAR的转导、CAR-NK的纯化、保存、运输以及最终复输，每个环节的微小差异都会影响最终产品的性质。自动化是提高免疫细胞治疗产品生产过程标准化的重要解决方案，然而目前工业界仍然没有开发出一个成熟的、自动化程度高的、封闭的免疫细胞产品制备平台，国内大部分免疫细胞治疗企业的产品生产过程仍处于全手动或者半自动化阶段，不仅时间和成本消耗高，且难以放大，失败率高，产品一致性低。
2.5 过继性细胞疗法的监管
目前我国针对细胞免疫治疗的管理体系逐步建立中，详细申报指南及管理规范尚未形成。2017年12月，CFDA出台《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则 （试行）》，指出按药品进行研发、注册申报的人体来源的细胞产品，可根据拟申请产品的 具体特性自行拟定临床研究分期和研究设计，一般按研究进度可分为早期临床试验阶段和确 证性临床试验阶段两部分。
2019年国家知识产权局发布《知识产权重点支持产业目录》将免疫治疗，细胞治疗划为国家重点发展，急需知识产权支持的重点产业之一。
2020年，NMPA发布《免疫细胞质量产品临床试验技术指导原则（征求意见稿）》为免疫细胞治疗产品临床试验的总体规划、试验方案设计、试验实施和数据分析等方面提供技术指导，并规范了对于免疫细胞治疗产品安全性和有效性的评价方法.
2020年CDE发布《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》对细胞免疫治疗产品探索性临床试验和确证性临床试验的若干技术问题提出了建议和推荐，并规范了对免疫细 治疗产品的安全性和有效性的评价方法。
2021年CDE发布《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）（征求意见稿）》针对用于基因修饰细胞治疗产品，为规范和指导基因修饰细胞治疗产品非临床研究和评价，在《细胞制品研究与评价技术指导原则》基础上，根据目前对基因修饰细胞治疗产品的科学认识制定了本指导原则，提出了对基因修饰细胞治疗产品非临床研究和评价的特殊考虑和要求。
可见我国的细胞治疗领域的监管与标准正在逐步形成与开放，将会是未来行业大发展的契机与征兆。
三、过继性细胞疗法及产品
3.1 过继性细胞疗法市场当前竞争格局
根据在Nature Reviews Drug Discovery发表的一篇题为《The clinical pipeline for cancer cell therapies》的文章统计，截至2021年4月16日，全球共有2073个针对肿瘤的细胞疗法研发管线，比2020年增加了572个，增长率为38%。在不同类型的免疫细胞疗法中，CAR-T继续占据主导地位，在研管线达到1164个，占比超过56%，但80%以上的CAR-T疗法仍处于临床前和临床 I 期阶段。此外， NK细胞疗法和TIL疗法在研管线数分别为181个和73个，相比2020年均显著增加。可见CAT-T赛道已经接近红海，而更有潜力的CAR-NK和TIL领域仅有小部分公司在临床阶段，仍然处于蓝海阶段。
图15 细胞治疗管线
图片来源：公开文献
3.2 过继性细胞治疗相关国外公司
3.2.1 NantKwest
NantKwest成立于2002年，总部位于美国加州，前身是Conkwest，2015年7月更名为NanKwest，是一家临床阶段的免疫治疗产品开发公司，致力于使用NK细胞治疗癌症、传染性疾病和炎症性疾病，拥有haNK、taNK和t-haNK三个技术平台。
2019年3月，NantKwest与ProMab Biotechnologies签署协议，开发针对多发性骨髓瘤的CAR-NK疗法。2019年6月26日，继CD19 t-haNK获FDA批准进入临床试验后，该公司PD-L1 t-haNK新药临床试验申请(IND)已获得FDA批准，这是该项目在局部晚期或转移性实体瘤中的首次人体临床试验。PD-L1 t-haNK是首次设计的、GMP级的、冷冻保存的、现成的双特异性NK细胞疗法。
2020年12月21日，NantKwest与ImmunityBio宣布达成全股票合并协议，旨在结合NantKwest的NK细胞平台与ImmunityBio的免疫疗法融合蛋白、免疫调节剂和腺病毒平台，开发针对癌症和传染性疾病的新一代免疫疗法。
表3 NantKwest管线
NantKwest于2015年6月19日递交IPO招股说明书,于2015年7月27日上市交易,募集资金1.725亿美元,在纳斯达克交易,股票代码:NK。
3.2.2 Nkarta Therapeutics
Nkarta Therapeutics成立于2015年，是一家临床阶段的生物技术公司，致力于研发“通用型” CAR-NK细胞疗法。2020年7月，Nkarta登陆纳斯达克，目前市值超10亿美元。2020年11月12日，Nkarta宣布其主要候选产品NKX101用于治疗复发/难治性急性髓系白血病（r/r AML）或高风险骨髓增生异常综合症（MDS）的首次人体试验已完成首例患者给药。
NKX101是一种靶向NKG2D的CAR-NK疗法。除了NKX101，该公司还有一条 CAR-NK 细胞疗法研管线NKX019，NKX019 是一款靶向 CD19 的CAR-NK 细胞疗法，用于治疗B细胞淋巴瘤。与NKX101 相似，NKX019也可与IL15结合。
表4 Nkarta Therapeutics管线
表5 Nkarta Therapeutics融资历程
3.2.3 Kiadis Pharma
Kiadis Pharma成立于1997年，总部位于荷兰阿姆斯特丹，是一家综合型生物制药公司，该公司于2015年7月2日在阿姆斯特丹泛欧交易所和布鲁塞尔泛欧交易所上市。2019年4月，Kiadis收购CytoSen Therapeutics公司，获得了“智能”NK细胞平台。2020年11月2日，赛诺菲宣布以3.58亿美元收购Kiadis，此次收购使赛诺菲获得了Kiadis的“现货型”NK细胞平台，开发用于治疗造血干细胞移植和实体瘤以及传染病的基于NK细胞的药物。
表6 Kiadis Pharma管线
3.2.4 Fate Therapeutics
Fate Therapeutics成立于2007年，总部位于美国加州San Diego，是一家临床阶段的生物技术公司，致力于开发癌症和免疫失调治疗的程序性细胞免疫疗法，该公司最革命性技术是用iPSC分化成NK细胞和T细胞，并对其进行基因改造，做成通用型的CAR-T和CAR-NK。该公司目前在研NK细胞疗法相关产品8个，开展Ⅰ期临床7项，FT500是有史以来第一个iPSC衍生的细胞疗法在美国获准进行临床研究。FT538是其首个基于CRISPR编辑技术的iPSC来源的CAR-NK细胞疗法，也是公司第四款iPSC来源的NK细胞候选产品。2020年5月，FDA已批准FT538的研究新药（IND）申请。
表7 Fate Therapeutics管线
3.2.5 Iovance Biotherapeutics
lovance Biotherapeutics,Inc.是首批专注于开发TIL作为疗法的生物技术公司之一,成立于2007年,并于2010年首次公开募股。lovance率先向行业、监管机构和肿瘤学家展示了TIL治疗实体瘤的潜力。
lovance Biotherapeutics的lifileucel (LN-144)和LN-145进展最快,分别用于不能切除或转移的黑色素瘤,复发或转移的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、复发或转移的非小细胞肺癌(NSCLC)以及宫颈癌的1I期临床研究。其中LN-145被FDA授予突破性疗法,用于治疗复发性、转移性或持续性宫颈癌以及化疗前后的疾病进展。
表8 Iovance Biotherapeutics管线
3.2.6 Instil Bio
Instil Bio是一家临床阶段生物医药公司，于2018年8月成立，在2019年初从Immetacyte Ltd.授权引进公司的核心技术，自体肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），2020年3月收购Immetacyte，该公司在2011-2019年为英国Christie医院生产供同情使用的TIL产品。
Instil Bio专注于开发TIL疗法治疗癌症，并为此已组建了一支在细胞疗法开发、制造、法规批准和商业化方面，拥有成功经验的团队。此外，公司还在研发共刺激抗原受体（Co-Stimulatory Antigen Receptor,CoStAR）工程化的TIL，修饰过的TIL仍然依靠天然的、特异性T细胞受体和肿瘤新抗原结合，但增加了CoStAR分子以结合肿瘤相关抗原，增强肿瘤微环境中TIL细胞的刺激
表9 Instil Bio管线
表10 Instil Bio融资历程
3.3 过继性细胞治疗相关国内公司
3.3.1 恒润达生
恒润达生成立于2015年7月，位于上海张江，是一家基于CAR-T细胞肿瘤免疫治疗的生物高科技公司，该公司于2019年9月宣布完成2亿元人民币B+轮融资，将用于支持恒润达生三个CAR-T批件的注册临床试验顺利开展，助力国内自主研发CAR-T产品的产业化，以及针对实体瘤的新靶点CAR-T、TCR-T、CAR-NK和溶瘤病毒等创新管线产品的研发。目前尚未公开披露CAR-NK细胞药物。
表11 恒润达生融资历程
3.3.2 阿思科力
阿思科力由李华顺博士于2013年在苏州创立，是一家致力于研发CAR－NK疗法的生物科技公司。是一家致力于蛋白和细胞药物研发的高科技创新型企业。具备高效扩增肿瘤靶向杀伤的NK细胞技术平台，建成了高表达广谱抗肿瘤转移候选药物融合蛋白和体外筛选平台，储备了动物肿瘤异体移植药物筛选技术。公司目前在研产品包括一类抗肿瘤新药、抗免疫炎症新药和免疫细胞治疗产品，同时正在筹建GMP洁净室和药物研发生产基地。据公开资料显示，早在 1999 年，李华顺博士便发现了CAR－NK细胞药物的靶点ROBO1，并在全球第一个阐明了ROBO1在迁移细胞中的导向分子机制，其 ROBO1 CAR-NK 细胞疗法安全有效，没有发现一例重大不良事件，疾病控制率达到 76.5%。目前该公司尚无公开的融资记录。
3.3.3 博生吉
博生吉医药科技（苏州）有限公司于2010年5月31日注册成立在苏州工业园区。公司专注于开发具有国际领先水平的突破性First-in-class和Best-in-class CAR-T细胞药物，已有多个细胞产品进入POC临床验证阶段，涵盖大部分血液肿瘤和部分实体肿瘤。2020年度公司完成了iPSC诱导的UCAR-NK/T细胞制备平台研制。
安科生物长期致力于细胞工程产品、基因工程产品、精准医疗等医药和医疗技术、产品的研发，安科生物在CAR-NK领域的布局主要是通过投资苏州博生吉（2015年开始安科生物收购博生吉公司15%股份，2016年再次拿下5%股权，目前合计持有博生吉20%股权。且安科与博生吉开设合资企业，博生吉安科，其中安科持股49%，博生吉持股51%。）
该公司在ClinicalTrails.gov上注册的临床项目主要有四项，分别靶向CD7、MUC1、CD33、CD19的CAR-NK细胞药物 。
表12 博士吉融资历程
3.3.4 上海科济
科济生物成立于2014年，总部位于上海，在中国和美国设有实体运营中心。目前公司已建立了广泛的CAR-T候选产品研发管线，开发了能够覆盖大部分实体瘤及血液肿瘤的高效特异性CAR-T及抗体药物候选产品，以满足日益增长的医疗需求。公司已启动了多项治疗复发/难治性实体瘤的CAR-T临床研究项目，包括针对肝细胞癌（HCC）和肺鳞癌的CAR-GPC3-T项目，CAR-EGFR / EGFRvIII-T试验用于胶质母细胞瘤，CAR-Claudin18.2-T用于胃癌和胰腺癌等的临床研究。
2018年初，科济生物联合上海市肿瘤研究所、上海交通大学附属仁济医院发表了靶向GPC3的CAR-NK治疗肝癌的研究论文，并利用自主知识产权抗体制备的CAR-NK细胞株（NK-92/9.28.Z）在体内外均能特异性的靶向并杀伤表达为GPC3的肝细胞肝癌，与目前的CAR-T治疗相比，节约了大量的成本。
表13 科济生物融资历程
3.3.5 英百瑞
英百瑞成立于2014年，英百睿生物主要从事CAR-NK免疫细胞产品开发, 以及双特异抗体和AIC药物的研发。英百瑞已经建立起包括CAR-NK细胞疗法在内的13条产品管线，其中4个正在准备新药临床试验申请。试验药物IBR854细胞注射液是由英百瑞自主研发的一款偶联抗体导向的即用型同种异体自然杀伤细胞（Conjugated Antibody Redirecting ready-to-use allogeneic NK cells, CAR-raNK@）产品。该产品的核心构造是将靶向肿瘤抗原5T4的特异性抗体通过连接子（linker）与同种异体的NK细胞进行化学/共价偶联。
表14 英百瑞融资历程
3.3.6 国健呈诺生物
国健呈诺生物成立于2019年，位于北京，是由呈诺医学与国亦生命科技共同成立的合资公司，专注于包括实体肿瘤在内的多种肿瘤细胞疗法的开发，以CAR-NK技术为基础，为患者提供规模化现货型抗肿瘤药物。
2021年2月7日，国健呈诺生物的1类新药“靶向间皮素嵌合抗原受体NK细胞注射液”临床试验申请获得受理，这是中国首个申报临床的用于实体瘤治疗的“现货型”异体来源的CAR-NK疗法，这是免疫细胞治疗实体瘤的重要里程碑。
根据国健呈诺的母公司呈诺医学官网显示，该公司在ClinicalTrails.gov上注册的临床项目还有其他五项，分别是PMSA、CD19、CD22、CD19/22嵌合抗原受体NK细胞药物。
3.3.7 星奕昂
星奕昂（上海）生物科技有限公司专注于免疫细胞药物的研发和产业化, 走自主创新研发和全球领先项目的合作引进相结合的道路，开发异体通用型现货免疫细胞产品，为全球肿瘤患者提供治愈的希望。开发iPSC-CAR-NK通用型现货免疫细胞产品，致力于为全球肿瘤患者提供有效的治疗药物。
2022年2月9日，博雅辑因与星奕昂生物共同宣布，双方将基于博雅辑因在高通量基因组编辑筛选方面以及星奕昂生物在诱导性多能干细胞（iPSC）和自然杀伤细胞（NK Cell）细胞功能和生产工艺方面的技术和资源优势，研发合作新一代免疫细胞疗法。
表15 星奕昂融资历程
3.3.8 卡替医疗
北京卡替医疗是中国TIL/新抗原等创新免疫细胞治疗的代表性企业,参与承担了多项国家级和省部级科研课题。公司研发的“超强型TIL疗法技术致力于攻克实体肿瘤,在理论上突破了传统CAR-T/TCR-T/TIL疗法的诸多局限,在安全性、疗效、适用人群、制备周期和成本等诸多方面拥有优势。由上海东方医院李进教授等多位知名PI主持的公司产品“超强型TIL”治疗晚期实体瘤的临床试验正在进行中。
卡替医疗自主研发的“超强型TIL”免疫细胞治疗技术是目前处于国际最前沿的TIL和CAR-T等技术基础上的“青出于蓝”的重大升级–其产品借助”增强受体”和“扩增因子等专利技术,对TIL细胞进行基因改造,全面解决了上述关于实体瘤的异质性、微环境,以及细胞扩增工艺、制备周期和成本的诸多难题。
除此之外,卡替医疗研发的第四代产品–“超强型cTIL”,仅需采集外周血中的TIL细胞,突破了传统TIL疗法依赖于手术组织取材的局限。这一突破使得TIL疗法几乎变得人人可及,极大地拓展了适用人群。
表16 卡替医疗融资历程
3.3.9 劲风生物
劲风生物于2020年初由企业家兼科学家于福利博士发起创立,旨在通过将多组学/生物信息学人工智能与细胞疗法进行无缝整合,发展TIL疗法在临床上的应用,治疗治愈实体肿瘤患者,提升患者生命质量。劲风生物一直在打磨开发其尖端的TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)治疗平台,目前其“武器库”包括新抗原驱动TIL、单细胞多组学TIL扫描,以及端到端CMC。该司始终坚持自主研发与外部合作双轮驱动,已经与中美众多顶尖的研究机构团队建立了紧密合作。
成立之初,劲风生物就得到了该行业领域的专家认可美国科学院院士、贝勒医学院遗传系系主任Brendan Lee教授是劲风生物的天使投资人兼科学顾问。该司其他知名科学顾问还包括贝勒医学院细胞治疗系(CGT)主任Helen Heslop教授、医学专家陆舜教授。
劲风生物创始人&CEO于福利博士于贝勒医学院(师从美国科学院院士、著名基因组学泰斗Richard Gibbs教授)获得分子遗传学博士学位后,于博士又去往哈佛大学,在哈佛医学院(师从著名群体遗传学家、古人类遗传学家David Reich教授)完成了博士后的研究工作。在美国贝勒医学院遗传系人类基因组测序中心就职,参与以及领导多项国际重大人类基因组项目,其中包括人类基因组单体型项目、人类干人基因组项目、人类心血管疾病项目等,其所在实验室获得过NIH数千万美元科研资助。截至目前,于博士已发表国际文章70余篇,被引用45000次,其主导的多款研发软件也被广泛应用。在创建劲风生物前,于福利博士还曾担任贝瑞基因公司的首席信息官,主要负责整体生物信息分析、产品研发和云计算技术人工智能技术在基因组学的应用。任职期间,于博士成功孵化了贝瑞基因重点项目转化子公司:以肿瘤检测为主的“和瑞基因子公司”,以大数据为主的”福建贝瑞基因大数据产业园”,以消费基因检测为主的”圆基因子公司等。
表17 劲风生物融资历程
3.3.10 君赛生物
君赛生物于2019年7月成立于上海,是一家新型实体瘤细胞疗法创新企业,致力于开发基于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的实体瘤创新疗法与”first-in-class/best-in-class”细胞疗法,覆盖多种复发难治性肿瘤。现已建立TIL细胞富集培养和高效安全的非病毒载体T细胞基因修饰等核心技术,目前产品已进入非注册临床研究阶段。
创始人/CEO/CTO金华君,上海市生物医药委会执行主任。金华君博士具有丰富的高校、医院、企业的跨界从业经历,深耕肿瘤免疫机制研究和细胞疗法开发十多年,积累了大量第一手研发与临床研究经验,熟练掌握细胞新药早期设计、工艺与检测技术开发、临床前研究、临床研究、新药注册申报等全流程。曾开发全球首个自表达抗体的CAR-T细胞治疗实体瘤的临床级技术,以及国内首个基于非病毒载体的CAR-T细胞新药品种,自主建立高效简便的TIL细胞富集培养技术以及转基因TIL细胞治疗方案。主持“重大新药创制”国家科技重大专项项目2项,国家自然科学基金2项,其它省部级课题6项,申请发明专利80项(已授权10项) ;发表SCl论文30篇(以第一作者或通讯作者发表20篇) ;曾开展30项细胞免疫治疗项目的临床研究。
表18 科济生物融资历程
3.3.11 沙砾生物
沙砾生物成立于2019年,专注于针对实体瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)创新产品的研发及临床应用,TIL疗法是当前实体瘤免疫治疗领域最前沿、最具竞争力和产业化潜力的技术方向。公司创始团队来自于高度专业且经验丰富的海归博士,目前已与国内多家顶级医院组成战略合作伙伴。
沙砾生物的核心优势有两点:第一,公司核心团队的科学背景是高度互补的,并且都深耕于肿瘤免疫领域多年,其中70%都具有海外的细胞治疗工业化经验,这是非常稀缺的人才资源;第二,在临床运营方面,在短短一年中,拓展了十多家三甲医院,展开深入的合作,取得了大量的临床样本以支持工艺开发。
沙砾生物自主研发的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）产品GT-101注射液的临床试验申请已获得正式受理。GT-101注射液是国内首个被CDE受理的肿瘤浸润淋巴细胞药物。
表19沙砾生物融资历程
3.3.12 原启生物
原启生物(原名原能医学)成立于2015年,立足开拓创新,为全球未被满足的临床需求开发效价可及的药物,致力成为全球领先的肿瘤免疫治疗新药的创制者。公司于2019年底获得启明创投近亿元的Pre-A轮独家投资,2020年末完成超过2亿元人民市的A轮融资。
公司构建了4大基于肿瘤免疫治疗药物研发的专利技术平台: Ori@Ab抗体发现技术平台、Ori@CAR高记忆性高活力CAR-T技术平台、Ori@TIL细胞高效扩增稳定可控培养平台、Ori@UCAR通用型便捷性高效性CAR-T技术平台。从靶点筛选、肿瘤免疫微环境、T细胞浸润与杀伤能力等方面着手突破了CAR-T等治疗实体肿瘤的疗效瓶颈,致力于开发疗效好、差异化、成本可及的创新型肿瘤免疫细胞治疗药物,在推动“创新药、中国造”的发展浪潮中不断开立新局。
原启生物Ori@TIL一细胞高效扩增培养技术平台拥有三大技术手段有效解决TILs细胞体外扩增难度大,无特异性肿瘤残留检测方法以及制备成本高昂等瓶颈问题:1.年轻态TIL细胞增强肿瘤杀伤活性和纯度,增强组织驻留记忆性T细胞(TRM)同时缩短细胞培养周期,保障了临床应用的有效性;2.了通用新型的检测方法,低于普通检测下限,T细胞成分明确,质量可控,确保回输制剂的安全性;3.封闭体系生产,从培养基、因子等试剂耗材以及设备、人员、场地等方面降低了平均制备成本,提高了临床治疗成本的可负担性。
目前已经形成了10项自主创新主要靶向实体瘤的细胞药物和双特异性抗体管线,6项肿瘤免疫细胞治疗产品已经进入临床开发阶段。
表20原启生物管线
表21 原启生物融资历程
四、小结
中国庞大的潜在患者基数对细胞治疗需求持续增加，同时大量生物技术公司的涌现、资本市场投融资热潮等因素推动下，未来中国细胞治疗市场会呈现持续扩张，多样化，成本降低的趋势。在过继性细胞治疗领域最核心的竞争力主要体现在，细胞产能以及产品疗效。细胞产能包括能否以高通量的模式生产治疗用细胞，细胞的质量控制，产品疗效包括治疗方案的靶向性，浸润性，免疫原性，耐药性等衡量指标。要实现这两方面能力的突破需要扎实长久的基础科学研究推动。目前的主要难点在于，NK细胞的培养与转染，诱导激活的方式，对TIL来说短期大量制备的能力，以及毒副作用。
总的来说，肿瘤治疗市场巨大，细胞免疫疗法有望在未来成为主流肿瘤治疗方式，但目前除CAR-T外的过继性免疫细胞治疗仍为一片蓝海，尚没有绝对领先的技术或公司问世。
声明
本报告中部分信息及数据来源于公开可获得资料，对于信息的准确性和完整性不做保证，未经许可，任何机构和个人不得以任何形式翻版、复制及刊登，如需转载请联系授权并需在醒目位置标注转载来源
专注医疗健康与生命科技的精品投行
联系我们
北京办公室
北京市朝阳区建国门外大街8号IFC A座1601
Beijing office
Room 1601, Building A, IFC Tower, 8 Janguomenwai St, Chaoyang, Beijing
上海办公室
上海市黄浦区汉口路400号华盛大厦21C
Shanghai office
21C Huasheng Tower, 400 Hankou Road, Huangpu，Shanghai
项目投递 Project submission
yeri.wei@probevc.com
媒体问询 Media inquiries
sunhuijuan@tri-fecta.cn
资本市场 Equity capital market
freya@probevc.com
加入我们 Join us
hr@probevc.com
