DOI：10.3760/cma.j.cn112144-20250418-00143
贾思璇尤玥石冰贾仲林 
四川大学华西口腔医院唇腭裂外科 口腔疾病防治全国重点实验室 国家口腔医学中心 国家口腔疾病临床医学研究中心，成都 610041
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摘 要
目的初步探讨甲基化在非综合征型口面裂（NSOC）发病机制中的表观遗传调控作用。
方法利用来自一大规模中国汉族非综合征型唇腭裂（NSCLP）患者与健康对照的全基因组关联研究数据，进行单核苷酸多态性（SNP）位点及与甲基化相关的基因的关联分析。
结果NSOC与DNA甲基化基因TET1和组蛋白甲基化基因NSD1之间存在显著关联。具体而言，rs3733875的次要等位基因G显著增加了NSCLP的风险（P=1.18×10-14， OR=1.292），rs10998379的次要等位基因C则提升了非综合征型腭裂的风险（P=7.29×10-5， OR=1.268），而rs4558056的次要等位基因T则是NSCL/P的保护因素（P=1.17×10-4， OR=0.792）。
结论本研究发现DNA甲基化基因TET1与组蛋白甲基化基因NSD1与NSOC相关。NSOC的发病涉及遗传、环境及表观遗传等多层次因素的相互影响，而甲基化修饰更是其中不可忽视的重要环节。
关键词甲基化；非综合征型口面裂；关联研究；Tet甲基胞嘧啶二氧化酶1；核受体结合SET结构域蛋白1
本文来源：中华口腔医学杂志2025年第60卷第9期
口面裂在先天性颅面畸形中的高发病率引起了广泛的学术关注，其中非综合征型口面裂（non‑syndromic orofacial clefts， NSOC）表现出更大的多样性和复杂性。不同于伴发身体其他部位异常的综合征型口面裂（syndromic orofacial clefts， SOC），NSOC的发病机制涉及遗传背景与环境暴露之间的相互作用，尽管具体的致病途径和分子机制尚待充分阐明［1‑2］。近期基因组学、转录组学和表观遗传学的进展越来越强调表观遗传修饰，如甲基化在NSOC发生中的关键作用，超出了传统对基因突变和染色体异常的关注［3‑5］。
正常的唇和腭发育是一个高度协调的过程，涉及面部各突起的增殖、迁移和融合，这些过程受多种细胞行为和信号通路的调节［6‑8］。遗传或环境因素在关键发育窗口期间的干扰可能打破这种平衡，导致面部突起闭合失败和裂隙形成。
在真核生物中，甲基化可发生在DNA、RNA或组蛋白水平。在先天性畸形的研究中，DNA甲基化是最早发现且最具代表性的表观遗传标记，与转录因子和染色质重塑因子共同调节基因表达。研究发现，NSOC患者与健康对照组之间在特定基因的启动子或增强子区域存在甲基化差异［9‑11］。此外，改变的甲基化水平可能影响关键发育通路的转录活性，从而影响上颌和腭突的发育［12］。
为了验证甲基化在NSOC中的作用，本研究通过文献回顾筛选了与甲基化相关的基因。利用之前的全基因组关联研究（genome‑wide association study， GWAS）数据［13‑14］，本研究提取了候选基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）基因型，通过次要等位基因频率（minor allele frequency， MAF）、哈迪温伯格平衡（Hardy‑Weinberg equilibrium， HWE）检验进行质量控制，并在NSOC亚型中进行了等位基因和基因型关联分析。在一个大型中国NSOC队列中，分析了373个SNP，最终识别出了两个与甲基化相关的基因：Tet甲基胞嘧啶二氧化酶1（tet methylcytosine dioxygenase 1， TET1）和核受体结合SET结构域蛋白1（nuclear receptor binding SET domain protein 1， NSD1）。
本研究的所有参与者在收集外周血之前，由患者本人或其监护人填写知情同意书。本研究经过四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准（WCHSIRB‑D‑2022‑237‑R1）。
1.研究对象：本研究纳入的所有患者来源于四川大学华西口腔医院唇腭裂外科的住院患者，采集其5 ml周静脉血以进行DNA提取。对照组由健康的新生儿组成，采集其5 ml脐带血以进行DNA提取。纳入标准如下：①所有受试者均来自中国西部的汉族人（主要包括四川、重庆、云南、贵州和西藏）。②至少2名四川大学华西口腔医院唇腭裂外科主治医师，根据诊断标准诊断患者为先天性NSOC，诊断一致性高。③患者无其他身体部位的先天性疾病或畸形，例如先天性心脏病、并指等，且无家族先天性疾病史。④对照人群为无先天性疾病史或家族史的中国西部汉族人群。
本研究的样本信息来源于本课题组参与的2个GWAS［13‑14］，其中涉及1 729例NSCL/P患者、995例非综合征型腭裂患者以及1 263名健康对照。在NSCL/P患者中，可进一步细分为NSCLP和非综合征型唇裂，分别包括539例和1 190例患者（表1）。
2.甲基化相关基因的筛选：通过查询PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）和Web of Science（https：//webofscience.clarivate.cn/wos/alldb/basic-search），利用关键词“methylation”搜索与甲基化相关的基因。
（1）外周血或脐带血提取全基因组DNA：采用盐析法从外周血或脐带血中提取基因组DNA样本，琼脂糖凝胶电泳明确DNA提取成功，并进行样品浓度及纯度测定。
（2） SNP位点基因型的获取：基于筛选到的甲基化相关基因，从课题组前期参与的GWAS研究中［13‑14］，提取SNP位点及基因型数据。排除位于X、Y染色体以及线粒体上的SNP。
（3） SNP位点质控：获得的SNP在PLINK软件（http：//zzz.bwh.harvard.edu/plink）中进行了质量控制。主要质控标准为MAF及HWE检验。MAF是指中国西部汉族人群中第二常见基因型出现的频率。MAF>0.05的位点纳入后续研究，以增加统计效能，减少假阴性。HWE检验的检测指标为待测样本中同一SNP位点等位基因不相同的概率，P>0.05，提示该位点在样本人群中具备代表性，可进行后续研究。
（4） 等位基因和基因型关联分析：合格的SNP随后进行了等位基因和基因型关联分析，并以患者性别作为协变量进行人群分层校正。P阈值设定为1.34×10-4（0.05÷373个SNP），遵循Bonferroni校正。
（5）SNP功能预测：通过3DSNP（https：//www.omic.tech/3dsnpv2/）及GTEX（https：//www.gtexportal.org/）数据库对候选SNP进行功能预测。
1. 甲基化相关基因筛选：在排除已分析的基因和位于性染色体上的基因后，共选择了65个相关基因（表2）。在排除基因分型失败的SNP后，共有373个SNP符合条件，其MAF>0.05，HWE检验的P>0.05。
2. 等位基因关联分析：373个合格SNP进行等位基因关联分析显示，2个基因中的3个SNP显示差异有统计学意义，P阈值设定为1.34×104（0.05/373个SNP），遵循Bonferroni校正（图1）。
注：NSCLO为非综合征型唇裂；NSCL/P为非综合征型唇裂伴或不伴腭裂；NSCLP为非综合征型唇腭裂；NSCPO为非综合征型腭裂；TET1为Tet甲基胞嘧啶二氧化酶1；NSD1为核受体结合SET结构域蛋白1
rs3733875与NSCL/P和NSCLP均有显著关联（P=9.92×106， OR=1.23； P=1.18×104， OR=1.292），表明次要等位基因G与NSCL/P的关联是由其与NSCLP的连锁驱动的。rs10998379的次要等位基因C仅与NSCPO相关（P=7.29×105， OR=1.268），而其与其他亚型的关联则没有统计学意义。此外，rs4558056位点的次要等位基因T与NSCL/P有关（P=1.17×104， OR=0.792）。
3.rs3733875、rs10998379与rs4558056的功能预测：rs3733875位于NSD1基因的外显子区域，在THP1_PMA细胞系中，与FGFR4基因通过3D染色质环相互作用。同时，表达数量性状位点（expression quantitative trait locus， eQTL）分析显示，在细胞培养的成纤维细胞中，rs3733875的不同基因型对FGFR4的表达水平有显著影响，GG型的标准化表达水平明显高于GT型和TT型（图2）。此外，该位置的突变可导致缬氨酸替换为亮氨酸，进而可能影响蛋白质的折叠方式和稳定性。
rs10998379位于TET1基因的内含子区域，在皮肤组织来源的表皮角质形成细胞（epidermal keratinocytes， NHEK）中，与CCAR1基因通过3D染色质环相互作用。此外，eQTL分析发现，在细胞培养的成纤维细胞中，rs10998379的不同基因型对KIFBP的表达水平有显著影响，TT型的标准化表达水平明显高于TC型和CC型，表明基因型TT对KIFBP的表达影响最大（图2）。
rs4558056同样位于TET1基因的内含子区域，在皮肤组织来源的表皮角质形成细胞（Epidermal Keratinocytes， NHEK）中，与CCAR1、TET1基因通过3D染色质环相互作用。此外，eQTL分析发现，在细胞培养的成纤维细胞中，rs4558056的不同基因型对SLC25A16的表达水平有显著影响，CC型的标准化表达水平明显高于CT型和TT型，表明基因型CC对SLC25A16的表达影响最大（图2）。
▲ 图2 rs3733875、rs10998379、rs4558056的表达数量性状位点分析结果 A：rs3733875；B：rs10998379；C：rs4558056
N6‑甲基腺苷（N6‑methyladenosine， m6A）是真核生物中最常见的mRNA甲基化形式，在生物过程和疾病中发挥着重要作用。这种修饰涉及3种蛋白质类型：写入蛋白（如METTL3和METTL14等甲基转移酶）、去除蛋白（如FTO和ALKBH5等去甲基酶）和阅读蛋白（如YTHDF1、YTHDF2和YTHDC1等特异性识别蛋白）。这些蛋白质调节RNA的稳定性、翻译效率和定位［15］。当前m6A的研究主要集中在癌症、血管疾病和纤维化疾病上［16⁃17］，同时新兴研究开始探索其在颅面发育中的作用。动物实验表明，写入蛋白通过WNT信号通路调节骨骼发育：在斑马鱼中敲低mettl3可导致下颌、筛骨板和牙齿畸形［18］，而mettl5剂量不足则导致斑马鱼小头畸形和小鼠颅缝早闭［19⁃20］。全反式视黄酸（all‑trans retinoic acid， atRA）诱导的腭裂小鼠模型中，升高的m6A水平与腭板中间充质细胞增殖减少相关，mettl14的敲低减轻了atRA的致畸效应［21］。
组蛋白在特定残基（如H3/H4上的赖氨酸和精氨酸）上的甲基化对基因表达产生多样的影响。例如，H3K4me3与转录激活相关，而H3K9me3和H3K27me3则与基因沉默相关。研究发现，对组蛋白修饰至关重要的多梳抑制复合体2的突变或失调，可导致Weaver综合征［22‑24］，表现为面部、四肢畸形，神经发育缺陷和生长迟缓［25］。
改变的甲基化状态可影响染色质构象和转录活性，从而塑造细胞分化和器官形态发生［18， 26］。在NSOC中，甲基化异常可能代表多条致病通路的汇聚点，整合遗传和环境信号以增加对外部因素的易感性［27］。此外，不同表观遗传机制之间的交互作用可形成复杂的调节网络［28‑29］。破解这些网络有可能阐明NSOC的分子基础，发现新的诊断和治疗策略。
TET1编码的蛋白质是一种去甲基化酶，属于TET家族。TET家族成员通过转录因子和RNA聚合酶Ⅱ被招募，修改增强子和基因体中的5‑甲基胞嘧啶，从而调控基因表达［30］。研究表明，TET1与QSER1协同以抑制DNMT3A/3B的结合，进而抑制从头甲基化［31］。TET1还可以广泛调控染色质，通过招募组蛋白修饰蛋白复合物改变组蛋白标记和染色质可及性，从而激活或抑制基因表达［31］。
研究表明，TET介导的去甲基化与胚胎发育密切相关［32‑33］。功能丧失相关研究发现，TET抑制剂干扰早期滋养层细胞分化，并降低了滋养层球体的着床潜力［34］。同时敲除TET1、TET2和TET3减少KHDC3表达，导致小鼠胚胎干细胞中的染色体错误分离和非整倍体，并在胚胎8细胞阶段显示出异常的细胞质和细胞核形态［35］。而中胚层间充质干细胞的TET基因缺陷则可影响靶基因RUNX2的转录活性，进而导致严重的骨发育缺陷［36］。任何单个TET基因等位基因的存在均可支持早期骨形成，提示TET蛋白的功能冗余［36］。此外，全基因组甲基化分析显示TET基因敲除导致编码WNT抑制剂的基因的启动子超甲基化，导致WNT信号过度激活和心脏中胚层形成缺陷［37］。同时，体外实验证明，TET1过表达也可造成成纤维细胞增殖与凋亡的减少［38］。而NSOC作为最常见颅面发育畸形，其与TET1的相关性未见报道。
NSD1是一种甲基转移酶，使组蛋白H3的Lys‑36（H3K36me2）二甲基化。转录中间因子可对转录产生负向或正向影响，具体取决于细胞环境。NSD1主要结合于骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4， BMP4）和锌指蛋白36C3H类型1（zinc finger protein 36 C3H type‑like 1， ZFP36L1/TPP）的上游［39］。其通过募集RNAP Ⅱ到 BMP4，调节基因表达，影响H3K36Me和C‑末端结构域磷酸化水平［39］。目前，BMP4已确定为NSOC的易感基因（OMIM#600625），研究证明在小鼠中，条件性失活bmp4，导致胚胎出现孤立性唇裂，且该基因变异同样存在于微小型唇裂患者当中［40］。
通过对关联分析有统计学意义的3个SNP进行注释，本研究发现rs3733875可能通过3D染色质环与FGFR4基因相互作用，eQTL结果证明该SNP的不同基因型对FGFR4的表达水平有显著影响。值得注意的是，FGFR4基因编码的蛋白质是成纤维细胞生长因子的酪氨酸激酶受体，已有研究证明FGFR4通过结合成纤维生长因子激活下游信号通路［41］，如MAPK和PI3K/Akt通路，在细胞增殖、迁移和存活中发挥重要作用。在胚胎发育期间，成纤维生长因子受体4还参与多个器官与组织的形成，包括骨骼、软骨和神经系统［42］。此外，已有大量研究证明成纤维生成因子信号紊乱是唇腭裂的致病机制之一［43‑47］。
尽管目前对DNA甲基化在NSOC中的作用已有一定认识，但尚存在诸多尚未解决的问题。例如，多数研究以人群水平或动物模型单一时间点采样为主，难以动态捕捉胚胎发育过程中的甲基化时空变化；另外，甲基化修饰与基因突变、转录组变化之间的交互如何影响最终的唇腭发育缺陷，尚需更大规模、多组学整合分析才能得出相对系统的结论。近年来，单细胞RNA测序、多组学测序及空间转录组学等新技术，为解析唇腭裂复杂的表观调控网络提供了更精细的工具；同时，表观遗传学定向编辑技术（如CRISPR/dCas9甲基化编辑工具）也有望成为深入理解甲基化功能乃至潜在治疗干预的新方向。
综上所述，本研究发现DNA甲基化基因TET1与组蛋白甲基化基因NSD1与NSOC相关。NSOC的发病涉及遗传、环境及表观遗传等多层次因素的相互影响，而甲基化修饰更是其中不可忽视的重要环节。深入研究甲基化在唇腭裂形成中的具体分子机制，不仅有助于阐明NSOC的真实性质，也为未来个体化诊断、早期干预及潜在表观遗传疗法提供新思路和契机。
贾思璇：研究设计及实施、数据采集及分析、统计分析、论文撰写及修改；尤玥：研究设计及实施、数据采集、对文章的知识性内容作批评性审阅；石冰：研究设计、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政及技术支持、指导研究；贾仲林：研究设计、统计分析、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政及技术支持、指导研究
