1、1. iQ5多重实时荧光定量PCR 仪简介在现代分子生物学的发展过程中，核酸放大技术的出现及与之相关的检测技术的成熟起到了至关重要的作用，而实时荧光定量PCR 技术可以说是两者完美的结晶。它通过加入能与DNA 结合的荧光染料或在引物/探针上标记荧光基团等方法，在PCR 过程中，随着产物的量不断增加，荧光信号也随之发生相关性的变化，再通过数学处理，算出原始靶DNA 的含量。实时荧光定量PCR 技术可以在较大的动力学范围内实现精确定量，其灵敏度也达到相当高的程度。随着这项技术的发展，其专用的实时荧光定量PCR 仪也应运而生。我们伯乐公司这次推出的iQ5 多重实时荧光定量PCR 仪是在iCycler
2、 荧光定量PCR 仪的基础上强化而成，以求性能达到最优。iQ5 多重实时荧光定量PCR 仪所装配的光源（钨卤素灯）拥有更宽的光谱范围，给予用户在其选择上最大限度的灵活性。经过优化的激发/发射透镜组可以显著提高多重PCR 的灵敏度，减少多重荧光之间的干扰。它的CCD 检测器可以同时监测96个反应孔的荧光数据。在热循环过程中，当前完整的实验数据会被软件实时地以图解的形式表现出来。实时的数据显示可以大大提高反应孔与孔之间数据比较的可靠性，iQ5 多重实时荧光定量PCR 仪则可以方便地实现数据实时显示，有利于及时反馈试验状况。以上介绍的各项特性保证了iQ5 多重实时荧光定量PCR 仪在使用过程中具有更
3、强的可靠性和灵活性。iQ5 多重实时荧光定量PCR 仪所配备的运行、分析软件设计得十分人性化，且功能强大。其功能模块的界面模式可使用户可以快速地完成各种操作。当用户把光标放在软件的功能键上时，其下方还会出现相应说明文字。此外，按键盘的F1键还可以启动在线帮助指南。当用户设定完结果分析参数后，点一键即可得到最终分析结果。2. iQ5使用快速指南2.1 如何用iQ5运行一次实验2.1.1 综述1. 创建、选择或修改一个反应程序文件（Protocol file ） 2. 创建、选择或修改一个反应板设置文件（Plate Setup file ）。 3. 点击Run键。 4. 以选定的反应板设置文件和反
4、应程序文件进行反应。 2.1.2反应程序文件（Protocol file ）设置指南用户可以在Workshop 模块中，创建一个新的反应程序文件，或是直接选择或修改一个已有的反应程序文件。2.1.2.1 选择一个已有的反应程序文件1. 点击Protocol键，在弹出的浏览器中选定所要选择的反应程序文件的路径。2. 点击所需的反应程序文件的文件名，此时该文件的具体设置在SelectedProtocol窗口中显示出来。 注意：iQ5软件安装后，里面会自带一些我们设置好的反应程序文件作为示例，用户可以直接调用它们。2.1.2.2 创建或修改一个反应程序文件在Selected Protocol窗口点击
5、Edit键即可对当前的反应程序文件进行修改； 在Selected Protocol窗口点击Create New键即可创建一个新的反应程序文件。 无论点击Edit或Create New键，软件都会自动切入Protocol Edit窗口。 这个窗口下部有一显示反应内容的表格，用户可以在其中按自己的需求进行修改。1. 修改保温时间和保温温度。Dwell Time列设置保温时间，Setpoint列设置保温温度。如果用户要设置一个10秒的保温时间，那就要在相应格中输入0：10或者0.10。2. 选择荧光数据收集步骤Data Acquisition列用于设置荧光数据收集步骤。其中Real-Time选项用于
6、荧光定量，Melt Curve用于熔点曲线分析。注意：如要进行荧光PCR 实验，必须保证程序中至少有一个荧光数据收集步骤。3. 插入循环或步骤在表格中Cycle列有数字显示的行，点击该行Insert列的+，即可完成循环插入，系统默认插入的循环在当前循环之后。在表格中Step列有数字显示的行，点击该行Insert列的+，即可完成步骤插入，系统默认插入的步骤在当前步骤之后。4. 删除循环或步骤点击某Cycle 行 Delete列的×，即可将该循环删除。点击某Step 行 Delete列的×，即可将该步骤删除。5. 文件保存点击Save and Exit Protocol Edi
7、ting键，在随后出现的Save as对话框中输入程序文件的名称，再点击Save键即可完成保存。注意：点击Save and Exit Protocol Editing键或Cancel and Exit Protocol Editing键才能退出Protocol Edit窗口。2.1.3反应板设置文件（Plate Setup file ）设置指南1. 在Workshop 模块中，用户可以：a. 点击反应板设置文件显示区的Create New键创建一个新的反应板设置文件；b. 点击反应板设置文件显示区的Plate键，在浏览器中选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，即可选中该文件；c. 点击
8、反应板设置文件显示区的Plate键打开浏览器，选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，再点击Edit键即可对该文件进行修改；d. 点击Data File键，在随后出现的浏览器中选择数据文件。点击其文件名即可打开其关联的反应板设置文件，再点击Edit键即可对其进行修改。2. 在Notes栏中输入或修改对该文件的说明。3. 在样品体积（Sample Volume ）、封板类型（Seal Type）、反应容器类型（V esselType ）各项设置中输入或修改相应内容。4. 输入或修改文件名。5. 点击Select/Add Fluorophores 键选择本次实验所要使用的荧光染料种类，在软件
9、中每种选中的荧光染料都会用一独特的图标表示。6. 如果Whole Plate Loading显示在取消状态，请选择该选项选项。注意当用户修改一个反应板设置文件时，该选项为不可用。7. 点击某一样品类型图标。 8. 用点击或拖曳来设定该样品类型对应的反应孔。9. 点击某一荧光染料图标。10. 用点击或拖曳来设定该荧光染料对应的反应孔。11. 重复以上78两个步骤，直到所有反应孔第一荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。12. 如要取消某孔此前的所有设置，点击Delete All键，再点击该孔。13. 如要取消某孔此前的荧光染料设置，点击Delete Fluorophore 键，再点击该孔。14.
10、如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard ），点击Dilution Series 键可设置其原始靶核酸数量。以上为所有反应板设置文件共通的部分，根据反应板设置文件对应类型不同，以下的步骤有所区别。a. 单色荧光检测（Single-Color Experiments ）15. 点击Save & Exit Setup键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为.pts的文件形式保存。b. 多色荧光检测并启用Whole Plate Loading选项（Multi-Color Experiments with Whole Plate Loading
11、Selected ）15. 点击第二荧光染料对应的图标。16. 如要取消当前选择的第二荧光染料，点击Delete Fluophore图标并点击相应反应孔。17. 点击Paint Can图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料对应的反应孔。19. 重复78两个步骤，直到所有反应孔第二荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。20. 重复1519的步骤，把第三、第四荧光染料设置完毕（如有需要）。21. 点击Save & Exit Setup键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为.pts的文件形式保存。c. 多色荧光检测并不启用Whole Plate Loading选项
12、（Multi-Color Experiments with Whole Plate Loading Deselected ）15. 点击第二荧光染料对应的图标。此时会显示所有反应孔对应第一荧光染料会显示，但其样品类型不会显示。同样在设置第三及第四荧光染料时，此前的荧光染料对应的样品类型也不会显示。16. 如要取消当前选择的第二荧光染料，点击Delete Fluophore图标并点击相应反应孔。17. 点击某一样品类型图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料及该样品类型对应的反应孔。19. 重复1718两个步骤设置其他反应对应第二荧光染料的样品类型。20. 如要某些反应孔第二荧光染料对应的样
13、品类型为标准品（Standard ），点击Dilution Series 键可设置其原始靶核酸数量。21. 重复1520的步骤，把第三、第四荧光染料设置完毕（如有需要）。22. 点击Save & Exit Setup键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为.pts的文件形式保存。2.1.4 反应运行指南点击Workshop模块的Run键，软件即会切入Run-Time Central模块的Initiate Run 界面。2.1.4.1 开始运行一次反应1. 在Initiate Run 界面选择所要使用的反应程序文件和反应板设置文件。2. 选择孔间差异因子计算方式。
14、3. 点击Begin Run键。4. 在弹出的Save Optical Data File 对话框中输入数据文件的文件名。5. 点击OK键。2.1.4.2 反应运行实时监控在反应运行开始后，软件会切入Monitor Run界面，在这里会实时显示反应状况。 在反应结束后，会自动弹出Run Status对话框。 如点击Yes，软件会切入Data Analysis模块显示本次反应的数据。如点击No，软件会退回Workshop模块。2.2 数据分析指南2.2.1 综述Data Analysis模块的主要功能就是让用户进行实验数据分析。当用户刚打开iQ5软件时，Data Analysis模块的切换键显示
15、为灰色不可选。用户只有通过Workshop模块的Data File界面选择一数据文件后点击Analyze键，即可进入Data Analysis模块。Data Analysis模块分为以下六个功能界面：PCR Quant：顾名思义，该界面是用于PCR 定量分析的。用户可以在这里定义本底、临界阈值等等参数从而计算出每孔靶DNA 的原始值，而根据标准曲线计算出的各孔PCR 效率也会在这里显示出来。同时，本界面也为下面End Point、Gene Expr 和Allelic Disc 等界面工作提供必要的数据。Melt Curve/Peak：该界面用于分析双链DNA 的熔点温度（T m 值）。用户可以
16、通过加入能与双链DNA 结合的荧光染料（比如SYBR Green I等）或荧光标记的杂交探针进行反应，再用该界面进行分析。End Point：终点法分析，它通过样品相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit，简称RFU ）终值来对样品的阴、阳性进行定性判断。Allelic Disc：该界面可以通过与已知基因型样品的数据进行比较得到未知样品的基因型结果。用户可以通过临界循环数或RFU 来确定样品是野生纯合子、变异纯合子还是杂合子。Gene Expr ：该界面可以提供一些分析工具用于基因表达分析。它既可以让目标基因和其他基因的表达进行比较，也可以将目标基因不同时期或不同生长
17、环境之间进行比较。Edit Plate：在这个界面里，用户可以对反应板设置文件中的各孔的反应类型进行修改，也可以对标准品对应的原始靶核酸量进行修改。这样，万一用户在实验运行前设置发生错误的话，在这里可以很方便地进行修改。注意，如果用户在这里修改后，原始的反应板文件并不会被覆盖。2.2.2 PCR Quant界面设置指南PCR Quant界面主要的功能是设置本底和临界阈值等参数来进行PCR 定量计算。当这些参数设置完成后，软件就会自动分析出每孔样品的临界循环数。如果用户之前设定了标准品，那么此时软件还会计算出其他各孔样品的原始靶核酸含量。对于多重荧光PCR 来说，任一种荧光染料对应的数据均可实现
18、以上分析功能。在本界面中，主要实现以下设置：设置荧光PCR 的本底；设置临界阈值；添加或删除需要分析的反应孔。数据分析步骤：1. Workshop模块中点击Data File键。2. 选择一个数据文件，点击Analyze键，软件会自动切入PCR Quant界面，并自动设置本底和临界阈值。3. 用户可根据需要，通过Analyze Wells选项添加或删除需分析的反应孔。4. 如果当前界面不是PCR Quant界面，请点击PCR Quant切换键。第一次进入一个数据文件时，软件会自动设置本底和临界阈值。如果某个数据文件被修改保存后再打开，此时显示的是最近一次修改的内容。5. 按照需要手动调节本底。
19、6. 按照需要手动调节临界阈值。7. 在手动调节时，用户可以随时通过右击曲线图选择Baseline Threshold fromthe context menu返回软件自动调节模式。2.2.3 Melt Curve/Peak界面设置指南1. Workshop模块中点击Data File键，选择一个数据文件，点击Analyze键，软件会自动切入Data Analysis模块。2. 点击Melt Curve/Peak切换键进入该界面，此时熔点曲线图及其峰图就会显示出来。3. 用户可根据需要，通过Analyze Wells选项添加或删除需分析的反应孔。4. 右击熔点曲线图，在弹出的对话框中可以选择参
20、数调整、复制图表、打印图表等等操作。5. 拖曳临界阈值条，将该值调整到合适的位置。6. 用户可以在列表中选择某一峰，然后点击Delete Selected Peak即可在图中删除该峰。用Shift 组合键可以实现群删。7. 点击Edit Melt Peak Begin/End Temp 键可对默认设置进行修改。8. 点击Restore Default可以返回默认设置。2.2.3 End Point 界面设置指南用户可以采取以下两个方法进入该界面进行终点法分析：在运行时点击Run End Point键。进入Data Analysis模块后点击End Point切换键。以下就分别就这两种方法进行说
21、明方法一 终点法运行1. 将加好样、封闭完成的反应板放到仪器的加热模块上，合上热盖。2. 在Workshop模块中设置好反应板设置文件。3. 点击Run End Point键。4. 进入Run-Time Center模块的Initiate Run界面，调整完反应程序文件后，点击Begin Run键。注意：进行终点法分析时，其孔间差异因子必须恒定。5. 输入其数据文件名，点击Save键保存。6. 当反应运行完成后，软件会自动切入End Point界面。7. 调整以下参数：分析方法运用Nagatives区分出那些未扩增的反应孔终点误差及误差参数。8. 用户可根据需要，通过Analyze Wells
22、选项添加或删除需分析的反应孔。9. 在Define Control中定义阴性对照和阳性对照。10. 点击Recalculate键，软件进行分析。并在Unknowns Call 中给出每个未知样本是阴性、阳性还是空白的定性结果。11. 点击Report键获得分析报告。方法二 终点法数据分析1. Workshop模块中点击Data File键，选择一个数据文件。2. 点击Analyze键。3. 点击EndPoint切换键进入该界面。4. 调整以下参数：分析方法运用Nagatives区分出那些未扩增的反应孔终点误差及误差参数。5. 用户可根据需要，通过Analyze Wells选项添加或删除需分析的
23、反应孔。6. 在Define Control中定义阴性对照和阳性对照。7. 点击Recalculate键，软件进行分析。并在Unknowns Call 中给出每个未知样本是阴性、阳性还是空白的定性结果。8. 点击Report键获得分析报告。2.2.4 Allelic Disc 界面指南该界面通过对样品临界循环数或RFU 值进行统计分析，绘制散点图来区别不同基因型。1. Workshop模块中点击Data File键，选择一个数据文件。2. 点击Analyze键，软件会切入PCR Quant界面，系统会自动设置本底和临界阈值，如用户想对其进行修改，参看上文相关内容。3. 用户可根据需要，通过An
24、alyze Wells选项添加或删除需分析的反应孔。4. 点击Allelic Disc切换键进入该界面。5. 在Assign Fluorophores 栏中选择各基因型对应的荧光染料。 6. 在Display Mode栏中选择统计数据的类型（临界循环数还是RFU ）。 Threshold Cycle代表临界循环数。注意：如一样品在反应中其荧光读数未超过临界阈值，则在散点图上该样品的临界循环数将会表示成反应循环的总数。RFU代表相对荧光读数。用户可以通过Select Cycle来选择取哪个循环的读数进行分析。7. 选择Automatic Call或者Manual Call 来进行分析，其中Aut
25、omatic Call（自动分析）是默认模式。 a. 在Automatic Call 模式中，软件会自动生成散点图进行分析。 对照1和对照2都必须至少重复三孔。如没有命名对照，则轴线上会显示90%的临界循环数或10%的RFU 。用户可以拖曳阈值线进行调整。b. Manual Call 是另一种分析模式，用户可以手动在散点图或数据列表中修改参数。散点图：在Allele Call选好相应选项后，用户可以移动十字光标选择图中对应的样品点。软件会自动在图中做出调整，在列表中也同时发生相应的变化。 数据列表：用户可在数据列表中修改Call栏相应内容，散点图中也会据此发生相应变化。8. 点击Report键
26、获得分析报告。2.2.5 Gene Expr 界面指南在本界面中，软件会以定量PCR 为基础对基因之间的表达进行比较。比如取两个基因进行比较，一个反应孔里有100ng cDNA ，另一个只有1ng cDNA ，通过定量PCR 分析就能得到其相对的关系。iQ5软件提供了两种基因表达比较模式：相对表达和校正表达。前者直接用样品的C T 值进行比较。后者则设定一个恒定量对照基因，用样品与其的对照值进行比较，该基因事先要用细胞数测定、RNA 丰度等非PCR 方法定好量。比如样品A 和B ，两者C T 值相同。用前者比较就1：1。如果用后者，如果设定相同C T 值时，A 的荧光染料与对照基因对比值是B
27、的荧光染料与对照基因对比值B 的荧光染料的两倍时候，那结果就会是2：1。2.2.5.1 相对表达指南1. 根据上文所述，在PCR Quant界面调整好定量PCR 参数。2. 点击Gene Expr切换键，进入该界面。3. 选择Relative Quantity的分析模式。4. 如有需要，可调节相应参数。5. 点击Recalculate键获得结果。2.2.5.2 校正表达指南1. 根据上文所述，在PCR Quant界面调整好定量PCR 参数。2. 点击Gene Expr切换键，进入该界面。3. 选择Normalized Quantity的分析模式。4. 如有需要，可调节相应参数。5. 在表达设置
28、中选择相应基因。6. 点击Recalculate键获得结果。2.2.6 Edit Plate 界面指南该界面用于完成反应后修改反应板设置文件。1. 有两种方法进入Data Analysis模块：a. 在Workshop模块中点击Data File键，在随后出现的浏览器内找到所要数据文件的路径，双击其文件名，就会切入Data Analysis模块。b. 在Workshop模块中点击Data File键，在随后出现的浏览器内找到所要数据文件的路径，单击其文件名，再点击Analyze键。2. 点击Edit Plate切换键。 3. 此时切入Edit Plate界面。注意，在这个界面中，荧光染料方面的
29、设置是无法进行修改。 4. 在Notes栏可对反应说明进行修改。5. 在Experiment Name 栏可对数据文件名进行修改。6. 如果Whole Plate Loading选项不可用，则取消其相关设定，相反则保留。如果切入界面时该选项就不可用，那么在该界面就无法打开这个选项。7. 样品类型修改步骤：a. 点击选择一种荧光染料。b. 点击选择一种样品类型图标。c. 在Next栏里选择样品群的数量。d. 在Replicate区选择该样品类型对应的区域定义方式。e. 用户也可以通过单击目标反应孔的方法修改其样品类型。f. 重复步骤be，完成该荧光染料对应的其他样品类型的修改。g. 重复步骤af
30、，完成其他荧光染料对应样品类型的修改。8. 标准品含量修改步骤：a. 点击选择标准品对应的荧光染料。b. 点击Dilution Series让软件自动计算标准品含量，或者手动输入。9. 在Units栏选择标准品计量单位。10. 完成修改后，点击Apply Plate Changes键，软件会根据修改对数据重新分析。 11. 如想返回原始设置，点击Restore Original Plate 键，即可完成。 2.3 系统校正指南2.3.1 综述在Calibration模块中，用户可以对iQ5 多重实时荧光定量PCR 仪的光学成象系统进行校正。一般校正步骤：1. 掩模对准2. 本底校准3. 恒定孔
31、间差异因子的检测4. 纯染料校正校正操作材料准备1. iCycler iQ 校正系列试剂（iCycler iQ Calibrator Dye Solution Set ）2. iCycler iQ 内部孔间差异因子系列试剂（iCycler iQ External Well FactorSolution Set ）3. 3块96孔PCR 反应板或相应量的8联管、PCR 单管。4. 光学级封板膜或相应封板耗材校正操作准备用户必须准备三块96孔PCR 反应板来进行不同的校正操作。恒定孔间差异因子校正准备：1. 用蒸馏水把10×内部孔间差异因子校正工作液稀释为1×的浓度。2. 在第
32、一块96孔板中加稀释过的工作液。注意要每孔都加，且都要加一样的量。3. 用封板膜将加完样的板封起来。本底校正准备：除用工作液不同外，第二块板也象上文那样操作。纯染料校正板准备：1. 在第三块96孔板上，取一种染料校正液，加一列8孔，每孔同一体积。2. 其他种类的染料校正液也每样加一列8孔。3. 用封板膜将加完样的板封起来。2.3.2掩模对准在进行掩模对准前，先做好以下工作：1. 按上文所示，准备好一块恒定孔间差异因子校正板。2. 把该板放入仪器内。3. 在软件上切换到Calibration模块的Mask界面。掩模对准操作步骤：1. 点击Home键。2. 点击Filter Position 栏的
33、3键。3. 点击Take an Exposure键。4. 点击Show Mask键。5. 如果图象中出现粉红色象素点，降低暴光时间，重复步骤34，直到没有粉红色象素点出现。6. 点击Optimize Mask键。7. 点击Save Mask键。2.3.3本底校准在进行本底校准前，先做好以下工作：1. 按上文所示，准备好一块本底校正板。2. 必须先完成掩模对准。3. 把该板放入仪器内。4. 在软件上切换到Calibration模块的Background界面。本底校准操作步骤：1. 选择一种封板类型。2. 选择一种反应容器类型。3. 点击Collect Background Factor键。4.
34、当软件完成校准分析后，会弹出一个对话框Background Calibration RunComplete。5. 点击OK键退出。2.3.4恒定孔间差异因子的检测在恒定孔间差异因子的检测前，先做好以下工作：1. 按上文所示，准备好一块恒定孔间差异因子校正板。2. 必须先完成掩模对准和本底校准。3. 把该板放入仪器内。4. 在软件上切换到Calibration模块的Well Factor界面。恒定孔间差异因子的检测操作步骤：1. 选择对应的样品体积。2. 选择一种封板类型。3. 选择一种反应容器类型。4. 点击Collect Persistent Well Factors键。5. 当软件完成分析
35、后，会弹出一个对话框Persistent Well Factor Calibration RunComplete。6. 点击OK键退出。2.3.5纯染料校正在纯染料校正前，先做好以下工作：1. 按上文所示，准备好一块纯染料校正板。2. 必须先确认其他三项校正已全部完成。3. 把该板放入仪器内。4. 在软件上切换到Calibration模块的Pure Dye界面。纯染料校正操作步骤：1. 创建一个新的纯染料校正反应板设置文件或选择一个已有的设置文件。2. 点击Run Pure Dye Calibration键。3. 当软件完成分析后，会弹出一个对话框Pure Dye Calibration Ru
36、n Complete。4. 点击OK键退出。至此，所有的校正操作全部完成。注意：SYBR 和SYBR1-5都不需要进行校正。3. iQ5软件操作说明3.1 综述iQ5软件系统分为4个部分，我们称之为4个模块。每个模块对应不同的功能。在软件界面的左半部有对应的4的切换键，用户可以通过它们来进出各模块（注意，刚打开软件时，有些模块切换键呈灰色，不可选）。这四个模块分别是：Workshop 模块：用户可在这个模块中创建、修改反应程序文件和反应板设置文件，还可以以当前的设置运行反应。该模块分为Setup和Plate Summary两个窗口，Plate、Protocol、Run Set和Data Fil
37、e四个界面。 Run-Time Center 模块：该模块的功能在于实时监测反应运行状况。Data Analysis模块：该模块的功能是实验数据的分析。在这个模块中，用户可以对数据进行PCR 定量、熔点温度、基因分型、基因表达等多项分析。 Calibration 模块：在这个模块中，用户可以对仪器的光学系统进行校正。 3.2 Workshop 模块3.2.1 综述Workshop模块由Setup和Plate Summary两个窗口组成。3.2.1.1 Setup窗口Setup 窗口是Workshop模块的默认打开窗口。 该窗口含有4个界面：Protocol ：这部分界面负责PCR 热循环反应程
38、序相关操作。Plate ：这部分界面负责反应板设置文件相关操作。Run Set ：这部分选择反应所对应的反应程序文件和反应板设置文件。Data File：这部分可以选择打开已有的数据文件。Setup 界面组成及各功能键：Setup窗口分为四个部分。文件浏览器：处于窗口的左上部。用户可以在其中通过路径树找到想要选择的各种文件。里面有4个切换键，点击一键，那么浏览器里只能选择与之对应的文件类型。Protocol 切换键：点击该键后，浏览器里可选择的文件类型为反应程序文件，后缀为.tmo 。Plate 切换键：点击该键后，浏览器里可选择的文件类型为反应板设置文件，后缀为.pts 。 Run 切换键：
39、点击该键后，浏览器里可选择的文件类型为反应运行设置文件（其实为反应用反应程序文件和反应板设置文件的一个连接性文件），后缀为.run 。 Data File切换键：点击该键后，浏览器里可选择的文件类型为反应数据文件，后缀为.opd 。Selected Protocol 区：该区位于窗口的左下部，显示在文件浏览中选择的反应程序文件的具体内容，分为曲线图和列表。其上方显示当前反应程序文件的文件名。如果用户在文件浏览器中选择了一个反应数据文件，那本区显示为该数据文件对应的反应程序文件。Selected Plate Setup 区：该区位于窗口的右下部，显示在文件浏览中选择的反应板设置文件的具体内容。其
40、上方显示当前反应板设置文件的文件名。如果用户在文件浏览器中选择了一个反应数据文件，那本区显示为该数据文件对应的反应板设置文件。Selected Data File区：该区位于窗口的右上部，显示在文件浏览中选择的反应数据文件的相关内容。在Notes栏中显示对该数据文件的说明。其中有三个功能键。Run 键：点击该键后，会以当前的反应程序文件和反应板设置文件开始一次反应。 Run End Point键：点击该键后，会开始一次终点法反应。Analyze 键：点击该键后，会切入Data Analysis模块对当前数据进行分析。3.2.1.2 Plate Summary 窗口这个窗口会显示更详细的反应板设
41、置文件的内容，比如用户对每个样品属性的注释和标准品含量等等，这将会为用户检查文件设置正确与否提供方便。如果用户在Setup窗口中打开了一个反应数据文件，那么本窗口显示的将会是与其对应的反应板设置文件。用户可以点击窗口左上各荧光染料切换键来选择显示不同荧光染料对应的设置内容。点击Copy To Clipboard键会将显示的表格复制到剪贴板上，并可以粘贴到其他文档中去。点击Print键可将显示表格打印出来。3.2.2 反应板设置文件3.2.2.1 综述在Workshop模块中可以对反应板设置文件的各项具体内容进行设置，包括样品类型、标准品含量、荧光染料类型等等。用户还可以直接导入一个CSV 文件
42、来注释每个样品。选择一个反应板设置文件：在Workshop模块中按此法打开一个反应板设置文件。1. 点击Plate切换键，在浏览器中找到文件储存路径。注意：如打开一个反应数据文件，其对应的反应板设置文件也会显示。 2. 点击其文件名，此时Selected Protocol 区会显示其具体内容。此时各孔默认的显示第一种荧光染料对应的样品类型。用户可以点击左上的荧光染料切换键来显示不同荧光染料的相关内容。上方Sample Volume显示的是反应体积，Seal Type显示的是封板模式，Vessel Type显示的是反应容器类型。 如果用户在反应结束后修改过反应板设置文件，那么点击右上方的Orig
43、inal选项可以显示原始未修改过的文件，点击Current选项显示修改过的文件。 在这个显示界面中，是无法对文件中任何内容进行修改的。创建或修改一个反应板设置文件修改一个反应板设置文件1. 如上文所述，选择一个反应板设置文件。2. 点击Edit键，进入反应板设置修改器。用户也可以直接在选择反应板设置文件时候双击文件名进入。3. 修改完成后，点击Save & Exit Plate Setup键保存退出。4. 在Plate Summary窗口确认修改的内容是否正确。创建一个反应板设置文件1. 点击Selected Plate Setup区的Create New键，进入反应板设置修改器。2.
44、 设置完成后，点击Save & Exit Plate Setup键保存退出。3. 在Plate Summary窗口确认修改的内容是否正确。3.2.2.2 反应板设置修改器反应板设置修改器主体是一个96孔反应板模拟图，并有一些功能键来实现样品类型、荧光染料种类等的设置。而下方的列表中也详细显示了各孔的注释内容。 还有两个界面可以显示设置具体内容：1. Plate Summary窗口。2. 点击反应板设置修改器的Spreadsheet键，其显示的列表也显示其设置具体内容。退出反应板设置修改器如用户点击Cancel & Exit Plate Setup键，则取消一切修改内容，退出修改
45、器。如用户点击Save & Exit Plate Setup键，则保存一切修改内容，退出修改器。 注意：用老版本软件建立的.pts 文件也可以修改，但必须添加反应容器类型和封板模式相关内容才能保存反应板设置文件修改步骤：1. 在Workshop 模块中，用户可以：a. 点击反应板设置文件显示区的Create New键创建一个新的反应板设置文件；b. 点击反应板设置文件显示区的Plate键，在浏览器中选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，即可选中该文件；c. 点击反应板设置文件显示区的Plate键打开浏览器，选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，再点击Edit键即可对该文
46、件进行修改；d. 点击Data File键，在随后出现的浏览器中选择数据文件。点击其文件名即可打开其关联的反应板设置文件，再点击Edit键即可对其进行修改。2. 在Notes栏中输入或修改对该文件的说明。3. 在样品体积（Sample Volume ）、封板类型（Seal Type）、反应容器类型（V esselType ）各项设置中输入或修改相应内容。4. 输入或修改文件名。5. 点击Select/Add Fluorophores 键选择本次实验所要使用的荧光染料种类，在软件中每种选中的荧光染料都会用一独特的图标表示。6. 如果Whole Plate Loading显示在取消状态，请选择该选
47、项选项。注意当用户修改一个反应板设置文件时，该选项为不可用。7. 点击某一样品类型图标。8. 用点击或拖曳来设定该样品类型对应的反应孔。9. 点击某一荧光染料图标。10. 用点击或拖曳来设定该荧光染料对应的反应孔。11. 重复以上78两个步骤，直到所有反应孔第一荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。12. 如要取消某孔此前的所有设置，点击Delete All键，再点击该孔。13. 如要取消某孔此前的荧光染料设置，点击Delete Fluorophore 键，再点击该孔。14. 如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard ），点击Dilution Series 键可设置其原
48、始靶核酸数量。以上为所有反应板设置文件共通的部分，根据反应板设置文件对应类型不同，以下的步骤有所区别。a. 单色荧光检测（Single-Color Experiments ）15. 点击Save & Exit Setup键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为.pts的文件形式保存。b. 多色荧光检测并启用Whole Plate Loading选项（Multi-Color Experiments with Whole Plate Loading Seleted ）15. 点击第二荧光染料对应的图标。16. 如要取消当前选择的第二荧光染料，点击Delete Fluo
49、phore图标并点击相应反应孔。17. 点击Paint Can图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料对应的反应孔。19. 重复78两个步骤，直到所有反应孔第二荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。20. 重复1519的步骤，把第三、第四荧光染料设置完毕（如有需要）。21. 点击Save & Exit Setup键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为.pts的文件形式保存。c. 多色荧光检测并不启用Whole Plate Loading选项（Multi-Color Experiments with Whole Plate Loading Deseleted ）
50、15. 点击第二荧光染料对应的图标。此时会显示所有反应孔对应第一荧光染料会显示，但其样品类型不会显示。同样在设置第三及第四荧光染料时，此前的荧光染料对应的样品类型也不会显示。16. 如要取消当前选择的第二荧光染料，点击Delete Fluophore图标并点击相应反应孔。17. 点击某一样品类型图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料及该样品类型对应的反应孔。19. 重复1718两个步骤设置其他反应对应第二荧光染料的样品类型。20. 如要某些反应孔第二荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard ），点击Dilution Series 键可设置其原始靶核酸数量。21. 重复1520的步
51、骤，把第三、第四荧光染料设置完毕（如有需要）。22. 点击Save & Exit Setup键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为.pts的文件形式保存。3.2.2.3 样品类型图标在96孔模拟图的上方有9种不同样品类型的图标，用户通过这两者来定义不同反应孔的样品类型。 当一个图标被红框框住时，代表此样品类型为当前选择的样品类型。各图标代表意义如下： 该光标可以选择反应孔，但不能改变其属性。 该光标用于定义标准品。 该光标用于定义未知样品。 该光标用于定义阴性对照。该光标用于定义阳性对照。 油漆桶状光标，当点击该光标再点击某一样品群中的某一孔时候，该样品群其他所
52、有样品类型均会与该孔相同。 点击该光标再点击某一反应孔，那么这个反应孔对应当前荧光染料的样品类型设置将会被删除。 点击该光标再点击某一反应孔，那么这个反应孔对应所有荧光染料的样品类型设置将会被删除。3.2.2.4 选择/添加荧光染料在iQ5中，每个反应孔至少要设置一种荧光染料。一块反应板最多可以设置五种不同的荧光染料，且这五种荧光染料可以设置在一个反应孔里。在iQ5软件设置中，用户可以在一次反应中同一荧光滤镜组中设置对应五种不同荧光染料。比如用户在一块反应板中些孔用SYBR ，有些孔用FAM （这两者所对应的荧光滤镜组相同）。但是这种类型的荧光染料不能设置在一个反应孔里，否则检测时无法分辨。
53、点击Select/Add Fluorophores键，在随后出现的文件框中可以选择添加其他荧光染料。点击其中的Select栏打上，代表该荧光染料已被选择，再点一下 消失，则代表取消选择。选择好后点击OK键即可完成添加。 如用户需要的荧光染料未在该文件框中出现，则可点击Add New Fluor键，自行添加，当然使用前必须进行一次纯染料校正。3.2.2.5 设置样品群在96孔模拟图左侧有一些功能键可用于定义样品群。 系统默认的定义方式。先点击该键，然后可按下列各法进行操作。点击一个反应孔，既代表该孔被选入样品群。点击一行或一列头上的序号，则代表该行或该列所有的孔都被选入样品群。 在模拟图上按住鼠
54、标左键进行拖曳，拖曳区域内所有的孔都被选入样品群。在下面有横向和纵向两个定义键，配合Size选项，可很方便地设置样品群。如上图，选择了横向定义，Size为5，可按下列各法进行操作。点击一个反应孔，既代表该孔在内横向从左到右连续5个样品被选入样品群，如果该孔后面不满4个，则自动转到下一行。点击某一行头上的序号，则代表该行头5个进入样品群1，挨着的5个进入样品群2，剩下的2个进入样品群3。在模拟图上按住鼠标左键进行拖曳，拖曳区域内从第一行最左面一孔开始，从左到右连续5个进入样品群1，挨着5个进入样品群2，依次类推。 如上图，选择了纵向定义，Size为3，可按下列各法进行操作。点击一个反应孔，既代表该孔在内纵向从左到右连续3个样品被选入样品群，如果该孔后面不满2个，则自动转到下一列。点击某一列头上的序号，则代表该行头3个进入样品群1，挨着的3个进入样品群2，剩下2个进入样品群3。在模拟图上按住鼠标左键进行拖曳，拖曳区域内从第一行最左面一孔开始，从上到下连续3个进入样品群1，挨着3个进入样品群2，依次类推。 Next栏用于设置当前孔后连续几个孔进入样品群。这是一个非常方便修正错误样品群设定的方法。用户可以点击上下来改变其大小，也可以直接键入数字。3.2.2.6 反应体积、封板模式、反应容器类型设置在反应板设置文件中必须设定反应体积、封板模式和反应容器类型。因为这三项
