1、第二节 实时荧光定量实时荧光定量PCR实时荧光定量实时荧光定量PCR仪、技术仪、技术原理及应用原理及应用一、实时荧光定量一、实时荧光定量PCR仪仪二、实时荧光定量二、实时荧光定量PCR的技术原理的技术原理 1. 定量与常规的差别定量与常规的差别 2. 荧光扩增曲线荧光扩增曲线 3. 荧光阈值和荧光阈值和CT值值 4. 熔解曲线熔解曲线 5. 标准曲线标准曲线 6. 何为实时？何为实时？ 7. SYBR Green I 的工作原理的工作原理 8. Molecular Beacons（发夹型杂交探针）的（发夹型杂交探针）的工作原理工作原理 9. TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理（水解型杂交
2、探针）的工作原理 10. 多色多通道技术应用多色多通道技术应用基因表达分析基因表达分析 11. 内标技术介绍内标技术介绍三、三、 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的应用介绍技术的应用介绍 1. 医疗方面医疗方面 2. 研究方面研究方面 3. 其它方面其它方面四、荧光定量四、荧光定量PCR 实验室所需仪器设备清单实验室所需仪器设备清单五、实时定量五、实时定量PCR 及应用于植物分子生物学的及应用于植物分子生物学的 研究研究一、实时荧光定量一、实时荧光定量PCR仪仪 热循环仪（热循环仪（PCR仪）仪） 荧光检测系统荧光检测系统 计算机及软件系统计算机及软件系统不产热的光源不产热的光源- 发光二极
3、管（发光二极管（LED）灵敏度高的检测器灵敏度高的检测器- 光电倍增管（光电倍增管（PMT）优点：优点： 不产热不产热-无散热装置，全封闭无散热装置，全封闭 无机械转动装置无机械转动装置-抗震性强抗震性强 无需经常校准，耐用无需经常校准，耐用 灵敏度灵敏度高高 线性范围线性范围广广 Opticon 实时荧光定量实时荧光定量 PCR仪仪荧光检测荧光检测 热循环仪热循环仪光色光色: 蓝色光蓝色光 均一性均一性: 0.4C染料染料: FAM, SYBR Green I, Molecular beacons TaqMan Probes 精确性精确性: 0.3C激发光波长：激发光波长： 450-495n
4、m发射光波长发射光波长: 515-545nm 升降温速率升降温速率: 最高最高3C/秒秒.灵敏度灵敏度: 5nM的荧光素的荧光素 温度梯度温度梯度: 有有检测范围检测范围: 100 – 108 拷贝拷贝容量容量: 96样品样品反应管反应管: 0.2mL反应管反应管& 96 孔板孔板操作系统操作系统: Windows NT二、实时荧光定量二、实时荧光定量PCR的技术原理的技术原理1.1.定量与常规的差别定量与常规的差别 常规常规PCR技术：对技术：对PCR扩增反扩增反应的应的终产物终产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析 定量定量PCR技术：对技术：对PCR扩增反扩增反应中应中每一个循
5、环的产物每一个循环的产物进行定量进行定量及定性分析及定性分析SYBR Green I 定量原理定量原理 确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度: 初始初始DNA量越量越多多, 荧荧光达到某一值（域值）时所需要的光达到某一值（域值）时所需要的循环数循环数越少越少LogLog浓度与循环数呈线性关系浓度与循环数呈线性关系：根据样品根据样品扩增扩增达到域值的循环数达到域值的循环数就可计算出样品中就可计算出样品中所含的模板量所含的模板量实时荧光实时荧光定量定量PCR：其反应体系中，引入了：其反应体系中，引入了一种荧光化学物质一种荧光化学物质，随着，随着PCR反应的进行，反应的进行，PCR反应产物不断累计，
6、荧光信号强度也反应产物不断累计，荧光信号强度也等等比例增加比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光每经过一个循环，收集一个荧光强度信号强度信号，这样我们就可以通过，这样我们就可以通过荧光强度变荧光强度变化监测产物量的变化化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩，从而得到一条荧光扩增曲线。增曲线。2.2.荧光扩增曲线荧光扩增曲线荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信背景信号阶段号阶段，荧光信号，荧光信号指数扩增阶段指数扩增阶段和和平台期平台期 。荧光背景信号阶段荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。背景信
7、号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。平台期平台期：扩增产物已：扩增产物已不再呈指数级的增加不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起产物量不能计算出起始始DNA拷贝数。拷贝数。只有在只有在荧光信号指数扩增阶段荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。们可以选择在这个阶段进行定量分析。3. 荧光阈值和荧光阈值和CT值值 荧光阈值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一是在荧
8、光扩增曲线上人为设定的一个值个值 ，它可以设定在，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段荧光信号指数扩增阶段任意位置上任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省，但一般我们将荧光域值的缺省设置是设置是3-15个循环个循环的的荧光信号的标准偏差的荧光信号的标准偏差的10倍倍。 荧光阈值线的位置荧光阈值线的位置一般事实上一般事实上位于减去本底位于减去本底的位置上的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。信号并且开始增加。 对某一样品的对某一样品的C（t）值值就定义为就定义为荧光量与荧荧光量与荧光阈值线交叉光阈值线交叉时的时的循环数循环数。即每个反应管内。即每个反应
9、管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为数被称为CT值值（threshold value）。 定量荧光扩增曲线定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。是荧光量与循环数的图表。4. 熔解曲线熔解曲线在在PCR结束后，我们可以根据结束后，我们可以根据变性过程中的荧光变性过程中的荧光值变化值变化绘出每个样品的绘出每个样品的熔解曲线熔解曲线。 绘制熔解曲线时，绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每仪连续监测每个样品在从个样品在从双链完全配对双链完全配对到到完全解链的升温过程完全解链的升温过程中中荧光值的变化过程荧光值的变化过程。 不同的
10、扩增产物因为其不同的扩增产物因为其长度长度和和GC含量含量不同不同而在而在不不一样的温度一样的温度下解链，当下解链，当产物解链时，产物解链时，SYBR Green的荧光值将降低的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘并被仪器监测到。由此绘制出制出荧光强度随温度变化荧光强度随温度变化的的负一次倒数图负一次倒数图。 荧光强度变化的拐点（熔点，荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为即为熔解峰值熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的熔解曲线是扩增反应的质控途径质控途径，当图中，当图中没有没有出出现现杂峰杂峰，也未出现，也未出现主峰的异常增宽主峰的异常增宽：表明实验中：表明实验中未出现未出现污染污染、引物二聚体引物二
11、聚体和和非特异性扩增非特异性扩增。 5. 标准曲线标准曲线CT值与起始模板的关系值与起始模板的关系研究表明，研究表明，每个模板的每个模板的CT值与该模板的起始拷值与该模板的起始拷贝数的对数贝数的对数存在存在线性关线性关系系：起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CT值越小值越小。利用利用已知起始拷贝数的已知起始拷贝数的标准品标准品可作出标准曲线，可作出标准曲线，其中其中横坐标代表横坐标代表CT值，值，纵坐标代表起始拷贝数纵坐标代表起始拷贝数的对数的对数（如图（如图3所示）。所示）。因些因些只要获得未知样品只要获得未知样品的的CT值值，即可从标准曲，即可从标准曲线上计算出线上计算出该样品的起该样品的起
12、始拷贝数始拷贝数。 This technology is very sensitive in that it is able to detect single copies of genes and requires very little starting material across a wide spectrum of conditions. The system monitors PCR at each cycle of a reaction, and estimates the cycle when the reaction reaches log phase increments
13、 (when the most useful quantitative information about the sample is available) Quantitation can be relative to an internal standard such as a housekeeping gene, or absolute when compared to a standard curve generated from known concentrations. 6. 何为实时？何为实时？试剂方面：试剂方面： 如何做到如何做到相对荧光强度反应的是相对荧光强度反应的是PCR产
14、物的相对产物的相对量；如何做到量；如何做到相对荧光强度相对荧光强度反应的是反应的是特特定定PCR产物产物的的相对量相对量；仪器方面：仪器方面： 如何如何测定相对荧光强度测定相对荧光强度Opticon 实时荧光定量实实时荧光定量实PCR仪试剂仪试剂工作原理工作原理 工作原理工作原理 哪一步可以观察到荧光信号？哪一步可以观察到荧光信号？ 变性；复性；延变性；复性；延 伸伸 应用应用7. SYBR Green I 的工作原理的工作原理 SYBR Green I结合到结合到双链双链DNA的小沟部的小沟部 SYBR Green I染料只有和染料只有和双链双链DNA结合后才结合后才发荧光。发荧光。 SYB
15、R Green的的最大吸收波长最大吸收波长约为约为497nm，发射波长发射波长最大约为最大约为 520nm。 在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染荧光染料，料，SYBR荧光染料荧光染料特异性地掺入特异性地掺入DNA双链双链后，后，发射强荧光信号发射强荧光信号; 而而不掺入不掺入链中的链中的SYBR染料分染料分子子仅有微弱荧光信号背景仅有微弱荧光信号背景，从而保证，从而保证荧光信号荧光信号的增加与的增加与PCR产物的增加同步产物的增加同步。 变性：无荧光信号，未结合变性：无荧光信号，未结合SYBR Green I Dye 通过产物的通过产物的Tm值值来来确定产物确定产
16、物SYBR Green的特点的特点由于它与所有的双链由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此不同而特别定制，因此通用性好通用性好，且，且价格相对较价格相对较低低。利用利用荧光染料可以指示双链荧光染料可以指示双链DNA熔点熔点的性质，通的性质，通过熔点曲线分析可以过熔点曲线分析可以识别扩增产物识别扩增产物和和引物二聚体引物二聚体，因而可以因而可以区分非特异扩增区分非特异扩增。此外，由于一个此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料产物可以与多个分子的染料结合，因此结合，因此SYBR Green的检测的检测灵敏度很高灵敏度很高。但是，由于但是，由于SY
17、BR Green与所有的双链与所有的双链DNA相相结合，因此由结合，因此由引物二聚体、单链二级结构引物二聚体、单链二级结构以及以及错错误的扩增产物误的扩增产物引起的引起的假阳性假阳性会影响定量的精确性。会影响定量的精确性。通过测量通过测量升高温度后荧光的变化升高温度后荧光的变化可以可以帮助降低非帮助降低非特异产物的影响特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一由熔解曲线来分析产物的均一性性有助于更有助于更准确地准确地分析分析SYBR GreenI。CYBR GreenI 的应用范围及优缺点的应用范围及优缺点起始模板浓度定量起始模板浓度定量融解曲线分析：可区分单一产物、变异产物、融解曲线分析：可
18、区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体多种产物和（或）引物二聚体基因型分析基因型分析v 使用方便：不必设计复杂的引物使用方便：不必设计复杂的引物v 没有序列特异性：可以用于不同的模板没有序列特异性：可以用于不同的模板v 便宜便宜v 灵敏灵敏v 与与非特异性产物非特异性产物结合结合8. Molecular Beacons（发夹型杂交探针）的工作原理发夹型杂交探针）的工作原理原理：荧光谐振能量传递（原理：荧光谐振能量传递（FRET） 环环与与目标序列目标序列完全配对完全配对 茎茎由由互补配对的序列互补配对的序列组成组成 变性变性: 产生产生非特异性非特异性的荧光的荧光 延伸延伸: 没有
19、没有荧光荧光分子分子 Beacons是一种在是一种在靶靶DNA不存在不存在时时形成形成茎环结构茎环结构的的双标记寡核苷酸探针双标记寡核苷酸探针。 在此在此发夹结构发夹结构中：位于分子一端的荧光中：位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近靠近。 在此结构中，在此结构中，荧光基团被激发后荧光基团被激发后不是产生不是产生光子光子，而是将，而是将能量传递给淬灭剂能量传递给淬灭剂，这一过，这一过程称为程称为荧光谐振能量传递（荧光谐振能量传递（FRET）。分子信标的结构：是一个具有分子信标的结构：是一个具有茎环茎环（loop-stem）结构的）结构的寡核苷酸探针寡
20、核苷酸探针，通常，通常有有2535个核苷酸，两端分别标上一个个核苷酸，两端分别标上一个荧荧光基团和淬灭基团光基团和淬灭基团。 分子分子Beacons的茎环结构中，的茎环结构中，环环的部分用于的部分用于与靶序列杂交与靶序列杂交（与目标序列互补），通常（与目标序列互补），通常由由1530个核苷酸组成，要求个核苷酸组成，要求与靶序列杂与靶序列杂交后交后能形成能形成与探针靶序列与探针靶序列双螺旋双螺旋有关的有关的反式构型反式构型，并，并使干的部分打开使干的部分打开，尽量得使，尽量得使荧光基团和淬灭基团分开荧光基团和淬灭基团分开足够的距离足够的距离。 一般一般茎茎（干干的部分）一般的部分）一般5-8个核
21、苷酸长个核苷酸长（碱基对），并（碱基对），并相互配对相互配对形成茎的结构。形成茎的结构。荧光基团荧光基团连接在连接在茎臂的一端茎臂的一端，一般连在，一般连在5端端；而而淬灭基团淬灭基团一般连在一般连在3端端。 通常用通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为）作为淬灭基团淬灭基团。 分子分子Beacons必须非常仔细的设计，以致于必须非常仔细的设计，以致于在在复性温度复性温度下：下： 模板不存在模板不存在时形成时形成茎环结构茎环结构； 模板存在模板存在时则时则与模板配对与模板配对。自由状态自由状态时，分子信标呈时，分子信标呈发夹型结构发夹型结构，荧
22、光，荧光基团和淬灭基团靠得基团和淬灭基团靠得很近很近，二者之间发生，二者之间发生能能量转移量转移（FRET和和直接能量转移直接能量转移），荧光基团），荧光基团的能量被淬灭基团吸收并以的能量被淬灭基团吸收并以热热的形式散发，的形式散发，荧光几乎完全荧光几乎完全被猝灭被猝灭。 当有当有靶序列存在靶序列存在的时候，靶序列和分子信的时候，靶序列和分子信标的探针序列杂交形成有一定刚性的标的探针序列杂交形成有一定刚性的双螺双螺旋结构旋结构，导致分子信标的，导致分子信标的构象改变构象改变，干干的的部分打开，荧光基团与猝灭基团部分打开，荧光基团与猝灭基团分开分开，二，二者之间的能量转移终止；者之间的能量转移终
23、止； 在有在有相应的单色光激活相应的单色光激活时，荧光基团发出时，荧光基团发出荧光。荧光强度与溶液中荧光。荧光强度与溶液中靶序列的多少靶序列的多少成成正比，通过检测正比，通过检测荧光的强度荧光的强度就可以计算出就可以计算出靶序列的量。靶序列的量。 Beacons与模板配对与模板配对后：后：分子分子Beacons的构的构象改变象改变使得使得荧光基团与淬灭剂分开荧光基团与淬灭剂分开；当荧；当荧光基团被激发时，它发出光基团被激发时，它发出自身波长自身波长的的光子光子。分子分子Beacons不同于不同于SYBR Green的一个的一个优点就是它优点就是它特异性地检测感兴趣特异性地检测感兴趣的的目标目标
24、DNA。 通过通过精心设计分子精心设计分子Beacons和和优化反应优化反应条件条件（温度和缓冲液）后，其灵敏度非（温度和缓冲液）后，其灵敏度非常高，可用于常高，可用于单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNPs）的检测。的检测。 但是，为检测某一特定的目标但是，为检测某一特定的目标DNA，每每一个探针都必须一个探针都必须单独仔细地设计单独仔细地设计。 分子分子Beacons是美国纽约公共健康研究是美国纽约公共健康研究学会的技术专利。学会的技术专利。Molecular Beacons 的应用范围及优缺点的应用范围及优缺点 定量起始模板浓度定量起始模板浓度 基因型分析基因型分析 鉴定产物鉴定产物 单核
25、苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNP）检测检测v 对目标序列有对目标序列有很高的特异性很高的特异性，用于，用于SNP检测的最检测的最灵敏的试剂之一灵敏的试剂之一v 荧光背景荧光背景低低v 设计设计困难困难v 无终点分析功能无终点分析功能v 只能用于只能用于一个特定的目标一个特定的目标v 价格较价格较高高9. TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理水解型杂交探针）的工作原理 目标特异性探针目标特异性探针 5为荧光素，为荧光素，3为淬灭剂为淬灭剂 模板和探针杂交模板和探针杂交 延伸延伸: 聚合反应，聚合反应，Taq酶切下酶切下5端荧光端荧光 素素出现荧光出现荧光TaqMan ( (水解型杂交探针水
26、解型杂交探针) )的的应用范围及优缺点应用范围及优缺点 定量起始模板浓度定量起始模板浓度 基因型分析基因型分析 产物鉴定产物鉴定 SNP分析分析v 对目标序列有对目标序列有很高的特异性很高的特异性,特别适合于特别适合于SNP检测检测v 与与 Molecular Beacons 相比，相比，设计相对简单设计相对简单v 价格较价格较高高v 只适合于一个只适合于一个特定的目标特定的目标v 不能不能进行融解曲线分析进行融解曲线分析Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction for the Core Facility Using TaqMan and
27、 the Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division 7700 Sequence Detector Deborah S. Grove Nucleic Acid Facility, Life Science Consortium, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802 Proben A probe (ie, TaqMan) is designed to anneal to the target sequence between the traditional forward
28、and reverse primers. n The probe is labeled at the 5 end with a reporter fluorochrome (usually 6-carboxyfluorescein 6-FAM，6-羧基荧光素羧基荧光素) and a quencher fluorochrome (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine TAMRA, 6-羧基羧基-四四甲基甲基-若丹明若丹明) added at any T position or at the 3 end. n The probe is designed to have a
29、 higher Tm than the primers, and during the extension phase, the probe must be 100% hybridized for success of the assay. Principlen As long as both fluorochromes are on the probe, the quencher molecule stops all fluorescence by the reporter. n However, as Taq polymerase extends the primer, the intri
30、nsic（内在的，固有的）（内在的，固有的） 5 to 3 nuclease activity of Taq degrades the probe, releasing the reporter fluorochrome. n The amount of fluorescence released during the amplification cycle is proportional to the amount of product generated in each cycle. Fluorogenic 5 nuclease chemistry. (1) Forward and rev
31、erse primers are extended with Taq polymerase as in a traditional PCR reaction. A probe with two fluorescent dyes attached anneals to the gene sequence between the two primers. (2) As the polymerase extends the primer, the probe is displaced. (3) An inherent nuclease activity in the polymerase cleav
32、es the reporter dye from the probe. (4) After release of the reporter dye from the quencher, a fluorescent signal is generated. n The sensitivity of detection allows acquisition of data when PCR amplification is still in the exponential phase.n This is determined by identifying the cycle number at w
33、hich the reporter dye emission intensities rises above background noise; this cycle number is called the threshold cycle (Ct). n The Ct is determined at the most exponential phase of the reaction and is more reliable. n The Ct is inversely proportional to the copy number of the target template; the
34、higher the template concentration, the lower the threshold cycle measured. One of the views available after completion of the run is an amplification window. This window shows the amount of fluorescence obtained in each amplification cycle for each reaction. The threshold cycle (Ct) is shown by the
35、darker horizontal line. Advantage Provides an accurate method for determination of levels of specific DNA and RNA sequences in tissue samples. Based on detection of a fluorescent signal produced proportionally during amplification of a PCR product. Turn-around time for data acquisition and analysis
36、is short, Results are more reliable than by traditional PCR methods. Sybr greenI detection is less expensive and no sequence specific probe is required. Users will also need to purchase flat-top, optical caps or 0.2 mm thermal microseal film for their plates. All other plates and caps will not work
37、with the new machines. ApplicationsThe applications for quantitative real-time PCR are innumerable（数不清的）（数不清的）. Detection of genomic or viral DNA in tissues can be a valuable diagnostic tool. Gene expression can be measured after extraction of total RNA and preparation of cDNA by a reverse transcrip
38、tion (RT) step. Setup and analysis are simple and can more easily be extended to the clinical environment than traditional PCR techniques. An allelic discrimination assay that can detect single-base nucleotide mutations and polymorphisms. Allelic(等位基因的等位基因的) discrimination assayuThese assays require
39、 two separate probes that differ only by one base mismatch. uOne probe labeled with 6-FAM (6-6-羧基荧光羧基荧光素素)represents one allele（等位基因）（等位基因）, and the other probe labeled with the fluorochrome VIC represents the other allele. uA mismatch leads to a less efficient amplification. Fluorescence spectra ar
40、e collected after the run, and using multicomponent analysis, the software extracts the contribution of each component dye to the observed spectrum. uHomozygotes for FAM show an increase in the FAM signal but no increase in the VIC signal, and homozygotes for the VIC probe show an increase in that s
41、ignal. Heterozygotes（杂合子）（杂合子） show intermediate increases of FAM and VIC signals. uAll three groups are clearly distinguishable, and the sensitivity is similar to that for the quantitative PCR application 10. 10. 多色多通道技术应用多色多通道技术应用 基因表达分析基因表达分析PRIMER AND PROBE DESIGN Primers and probes must be care
42、fully designed because of the costs associated with producing probes with different dyes at 5 and 3 ends. n PE/ABD Primer Express software, which is specifically designed to select the primers and probes. The required parameters for well-designed primers and probe have been well built into the progr
43、am. n These parameters include a Tm for the probe that is 10C higher than the primers, primer Tm is between 58C and 60C, amplicon size between 50 and 150 bases, absence of 5 Gs. nPrimer and probe design is different for the allelic discrimination assays. The probes designed for each allele should be
44、 centered over the mismatched base, and the probes only have to differ by that base. nAnother major difference is that the probe for these assays has a lower Tm requirement than the TaqMan PCR assays. Prescreening assaySYBR Green can be used as a probeless alternative to the TaqMan system. Because i
45、t binds to all double-stranded DNA, it is imperative to ensure that the PCR product being quantified is a clean, single product, because any primer-dimers or background smears are detected. It can be used as a prescreening assay before ordering a probe. If the results are satisfactory, the probe can
46、 be ordered and TaqMan reactions run with higher specificity. 11. 内标技术介绍内标技术介绍 三、三、 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的技术的应用介绍应用介绍荧光定量荧光定量PCR技术的应用技术的应用对对DNA、RNA样品进行定量和定性分析样品进行定量和定性分析定量分析包括定量分析包括绝对定量绝对定量分析和分析和相对定量相对定量分析。分析。前者可以得到前者可以得到某个样本中基因的某个样本中基因的拷贝数拷贝数和和浓浓度；度；后者可以对后者可以对不同方式处理的两个样本不同方式处理的两个样本中的中的基基因表达水平因表达水平进行进行比
47、较比较。可以可以不定期不定期对对PCR产物或样品进行产物或样品进行定性分析定性分析如：如：利用利用熔解曲线熔解曲线分析识别分析识别扩增产物扩增产物和和引物二聚引物二聚体体，以，以区分非特异扩增区分非特异扩增；利用利用特异性探针特异性探针进行进行基因型分析基因型分析及及SNP检测检测等。等。 目前实时荧光目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用技术已经被广泛应用于于基础科学研究基础科学研究、临床诊断临床诊断、疾病研究疾病研究及及药物研发药物研发等领域。其中最主要的应用等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：集中在以下几个方面： 比较经过比较经过不同处理样本不同处理样本之间之间特定基因特定基因的的
48、表达差异（如表达差异（如药物处理药物处理、物理处理物理处理、化化学处理学处理等），及等），及特定基因特定基因在在不同相不同相的表的表达差异；达差异； 比较比较正常组织正常组织与与病理组织病理组织中各种中各种mRNA 表达量差异；表达量差异； 验证验证基因芯片基因芯片实验结果；实验结果； 验证验证RNA干扰干扰实验结果。实验结果。四、荧光定量四、荧光定量PCR PCR 实验室实验室所需仪器设备清单所需仪器设备清单u专用工作服和工作鞋u专用办公用品u 一次性手套、一次性吸水纸u 微量加样器一套（覆盖11000ul） 以上物品各一套以上物品各一套。u 28和-20或-80冰箱u 混匀器u 耐高压处理
49、的离心管和加样器吸头(带滤心）u 高速台式冷冻离心机五、实时定量五、实时定量PCR PCR 及应用于及应用于植物分子生物学的研究植物分子生物学的研究 Microarray 最强大的功能是最强大的功能是平行分析平行分析，在单次实，在单次实验中同时观察验中同时观察上万种上万种RNA的相对量变，也因为的相对量变，也因为平行平行处理处理之故，无法对每一个之故，无法对每一个probe 做做最佳化、标准化最佳化、标准化，所以目前大部份结果都会再以所以目前大部份结果都会再以 Northern blot or Real-time quantitative PCR再做再做确认确认。 虽然虽然 Northern
50、blot 在过去曾扮演十分称职的角色在过去曾扮演十分称职的角色，但有，但有時時microarray 筛选出筛选出來來的基因的基因常有常有上千个谱上千个谱，以，以传统方法传统方法来验证，仍是来验证，仍是耗费人力物力耗费人力物力的苦差事。的苦差事。 Real-time quantitative PCR 在近年来迅速普及，在近年来迅速普及，原因在其原因在其高灵敏度高灵敏度、快速快速及及精确精确，样品需求量少样品需求量少也是也是很重要的优势，是很重要的优势，是最适合承接最适合承接microarray 验证的工验证的工具具。 Laser Captured Microdissection (LCM) Re
51、al Time Quantitative PCR ： 量化组织中量化组织中特定基因特定基因之表之表 现现 共聚焦显微影像系统共聚焦显微影像系统 (Confocal Imaging System) 流速细胞筛选分析系统流速细胞筛选分析系统 (Flow Cytometry) 以上技术就以上技术就基因表现基因表现之之各个面相各个面相作系统探作系统探讨。讨。 实验程序实验程序（举例）（举例）RNA的定量的定量：RNA的测量仪上，以的测量仪上，以Nono Drop软软件进行件进行RNA的定量的定量(ng/l)。如浓度过高必须如浓度过高必须稀释稀释后后再定量，以便定量尽可能地准确。同时，可从再定量，以便定
52、量尽可能地准确。同时，可从260/280的比值看出的比值看出RNA的纯度的纯度(一般在一般在1.9-2.1之间之间)是否在要求的范围内。是否在要求的范围内。RNA的反转录的反转录及及cDNA模板的稀释模板的稀释：用作：用作RNA反反转录的转录的RNA量，在盐芥和拟南芥两种材料、各量，在盐芥和拟南芥两种材料、各200mM NaCl处理处理2小时及对照的小时及对照的4种种RNA之间必须之间必须完全准确一致完全准确一致，即，即Ara200、Ara0、Th200、Th0的的RNA量均为量均为2000ng。以下的反转录体系中以下的反转录体系中RNA 和和 RNase-free H2O的的总体积为总体积为
53、8.5 l 。RNA + RNase-free H2O：8.5 l(2000ng RNA)Oligo-dT18(500ng/l)： 0.5 ldNTP(2.5mM/each)： 4 l计计 ： 13 l 该体系于该体系于 65-70，5 min；置于冰上冷却后，置于冰上冷却后，加下面反应体系加下面反应体系：5 RT Buffer： 4 l0.1 M DTT： 2 lSuperScript III RT： 1 l总计：总计： 20 l 混匀，混匀，50 保持保持6小时或过夜，即得到小时或过夜，即得到20l cDNA；该该cDNA稀释稀释20倍倍，即为，即为400l稀释的稀释的cDNA，此用于实时
54、定量此用于实时定量PCR作为反应模板。作为反应模板。 uDTT即即Dithiothreitol，中文名为二硫苏，中文名为二硫苏糖醇。分子式为糖醇。分子式为C4H10O2S2。 是一种常是一种常用用d的小分子的小分子有机还原剂有机还原剂，有，有抗氧化抗氧化作用。作用。 二硫苏糖醇的名字衍生自二硫苏糖醇的名字衍生自苏糖苏糖（一种四（一种四碳碳单糖单糖）。）。 DTT的的异构体异构体为为Dithioerythritol（DTE），），即即DTT的氧化结构。的氧化结构。 实时定量实时定量PCR (Real-time PCR) SYBR Green PCR Master Mix：12.5 l稀释的稀释的
55、 cDNA模板：模板： 2 lPrimer-F： 1lPrimer-R： 1l总计：总计： 25 l 2-CT方法与相对基因表达差异的分析方法与相对基因表达差异的分析使用内标基因的目的是为了使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应对加入到反转录反应中的中的RNA进行均一化处理进行均一化处理，标准的看家基因标准的看家基因一般一般都可被用作内标基因。都可被用作内标基因。 适合于实时适合于实时PCR反应的反应的内标基因内标基因包括包括GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase） ，-actin(细胞骨架蛋白细胞骨架蛋白beta-actin或或bet
56、a-tubulin )、2-microglobulin(微球蛋白微球蛋白 )以及以及rRNA；当然，其当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。它的看家基因也同样能被用作内标。 我们在我们在应用某一基因作为内标之前应用某一基因作为内标之前首先确证首先确证该基该基因的表达因的表达不会受实验处理的影响不会受实验处理的影响。 相对定量的方法分析基因表达差异相对定量的方法分析基因表达差异 (i) 选择一个选择一个内标基因内标基因； (ii)确定内标的确定内标的有效性有效性，确保它，确保它不会受到实验不会受到实验 处理的影响处理的影响； (iii)通过通过PCR扩增扩增目标基因目标基因和和内标基因内标基因
57、RNA或或 cDNA的的一系列梯度稀释模板一系列梯度稀释模板，确保它们的，确保它们的 扩增效率相同扩增效率相同。 (iv)最后通过最后通过2-CT计算将计算将统计数据统计数据转化成转化成线线 性形式性形式而不是原始而不是原始CT值。值。 CT表示表示目标基因目标基因和和内标基因内标基因CT值的差异值的差异; 2-CT方法方法是实时定量是实时定量PCR实验中实验中分析基因表分析基因表 达相对变化的一种简便方法达相对变化的一种简便方法。uGiovanna(2002)提出提出“相对相对CT”或或“- CT”的方法，这个方法的优点是的方法，这个方法的优点是不需要为不需要为每次实验制作标准曲线每次实验制
58、作标准曲线，只需要一个优化，只需要一个优化步骤证明步骤证明外源基因外源基因与与内源基因内源基因有有相同的相同的、至少是至少是相似的反应效率相似的反应效率即可。即可。u比较比较CT方法的优点是方法的优点是无需标准曲线无需标准曲线、适合多个样品适合多个样品，当然它也，当然它也消除了消除了创造标准创造标准曲线时曲线时任何稀释错误的不利影响任何稀释错误的不利影响。 u相比于相比于标准子标准子(normalizer)，比较比较CT 法法(CT)在对模板进行相对定量、监测基因在对模板进行相对定量、监测基因的表达水平时，的表达水平时，不需标准曲线不需标准曲线并并增加了样增加了样品的通量品的通量；为了使这个方
59、法成功应用，为了使这个方法成功应用，目标序列目标序列和和内内参序列参序列的的扩增效率必须相等扩增效率必须相等。 只要只要靶基因靶基因和和标准者标准者具有具有相似的动力学范相似的动力学范围围，比较，比较CT(CT)方法就是方法就是最具有实际最具有实际应用价值的方法应用价值的方法。 2-CT方法中方法中参照因子参照因子的选择决定于的选择决定于基因基因表达定量实验的类型表达定量实验的类型；本实验中本实验中参照因子参照因子是是未经未经NaCl处理的对处理的对照样品照样品；内标基因内标基因为为标准的标准的看家基因看家基因Actin。 根据实验获得的经验值，使用公式：根据实验获得的经验值，使用公式： 1.
60、9-CT进行统计分析。进行统计分析。 每个基因在两种处理情况下的表达水平均每个基因在两种处理情况下的表达水平均来自来自3次次实时定量实时定量PCR的的平均值。平均值。Ct-ActinCt (control) Ct-ActinCt (200mMNaCl 处理处理) delta Ct Fold difference Ave Fold Change StDevThe Pyruvate decarboxylase1 Gene of Arabidopsis Is Required during Anoxia (缺氧缺氧症症）But Not Other Environmental StressesOliver K
