胶粘剂水凝胶作为组织胶粘剂、手术密封剂和止血剂具有巨大的应用潜力。然而，开发能够在潮湿、动态的生物组织上快速和可控发挥作用的水凝胶一直是一个巨大的挑战。受多酚化学的启发，清华大学孙伟教授与郑州大学郭钟伟副研究员等引入了一种凝聚触发的塑造策略，使重组人胶原蛋白（RHC）和单宁酸（TA）能够进行分层组装。RHC和TA聚集体的构象伴随着机械和粘附性能的显著增强从颗粒状状态演化为网状状态。凝聚和组装过程是由分子间的相互作用驱动的，特别是RHC和TA之间的氢键。由于多酚化学的多方面性，分层组装的水凝胶具有作为手术密封材料的优良性能，包括快速凝胶时间（10s内）、凝血时间（60s内）、超拉伸性（应变>10 000%）和坚韧的附着力（粘附强度>250 kPa）。体内实验表明，在7天的随访过程中，在原位形成的水凝胶的帮助下，完全封闭了严重泄漏的心脏和肝组织。这项工作提出了一种非常有前途的水凝胶基手术密封胶在湿和动态生物环境，为未来的生物医学应用。
相关研究成果以“Coacervation-triggered hierarchically assembled hydrogels withapplication as surgical sealant”为题于2023年6月15日发表在《Biofabrication》上。
图1 基于RHC和TA制备快速交联、高粘附、超拉伸、止血水凝胶的设计策略
将RHC和TA组装成凝聚聚集体，首次通过分子动力学模拟和实验方法进行了验证。在大分子水平上，控制了RHC和TA聚集体的构象，从颗粒态演化为有序的网状态。同时，这些聚集体被塑造成不同的层次结构，它们表现出作为潜在的手术密封剂的优良性能（图1）。
图2 基于分子动力学模拟的RHC与TA之间的潜在相互作用
首先利用分子动力学模拟来证明RHC和TA可能通过物理相互作用形成组装复合体的假设（图2）。在序列构建后，生成RHC和TA的三维结构，并通过GROMACS进行优化（图2a）。混合后，RHC和TA分子在整个20 ns过程中紧密结合而没有分离，表明它们之间有很强的相互作用（图2b）。在RHC蛋白上，TA分子与带有羟基或氨基的极性氨基酸之间形成了氢键（黄色虚线）（图2c）。范德华力和静电势能的负值表明，RHC和TA的吸引和附着在能量上是有利的（2d）。此外，RMSD曲线在20 ns内达到平台状态，说明蛋白质结构以不可逆的方式发生了变化和稳定（图2f）。
图3 不同成分的RHC与TA之间的凝聚相互作用
RHC和TA的溶液在混合步骤前是透明的（图3a）。RHC在混合步骤前表现出松散的颗粒结构，化合物TA掺入RHC中形成致密的块状结构（图3b）。在加入RHC后，在280 nm处的特征吸收峰明显可见，并保持不变，说明苯酚基没有被氧化（图3c）。不同组成的混合物的FTIR光谱如图3d所示，随着TA的掺入，吸收峰明显降低，这可能与RHC与TA之间的氢键作用有关。
图4 RHC-TA水凝胶的合成及表征
加入TA溶液后，透明的RHC溶液迅速转化为微黄色的水凝胶（图4a）。通过改变RHC和TA的浓度，进行了一系列的液-凝胶相变实验。从液体（灰色区域）、颗粒状聚集（绿色区域）到网状聚集（松散、黄色区域）和网状聚集（密集、红色区域），最多有四个组装阶段（图4b、c）。利用荧光显微镜描述了通过过渡阶段的形态变化，颗粒状聚集体呈随机分散的块状角结构（图4d）。
图5 RHC-TA水凝胶的特性
随着大量的RHC和TA的同时出现，大量的内部自组装纤维可以形成致密的网状聚集体，这些物理变化被振荡频率扫描所证实（图5a）。为了直接可视化“液-固体”粘弹性特性，一块球形RHC-TA水凝胶被成功地依次安装到一个人形模具和树状模具中（图5b），这些水凝胶还可以被揉捏成各种形状，包括立方体、长方体、三角形、矩形和蛇。
图6 RHC-TA水凝胶的力学表征
得益于动态和可逆的交联网络，RHC-TA水凝胶表现出了优异的机械性能（图6）。比如超可拉伸性能（图6a）。由于高加工性和灵活性，拉伸的灯丝可以像普通线一样绕着收集杆旋转，成功制作了500、300和150µm不同直径的直线细丝（图6b）。当拉伸水凝胶时，RHC和TA之间的动态和可逆的物理相互作用通过解压缩分层纤维结构的交联点，提供了一个有效的能量耗散函数（图6c）。通过拉伸和压缩试验得到的应力-应变曲线如图6d、e所示。RHC-TA水凝胶的这些特性在伤口密封和组织粘附方面具有良好的潜力。
图7 RHC-TA水凝胶的粘附性和凝血性能
海贻贝利用它们的体型在动态水下环境中实现了强大的附着力（图7a）。本研究模拟贻贝的化学成分和层次结构，通过引入RHC和TA，合成了具有优越湿粘附能力的原位凝胶体系（图7b）。除合成材料外，RHC-TA水凝胶与天然材料也表现出良好的粘附性能。如图7c所示，RHC-TA水凝胶与人体皮肤附着牢固，可以承受较大的伸长。为了定量测量水凝胶的粘附强度，通过使用新鲜的猪皮肤作为典型的粘附物进行了搭接剪切试验（图7d）。将RHC的浓度从5%、10%和15%增加到20%（w/v），粘附强度分别从28.5 kPa、106.1 kPa、150.6 kPa增加到242.3 kPa（图7e、f）。通过监测全血凝血时间，评价RHC-TA水凝胶的体外止血能力（图7g)。在对照组中观察到类似的凝血时间（5.4 ± 0.4 min），RHC-TA水凝胶的存在显著减少了凝血时间（图7h）。RHC-TA水凝胶具有优越的粘附和止血能力，在临床应用中成为一种很有前途的手术密封胶。
图8 TA介导的粘聚和粘附相互作用的反应化学示意图
RHC和TA聚集体的构象从颗粒状状态演化到网状状态，并伴随着内聚力和粘附性能的显著增强，更高的RHC浓度导致分层组装的网状结构，具有显著的粘附性和粘附强度（图8）。
图9 RHC-TA水凝胶在动态、水下环境下的粘附性能
为了测试RHC-TA水凝胶是否符合该标准，本实验采用了粘附强度最强的优化的RHCTA水凝胶配方（RHC：20% w/v，TA：40% w/v）。如图9a所示，RHC-TA水凝胶在水下环境中对心脏、肝、肺肌、骨、皮肤等不同的生物组织均表现出紧密的粘附能力。扫描EM图像显示RHC-TA水凝胶与组织之间的粘附界面紧密连接（图9b）。
图10 RHC-TA水凝胶的生物相容性
利用成纤维细胞（MRC- 5细胞）在体外评估RHC-TA水凝胶的生物相容性，如图10a所示，成纤维细胞逐渐扩散，表现出不规则的、延伸的丝状伪足，表明水凝胶支持细胞的粘附和扩散行为。通过图10b所示的F-actin/DAPI染色图像进一步证实了细胞的粘附，在培养7天后观察到明显的细胞骨架和细胞连接。活/死试验表明，整个培养期间的细胞活力均高于82%（图10c）。使用CCK-8检测细胞的增殖能力，如图10d所示成纤维细胞在整个培养期间都保持了较高的增殖率。这些结果表明，RHC-TA水凝胶具有最小的细胞毒性，可以支持细胞的附着和增殖。
图11 粘合剂RHC-TA水凝胶作为大鼠心脏出血模型的体内评价
在大鼠心脏出血模型中使用RHC-TA水凝胶作为手术密封剂进行测试（图11）。将RHC和TA溶液在心脏出血部位进行原地混合和凝胶，以防止致命的血液渗漏（图11a、b）。H&E染色显示，移植后7天，水凝胶与心脏组织表面粘附紧密，证实了其强而稳定的密封效果（图11c、d）。体外粘附试验表明，RHC-TA水凝胶在心脏组织上具有良好的粘附强度（69.2 ± 5.5 kPa）（图11e）。对早期介入后生存数据的log rank分析显示，RHC-TA水凝胶治疗组与对照组相比有显著改善，表明水凝胶具有停止致命出血和维持正常生理功能的潜力（图11f）。第3天和第7天的免疫染色显示，仅在第3天的时间点才有少量的局部淋巴细胞浸润（CD3）和巨噬细胞（CD68），但在第7天消失（图11g）。
图12 粘合剂RHC-TA水凝胶作为手术密封胶在大鼠肝出血模型中的体内评价
在肝出血部位应用RHC-TA水凝胶后，该水凝胶在20秒内覆盖并与肝损伤部位紧密结合（图12b）。H&E染色结果显示，水凝胶与肝组织表面紧密结合，具有较强的密封效果（图12c、d）。水凝胶的治疗显著提高了致死性出血模型的存活率（图12f)。在大鼠肝出血模型中第3天和第7天的免疫染色显示，仅在第3天的时间点才有少量的局部淋巴细胞浸润（CD3）和巨噬细胞（CD68），但在第7天消失（图12g)。以上结果表明，植入的RHC-TA水凝胶引起宿主的炎症反应最小。
在这项工作中，模拟了天然材料的凝聚过程和分层组装结构，通过引入RHC和TA，首次开发了一种非常有前途的水凝胶基手术密封胶。RHC和TA侧链之间的氢键参与了凝聚过程。通过调节其浓度，RHC和TA聚集体的构象从颗粒状聚集体演变为网状聚集体（松散）和网状聚集体（致密），伴随着机械和粘附性能的显著增强。由此得到的结构水凝胶显示出几个关键特征，满足潜在的手术密封胶的条件：(1)易于加工和操作，(2)快速的凝胶和止血能力，(3)强大的机械和坚韧的粘附性能，(4)超拉伸和自愈合能力，(5)良好的生物相容性。由于上述特性，水凝胶成功地应用于原位切口部位，并迅速凝聚，以在潮湿和动态的生物环境中实现强大的粘附。此外，RHC和TA本身都具有良好的生物相容性，在其凝聚过程中不需要额外的引发剂或交联剂。本研究提出了一种很有前途的手术密封胶，可广泛应用于手术用湿内组织的粘胶，为水凝胶结构设计提供了科学和应用基础，以促进高性能生物材料的先进制造。
文章来源：
DOI 10.1088/1758-5090/acdc55
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