1.2.1 主要试剂:
限制性内切酶购自Thermo公司；PCR体系试剂购自TaKaRa公司；Rib蛋白抗血清由中国科学院遗传与发育研究所完成；HRP标记的羊抗鼠购自Biosharp公司；蛋白预染Marker、BCA试剂盒、ECL试剂盒购自Thermo公司；DNA marker购自Life Science公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；生化试剂为Sigma或Biosharp公司产品，其他为国产分析纯。
缓冲液配方：PBS缓冲液(g/L)：磷酸二氢钾0.2，磷酸氢二钠2.9，氯化钠8.0，氯化钾0.2；TEP缓冲液：10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，1% PMSF，pH 8.0；原生质体缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2，26%棉籽糖，1 mmol/L PMSF，pH 8.0。
1.2.2 主要仪器:
PCR仪T100、蛋白电泳仪、蛋白转膜系统、蛋白纯化系统NGC，美国Bio-Rad公司；核酸电泳仪DYY-6C，北京市六一仪器厂；紫外可见光光度计UV-1800PC，上海美普达仪器有限公司；摇床TS-200B，上海天呈实验仪器制造有限公司。
1.3.1 表达载体的构建:
以罗伊氏乳杆菌ATCC 55730基因组DNA为模板，使用Vector NTI软件对Rib蛋白非重复区(N末端)基因序列设计引物并进行PCR扩增，引物为F (5′-GGAATTCCATATGAGAGGAATGAATAAGGAA-3′，下划线表示的是NdeⅠ酶切位点)，R (5′-CCGCTCGAGTTTATCAGC ATCAAGTTCTG-3′，下划线表示的是XhoⅠ酶切位点)。PCR反应体系(50 μL)：dNTP mix 4 μL，10×buffer 5 μL，Taq酶0.25 μL，引物F (5 μmol/L) 2.5 μL，引物R (5 μmol/L) 2.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O补充至50 μL。PCR反应条件：95；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。
将NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后的pET27b质粒和PCR产物纯化回收，连接过夜。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，筛选出具有卡那霉素抗性并PCR验证为阳性的克隆。对阳性克隆的质粒进行酶切和测序验证，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。将验证正确的菌株命名为BL21(DE3)/L2。
1.3.2 Rib蛋白诱导表达的初步优化与蛋白纯化:
接种BL21(DE3)/L2单菌落于5 mL LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min振荡培养过夜，1:100稀释到新的LB培养基中，相同条件培养至对数期进行目标蛋白的诱导表达。实验中对不同IPTG终浓度(0.02、0.05、0.10、0.40、1.00 mmol/L)在诱导温度25、37℃进行优化，诱导时间为12 h，摇床转速为120 r/min。通过SDS-PAGE对表达产物进行分析评价，诱导条件重复3次。Rib蛋白的纯化使用Bio-Rad NGCTM Scout 10 Plus系统，使用Histrap HP层析柱(GE)采用线性洗脱方式进行亲和层析；使用HiLoad Superdex 16/600 75pg预装柱(GE)进行凝胶过滤；使用超滤管进行超滤浓缩得到纯化的蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳分析达到单一蛋白条带，经BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
1.3.3 多克隆抗体的制备:
多克隆抗体制备参照Harlow E和Lane D的方法[]，由中国科学院遗传与发育研究所实验动物中心协助完成。利用ELISA方法[]对抗体效价进行测定，测定结果为1:2 000。
1.3.4 Rib蛋白亚细胞定位:
根据文献[]报道的方法对罗伊氏乳杆菌ATCC55730菌液进行处理，以分别获得细菌细胞壁、细胞质和上清液组分。具体如下：5 mL菌液培养至对数期，5 000 r/min离心5 min，分别取上清液和菌体。对于上清液，加入2倍体积无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。13 000 r/min离心10 min后，70%乙醇洗涤一次，ddH2O溶解沉淀。对于菌体，PBS缓冲液洗涤一次，再用TEP缓冲液洗涤两次，然后用100 μL原生质体缓冲液重悬菌体，加入60 U溶菌酶，37 ℃保温30 min。13 000 r/min离心10 min后取上清液作为细胞壁组分。沉淀用100 μL原生质体缓冲液重悬作为细胞质组分。对不同组分的蛋白经过SDS-PAGE电泳后通过免疫印迹(Western blot)确定Rib蛋白在不同细胞组分中的分布。
1.3.5 Western blot:
为检测Rib蛋白在乳杆菌中的分布情况，选取11株不同乳杆菌进行免疫印迹。以罗伊氏乳杆菌ATCC55730为阳性对照进行SDS-PAGE以及免疫印迹。接种乳酸菌单菌落于5 ml MRS液体培养基中，37 ℃、5% CO2静置培养过夜。用新鲜MRS培养基调节细菌浓度使其一致后，取1 ml培养液于5 000 r/min离心5 min收集菌体，PBS洗涤一次，80 μL TEP缓冲液重悬，加入60 U溶菌酶，37 ℃保温30 min。加入20 μL 5×Loading buffer，煮沸10 min，离心取上清进行SDS-PAGE以及免疫印迹检测与Rib抗体特异性作用的蛋白。
