人类同众病之王——癌症的斗争经历了自然疗法、手术治疗、放疗、化疗、靶向疗法及联合疗法等漫长的时期，在科技爆发的当下，恶性肿瘤的免疫疗法因其更好的预后及更低的副作用而愈加备受关注。
图1. 主要的抗肿瘤治疗策略及其特点
在各种肿瘤的免疫治疗的方式中，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors）是近几年获得突出疗效的药物。在机体同恶性肿瘤细胞的战场上，T细胞是最核心的战士，为了避免战斗中“伤及无辜”，T细胞除了接收抗原递呈细胞的第一信号，必须接收到协同刺激分子提供的激活或抑制的第二信号，这样才能启动T细胞的“攻击”或“豁免”机制，这些信号即为免疫检查点。而道高一尺，魔高一丈，狡猾的肿瘤细胞会表达抑制免疫细胞功能的蛋白，这些蛋白使得T细胞的攻击受到抑制甚至助纣为虐。
细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和程序细胞死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1）是当下研究比较透彻的免疫检查点分子，在过去的5年中已有该类免疫检查点抑制剂上市，目前针对该通路的新药研发的竞争已经非常激烈，预测免疫检查点抑制剂市场在未来十年具有巨大的增长空间，这也将带给全球恶性肿瘤患者新的治疗曙光。
图2. PD-1及CTLA-4免疫检查点抑制剂示意图。图片来源：http://www.lymphomation.org/-news-immune-therapy.htm
筛选有效的免疫检查点抑制剂是新药研发的过程上游极为重要的环节，而选择可以有效检测单克隆抗体类抑制剂或小分子抑制剂对抗原/抗体结合的抑制效果的筛选方案则是重中之重。其中高效的检测技术和高性能的检测设备缺一不可。接下来我们以将介绍使用Cisbio的HTRF技术联合BioTek的高通量靶点及表型筛选平台进行免疫检查点抑制剂的筛选方案。
HTRF技术
HTRF是Cisbio公司专利技术，该技术结合了荧光共振能量转移（FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF，Time ResolvedFluorescence)）两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体（Donor），是基于Eu穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移（FRET）。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同于供体的发射荧光的寿命。因为Eu 的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨检测就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
图3. HTRF技术图解（点击可放大查看）。
PD-1和PD-L1小分子抑制剂筛选
通过设计特异性识别纯化的带有His/GST等Tag的PD-1蛋白的抗体1（该抗体偶联时间分辨荧光染料Eu）, 以及特异性识别带有另一种Tag的PD-L1蛋白的抗体2(该抗体偶联HTRF信号的受体荧光分子XL665），这种双抗体系能够有效检测体系中PD-1和PD-L1分子的结合，当加入的小分子能够抑制PD-1和PD-L1的结合时，由于双蛋白HTRF信号显著降低，如图4所示。
图4. HTRF检测PD-1及PD-L1的小分子抑制剂。当不存在小分子抑制剂时，PD-1同PD-L1结合，使用330nm激发光激发带有Eu，能够检测到带有XL665的发射光665nm信号值，如果存在小分子抑制剂，FRET信号消失，仅能检测到Eu的620nm的发射光信号。因此通过检测系统的EX330nm和EM620nm/665nm的检测结果评估小分子抑制剂作用效果。
图5，Robust Assay for small moleculars.
PD-1和PD-L1抗体抑制剂筛选
筛选能够抑制PD-1和PD-L1结合的抗体类生物制剂时，使用SNAP技术将Eu共价结合在纯化的PD-L1蛋白上，PD1蛋白上带有His/GST等特定Tag，使用带有XL665标记的抗体识别PD1蛋白。当PD1和PD-L1结合时，可检测到HTRF信号，此体系可用于评估和筛选 抗体类抑制剂。
图6. HTRF检测PD-1及PD-L1的抗体类抑制剂。
图7，Assay Validated for Therapeutic Antibodies
HTRF技术为均相实验，因此参与反应的试剂或化合物无需经过吸除处理，并且反应体系内的各成分互不影响。因此具有 荧光持续时间更久、低背景、均相检测以及能抵御金属离子对信号影响等影响，均相检测意味着可以通过“一步法”实现样品信号的测定，无需反复的洗涤步骤，更加适合高通量药物筛选。
图8，HTRF测定小分子免疫检查点抑制剂的操作步骤。
因此HTRF也广泛应用于GPCR信号转导、激酶研究、大分子间相互作用、蛋白翻译后修饰等表观遗传学、抗体抗原作用以及筛选、配体与受体以及膜蛋白相关的研究。
除了PD1和PD-L1的免疫检查点抑制剂筛选之外，HTRF法还可用于筛选CTLA4/CD80/86、OX40/OX40L等其他检查点的抑制剂。
细胞因子检测
当外源给予的免疫检查点抑制剂发挥作用，T细胞处于“进攻”状态后，将派遣大量的细胞因子去消灭肿瘤细胞，这些细胞因子免疫反应激活中扮演了重要角色。HTRF提供了多种细胞因子的检测方案，如测定IL2的双抗体检测法等，同样，采用抗IL2两个不同位点的抗体，并分别采用D2/XL665和Eu进行标记，如下所示：
图9, HTRF测定IL-2的检测方案。
HTRF检测仪器
由于HTRF信号的检测需要仪器支持高性能的时间分辨荧光检测模块，如果是高通量筛选的客户，还需要整体的数据管理分析系统，而BioTek可根据用户的筛选通量、检测速度及后续药理表型评估需求的不同提供多种不同的检测设备方案，例如您可以选择SynergyNeo2全球顶级的HTS设备进行高通量HTRF筛选，或者选择灵巧的HybridTM检测系统SynergyH1或Cytation系列等。
肿瘤免疫治疗表型筛选
有效的免疫检查点抑制剂及其肿瘤免疫治疗药物同样需要进行严谨的Cell based assays评估更详细的药理学作用及药物毒性。而基于表型的筛选可以更有效的获得生物相容性最佳的抑制剂，因此，可通过Cytation系列的双联合平台开展更加丰富的细胞表型筛选及药物毒性评估。
如果您对Cisbio公司的HTRF技术感兴趣，可电话联系 18621712583 鲁先生 邮箱 yanjun.lu@cisbio.com
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