中文摘要
目的对靶向唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15, Siglec-15）的全人源单克隆抗体23F4进行关键结合位点鉴定和生物学功能的初步评价。
方法对Siglec-15进行丙氨酸扫描突变，鉴定23F4的关键结合位点，再通过ELISA和流式细胞术对23F4的体外生物学功能进行探究，最后构建2种小鼠肿瘤模型以评价23F4的体内抗肿瘤功能。
结果鉴定得到23F4的关键结合位点（R71/H72残基）。在体外检测中23F4具有较高的结合活性，半数效应浓度为68.42 ng/mL，在中、低浓度下与Siglec-15阳性细胞的结合活性优于对照抗体，并且23F4能够阻断Siglec-15与受体的结合，解除T细胞的增殖抑制，在2种小鼠肿瘤模型中均具有抑制肿瘤生长的功能。
结论靶向Siglec-15的单克隆抗体23F4具有新型结合位点，能够解除Siglec-15介导的免疫抑制。
正文
肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的免疫检查点在过去10年中成为肿瘤免疫领域的热点，其中唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15，Siglec-15）作为免疫抑制分子，在肿瘤免疫中发挥了重要作用。Siglec-15是Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外结构域由Ig样V型和C2型结构域组成，与B7家族成员蛋白的序列相似性为20%~30%，Siglec-15还有1段含赖氨酸残基的跨膜结构域以及1个短胞质尾区。人类与小鼠Siglec-15的氨基酸序列同源性达83%。Siglec-15能显著抑制抗CD3抗体OKT3诱导的T细胞增殖，表达Siglec-15的HEK293T细胞能够抑制Jurkat T细胞中的核因子-κB报告基因活性，表明Siglec-15可以通过受体介导的信号转导抑制T细胞的增殖和免疫功能。结构生物学研究揭示，Siglec-15通过保守的R143残基与唾液酸糖基化受体结合，T细胞表面的CD11抗原样家族成员B（CD11b）及含富含亮氨酸重复序列4C蛋白（leucine rich repeat containing 4C，LRRC4C）均是已知的Siglec-15受体。虽然已基于蛋白质组学的邻近标记技术筛选出T细胞上存在的其他候选Siglec-15受体，但Siglec-15及其受体的免疫机制尚未完全明确。
目前唯一进入Ⅱ期临床研究的靶向Siglec-15人源化单克隆抗体（单抗）是美国NextCure公司的NC318。本实验室开发了新型靶向Siglec-15的全人源单抗23F4，本研究拟对23F4与抗原的关键结合位点进行研究，并评价其结合活性、受体阻断功能及免疫调控功能，为进一步研究开发提供基础。
1
材料与方法
1.1
材料与仪器
NC318是根据已公布的序列（专利号：US20190202912A1）进行轻重链质粒合成，Siglec-15-mFc由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全序列质粒合成（Siglec-15序列UniProt ID： Q6ZMC9），上述质粒经HEK293细胞表达，经Protein A亲和层析纯化。同种型对照为本实验室保存的无关IgG单抗。RAW264.7和U87-MG细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，HEK293细胞为本实验室保存，MC38-hSiglec-15细胞为本实验室保存的稳定表达人Siglec-15的重组细胞株。快速定点突变试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司（货号：KM101），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-羊抗鼠IgG二抗购自美国KPL公司（货号：5450-0011），Lipomax转染试剂购自南京南晶生物技术有限公司（货号：32012），重组人整合素αMβ2蛋白（CD11b/CD18二聚体）购自美国R&D Systems公司（货号：4047-AM-050），HRP-羊抗人IgG二抗购自美国SouthernBiotech公司（货号：2040-05），Alexa Fluor 647-羊抗人IgG荧光二抗、人穿孔素ELISA检测试剂盒购自美国Invitrogen公司（货号：A21445、BMS2306），LRRC4C-His蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司（货号：10988-H08H），藻红蛋白-羊抗鼠IgG荧光二抗、7-氨基放线菌素（7-aminoactinomycin D，7-AAD）荧光染料购自美国Biolegend公司（货号：405307、420403），人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）购自妙顺（上海）生物科技有限公司（货号：PB100C），羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）、BV421-鼠抗人CD4荧光二抗、别藻蓝蛋白-鼠抗人CD8荧光二抗均购自美国BD公司（货号：565082、562842、555369），OKT3购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司（货号：GMP-MC0323），人IFN-γ、人TNF-α ELISA检测试剂盒购自武汉华美公司（货号：CSB-E04577h、CSB-E04740h）。SpectraMax M5酶标仪购自美国Molecular Devices公司，NovoCyte流式细胞仪购自美国Agilent公司。
1.2
实验动物
4~8周龄的无特定病原体级雌性BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均购自上海必凯科翼生物技术有限公司。所有实验小鼠均饲养在无特定病原体的动物设施中，动物生产许可证号：SCXK（沪）2023-0009，所有动物实验均经过上海生物制品研究所实验动物福利及伦理委员会的审核与批准，BALB/c小鼠动物伦理号：上生动福（准）2024018；C57BL/6小鼠动物伦理号：上生动福（准）2024019。
1.3
关键结合位点鉴定
采用ELISA检测可溶性Siglec-15-mFc的突变体与23F4的结合能力。首先根据突变位点设计点突变引物，突变体的设计参考Siglec-15 胞外结构域的蛋白结构和氨基酸位点的溶剂可及性，包括部分对照抗体NC318公布的结合位点（R43、R138、R153残基）。用快速定点突变试剂盒获得突变体质粒，通过HEK293细胞表达系统表达蛋白，经Protein A亲和层析纯化得到突变体蛋白。用23F4（5 μg/mL）包被ELISA板，4 ℃孵育过夜。封闭2 h后，将不同种类和浓度的突变体蛋白（0~10 μg/mL，3倍梯度稀释）加至相应孔中，37 ℃孵育1 h。加入HRP-羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h。在各步骤间用含0.05%吐温-20的PBS（PBST）洗涤未结合的蛋白或抗体。以3，3′，5，5′-四甲基联苯胺作为HRP的底物，反应终止液为2 mol/L硫酸，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
1.4
抗体结合活性的ELISA检测
用可溶性Siglec-15-mFc（1 μg/mL）包被ELISA板，4 ℃孵育过夜。封闭2 h后，将不同浓度的抗体（0~10 μg/mL，3倍梯度稀释）加至相应孔中，37 ℃孵育1 h。加入HRP-羊抗人IgG二抗，37 ℃孵育1 h。各步骤间用PBST洗涤。底物和反应终止液与1.3节相同，测定450 nm处的吸光度值。
1.5
流式细胞术检测抗体结合活性
将MC38-hSiglec-15或U87-MG细胞收集后，分别与抗Siglec-15单抗（浓度范围为0~20 μg/mL，5倍梯度稀释）在4 ℃孵育1 h。孵育完成后，用含2%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的PBS洗涤样本3次，随后在避光条件下加入Alexa Fluor 647-羊抗人IgG荧光二抗，继续在4 °C孵育45 min，用含2% FBS的PBS洗涤样本3次。用流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度，并使用NovoExpress软件进行数据分析。
1.6
抗体对Siglec-15与受体结合的阻断作用检测
将可溶性LRRC4C-His蛋白（1 μg/mL）和重组人整合素αMβ2蛋白（4 μg/mL）包被于ELISA板上，并于4 ℃孵育过夜。封闭2 h后，将相应的Siglec-15-mFc（100 μg/mL）和不同种类的抗体（8、40、200 μg/mL）加至相应孔中，常温孵育2 h。加入HRP-羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育45 min。各个步骤间用PBST洗涤。底物和反应终止液与1.3相同，测定450 nm处的吸光度值。
采用Lipomax将CD11b/CD18质粒瞬时转染至HEK293细胞，48 h后收集细胞加入Siglec-15-mFc（100 μg/mL）和不同种类的抗体（200 μg/mL），于4 ℃孵育1 h。孵育完成后，用含2% FBS的PBS洗涤样本3次，随后在避光条件下加入藻红蛋白-羊抗鼠IgG荧光二抗，继续在4 ℃孵育45 min，用含2% FBS的PBS洗涤样本3次。用流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度，并使用NovoExpress软件进行数据分析。
1.7
抗体解除Siglec-15介导的PBMC中T细胞的增殖抑制检测
复苏人PBMC，用RPMI 1640培养基400×g离心5 min，重复2次，在避光条件下加入CFSE，37 ℃孵育15 min标记PBMC，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基，400×g离心5 min，重复2次中止染色。将细胞加入96孔细胞培养板后，加入OKT3激活T细胞，再加入Siglec-15-mFc（5 μg/mL）与不同抗体（20.0、10.0、5.0、2.5 μg/mL）的抗原抗体复合物，37 ℃孵育72 h。孵育完成后收集细胞至96孔深孔板中，用BV421-鼠抗人CD4荧光二抗、别藻蓝蛋白-鼠抗人CD8荧光二抗和7-AAD分别标记细胞，4 ℃孵育45 min，用含2% FBS的PBS洗涤样本3次。用流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度，并使用NovoExpress软件进行数据分析，计算解除抑制率。
其中G0激活为OKT3单抗激活对照组的G0峰占比，G0抑制为激活后加入Siglec-15抑制对照组的G0峰占比，G0实验组为各实验组的G0峰占比。
分别用人IFN-γ、TNF-α、Perforin ELISA检测试剂盒检测细胞上清中相应细胞因子的分泌水平。
1.8
体内抗肿瘤活性检测
用2.5×106个MC38-hSiglec-15细胞皮下注射C57BL/6小鼠。4 d后，当肿瘤体积达到约95 mm3时，将小鼠由计算机随机编号分配至各实验组，随后每周2次腹腔注射单抗或PBS（共7次）。每次计量小鼠体重，并监测肿瘤生长，根据（长度×宽度2）/2计算肿瘤体积，当最大肿瘤体积超过2 000 mm3时终止实验。
用1×107个RAW264.7细胞皮下注射BALB/c小鼠。7 d后，当肿瘤体积达到约120 mm3时，将小鼠随机分配至各实验组，随后每周2次腹腔注射单抗或PBS（共5次），检测肿瘤体积和小鼠体重，当最大肿瘤体积超过2 000 mm3时终止实验。
抗肿瘤疗效通过终点肿瘤生长抑制率（tumor growth inhibition，TGI）来评价。
其中ΔT为治疗组最终肿瘤体积与初始肿瘤体积之差，ΔC为对照组最终肿瘤体积与初始肿瘤体积之差。
1.9
统计学分析
用GraphPad Prism 10.0对实验数据进行统计学分析。对于单一浓度条件下的体外实验和检测细胞因子分泌水平实验的数据比较，采用单因素方差分析；对于多浓度条件下的体外实验和肿瘤模型实验的数据比较，采用双因素方差分析。结果以均值±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义
2
结果
2.1
关键结合位点鉴定
基于快速定点突变技术设计并得到Siglec-15-mFc不同氨基酸位点的丙氨酸突变体后，通过ELISA检测突变体与23F4的结合活性。ELISA结果表明，NC318相关突变体（R43A/R138A/R153A）与23F4的结合活性均与野生型（wild type，WT）相当，说明23F4与NC318的结合位点不重合；R71残基的丙氨酸突变体（R71A）与23F4的结合活性完全丧失，而H72残基的丙氨酸突变体（H72A）与23F4的结合活性相较于WT明显下降，其半数效应浓度（median effective concentration，EC50）从5.97 ng/mL（WT）升至40.33 ng/mL，见图1。
2.2
23F4与Siglec-15的结合活性
抗体与Siglec-15结合的ELISA检测结果显示，23F4和NC318与Siglec-15结合活性相近，EC50分别为68.42、40.37 ng/mL（图2A）。通过流式细胞术检测抗体与MC38-hSiglec-15和U87-MG细胞表面Siglec-15的结合活性发现，在浓度低于4.0 μg/mL时，23F4与Siglec-15的结合活性高于NC318，且差异有统计学意义，双因素方差分析的F交互分别为103.90、185.90，P值均<0.000 1（图2B、2C）。
2.3
23F4对Siglec-15与其受体结合的阻断作用
通过ELISA检测抗体对Siglec-15与LRRC4C/CD11b结合的阻断作用，结果表明23F4对LRRC4C结合的阻断能力略低于NC318（F=12.92，P=0.013）（图3A）；对于CD11b结合的阻断效果相近（F=14.67，P=0.471）（图3B）。由于CD11b是表达在T细胞表面的Siglec-15受体，并可以通过结合Siglec-15抑制T细胞的增殖，因此进一步建立了细胞水平的评价体系，采用流式细胞术检测抗体对Siglec-15-mFc与瞬转CD11b/CD18的HEK293细胞结合的阻断作用，结果也显示23F4与NC318的阻断效果相近（F=11.15，P=0.167）（图3C）。
2.4
23F4解除Siglec-15介导的PBMC中T细胞的增殖抑制
通过CFSE标记PBMC检测T细胞增殖情况，在细胞增殖拟合图中，G0峰代表未增殖的母细胞群，连续分裂的T细胞呈现荧光强度逐级递减的峰型。OKT3激活后，CD4+ 和CD8+ T细胞的平均G0峰占比分别为58.68%、28.44%；加入Siglec-15后分别升高到84.83%、76.91%，对T细胞抑制效果明显（结果未展示）。由图4可见，以23F4处理组（10 μg/mL）为例，CD4+ T细胞的G0峰占比降低到72.03%，解除抑制率为48.16%，CD8+ T细胞的G0峰占比降低到44.28%，解除抑制率为67.32%。
用ELISA检测解除增殖抑制实验的上清液中IFN-γ、TNF-α和穿孔素的含量。同种型对照组、23F4实验组、NC318对照组的IFN-γ含量分别为2.29、7.55、3.88 ng/mL（F=4.03，图5A）；促炎症因子TNF-α含量分别为297.77、142.24、156.51 pg/mL（F=33.69，图5B）；杀伤介质穿孔素含量分别为827.41、1 233.94、1 109.47 pg/mL（F=202.50，图5C）；P值均<0.05。
2.5
23F4体内抗肿瘤活性评价
在将MC38-hSiglec-15细胞植入C57BL/6小鼠腋下构建的肿瘤模型中，相较于PBS组，23F4对肿瘤生长有明显的抑制作用（F交互=4.311、F时间=172.4、F给药=8.275，P=0.015），TGI为39.78%，对照抗体NC318没有明显的治疗效果（图6A）；实验过程中各治疗组之间的体重没有异常变化（图6B）。
在用表达鼠Siglec-15的RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）构建的肿瘤模型中，相较于PBS组，23F4对肿瘤生长有明显的抑制（F交互=2.411、F时间=46.03、F给药=5.622，P=0.027），TGI为51.85%。虽然NC318给药组肿瘤体积与PBS组差异无统计学意义，但其TGI（21.11%）仍提示潜在抗肿瘤活性（图6C），同样在实验过程中各组小鼠体重未见异常变化（图6D）。
3
程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）的过表达，是介导肿瘤免疫逃逸的关键分子机制之一。T细胞表面的程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）与PD-L1结合，可以抑制T细胞受体信号通路的活化，进而介导T细胞免疫功能耗竭。靶向PD-1/PD-L1的抑制剂虽已在肿瘤免疫治疗领域取得重要突破，但是PD-1/PD-L1免疫疗法的平均应答率仅在20%左右。
Siglec-15是TME中重要的免疫抑制分子，其核心作用机制是通过抑制CD8+ T细胞增殖介导免疫抑制。Siglec-15在肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤细胞上特异性高表达，与PD-L1具有结构相似性，并且与PD-L1的表达互斥，提示其可能是PD-L1低表达/阴性肿瘤患者的潜在治疗靶点。NextCure公司针对PD-1/PD-L1通路抑制剂耐药的难治性非小细胞肺癌晚期患者，开展了NC318联用靶向PD-1的帕博利珠单抗（美国默沙东公司）治疗的Ⅱ期临床试验，客观缓解率达11%。上述临床数据表明，抗Siglec-15的肿瘤治疗策略具有重要研发潜力。
本研究首先探索23F4的结合位点，通过丙氨酸扫描突变技术证明其与NC318的结合位点不同，并筛选得到了2个关键的结合位点R71/H72残基。目前已经证实R143残基是Siglec-15上与唾液酸糖基化受体结合的关键位点，从晶体结构分析的结果来看，NC318的结合位点直接将R143残基覆盖，虽然R71/H72残基与R143残基相距较远，但是可能通过空间位阻间接阻断R143残基的功能。在此基础上，对23F4进行结合活性的评价，发现在表达Siglec-15的细胞上，23F4在中、低浓度的结合活性优于NC318，针对2种已知的Siglec-15受体CD11b和LRRC4C，23F4也具有结合阻断功能。此外，相较于对照抗体NC318，23F4对Siglec-15介导的T细胞增殖抑制具有更强的逆转能力，尤其是解除CD8+ T细胞的增殖抑制，并能上调IFN-γ的分泌水平，这与之前提到Siglec-15主要针对CD8+ T细胞的免疫抑制机制吻合。本研究发现加入23F4还可以引起穿孔素分泌水平的上调，原因可能是解除了Siglec-15介导的免疫抑制，并且分泌水平受到正向调控的IFN-γ促进了CD8+ T细胞或自然杀伤细胞的激活，从而使这些细胞分泌穿孔素和颗粒酶等杀伤介质。除此之外，有研究揭示了Siglec-15在慢性炎症和肿瘤生长的炎症反应的启动和效应阶段中可能发挥重要的作用。本研究通过检测证明23F4可以下调炎症因子TNF-α的分泌水平。以上实验结果说明，23F4可以有效解除Siglec-15引起的T细胞增殖抑制，促进CD8+ T细胞的免疫功能。
自然条件下Siglec-15很少在正常组织和细胞中表达，而在肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞上表达上调。本研究分别构建了MC38-hSiglec-15细胞和RAW264.7细胞小鼠肿瘤模型，评价23F4的体内抗肿瘤活性。基于2种模型的实验结果，23F4均具有一定肿瘤生长的抑制效果。后续将建立更多的肿瘤模型进一步研究其体内抗肿瘤活性。
本研究通过丙氨酸扫描突变技术得到23F4的关键结合位点R71/H72残基，并且初步评价了23F4的生物学功能。23F4在结合活性和解除Siglec-15介导的T细胞增殖抑制功能上优于对照抗体NC318，说明R71/H72残基是优势的结合位点，为靶向Siglec-15抗体的研究提供参考。后续需要通过结构生物学方法对23F4的结合表位进行更深入的研究，并完善生物学功能评价，为23F4用于肿瘤治疗提供更全面的基础。
作者
石广健 管风杰 张坤明 瞿爱东 梁红远
上海生物制品研究所有限责任公司第一研究室， 上海 200051
通信作者：梁红远，
Email：hongyuanliang@163.com
引用本文：石广健, 管风杰, 张坤明, 等.靶向Siglec-15全人源单克隆抗体的关键结合位点鉴定及生物学功能评价[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(6): 393-399.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20250429-00029
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