检测抗体用什么仪器高博流式学院丨玩转PNH流式细胞术检测，这些你要知道！

PNH发病后，造成正常情况下通过与GPI锚结合的锚连蛋白无法与之结合，而表现为细胞表面锚连蛋白的缺失。

GPI锚由磷脂酰肌醇（PI）和一个N-葡萄糖胺分子（GlcNH2）、三个甘露糖（Man）和一个乙醇胺分子（EtN）组成，末端甘露糖上的乙醇胺通过酰胺键共价结合锚连蛋白（图1）。

目前，已经发现了CD55、CD59、CD14和CD16等20余种GPI锚连蛋白。

图1 正常GPI锚连蛋白与GPI锚关系结构示意图

国际PNH工作组（I-PIG）将PNH分为三类：

1. 经典PNH：存在PNH克隆，同时有溶血和（或）血栓的临床表现并除外其他骨髓衰竭性疾病（BMF）；

2. 伴原发骨髓衰竭疾病中的PNH克隆：如再生障碍性贫血（AA）或骨髓增生异常综合征（MDS）等；

3. 亚临床型PNH：有少量或微量PNH克隆，但没有溶血或血栓形成的临床或实验室证据。

什么类型的患者需要进行PNH实验检测？刘艳荣教授表示，有三类患者需要进行PNH实验检测。

首选，溶血相关疾病，排除常见原因的血管内溶血及溶贫，LDH、网织红细胞增高等；伴有异常体征的血栓的患者，例如年轻、特殊位置的患者，以及伴溶血的患者；还有不明原因血细胞减少，骨髓衰竭性疾病的患者。

红细胞上用于PNH检测的锚连蛋白主要是CD59和CD55，由于CD59表达量高，与其他抗原相比，更容易鉴别正常细胞（Ⅰ型细胞）、部分缺失（Ⅱ型细胞）和完全缺失（Ⅲ型细胞）的PNH细胞。

因此，目前不再检测CD55, 只检测CD59。

具体操作上，尽量选择TIME参数，分析时去除气泡。FSC和SSC选择对数坐标，用未染色红细胞调节SSC、FSC、PMT的电压（图2）。

将红细胞SSC调到图的中间位置，FSC调到稍微超过中间偏右侧的位置。用单染色CD59-PE和CD235a-FITC调节FITC、PE通道电压并进行荧光补偿调节，抗体方面选择国际推荐抗体。

图2

正常标本验证补偿测试标本时，III型细胞以CD235a单染设门，正常RBC为I型，II型上限参照正常对照设门。（图3）

图3

抗凝剂的选择上，推荐EDTA和肝素，或者ACD，新鲜抗凝血需在48小时内标记，用磷酸盐缓冲液（PBS）对EDTA抗凝外周血样品进行1∶100稀释，反向取样稀释后血样100ul，枪尖小心移出避免带走任何标本，避免接触管壁。

加入CD235a/CD59两种抗体，抗体需要预混稀释，以避免抗体加量的差异造成染色的人工假象。

试管轻柔涡旋混匀避免气溶胶，室温避光孵育20-60min。洁净PBS洗涤两次后重悬于1ml PBS，标本上机获取前用力“racking”3-4次，避免红细胞聚集。

至少获取10万个CD235a+红细胞，如果在Ⅲ型PNH红细胞区域检测到少量异常细胞，应该继续采集样本达到100万，如果不够100万，则采集全部标本。

目前国际上将红细胞检测的定量低限（LLOQ）达到0.01%时定义为高敏感检测。

图4

设门方法方面，以阴性对照设定III型门位置，以正常RBC设定I型门。需要注意的是II 型门形状采用不规则形，不用矩形。

图5

白细胞是检测PNH克隆大小最精准的目标细胞，用于确定疾病的发展程度。由于淋巴细胞寿命长，并且GPI锚连蛋白表达变异性大，无法准确反映疾病状态，因此不适合做PNH克隆检测。

设门抗体的选择上，CD15是粒细胞通用的抗体，对于单核细胞的设门标志的选择，国际上推荐CD64，但国内研究发现，当采用CD45、CD33和CD15同时进行粒细胞及单核细胞设门仍然有很好的可行性（表1）。

表1 白细胞阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）

克隆检测常用抗体组合

白细胞检测仍然需要选择TIME参数，散射光选择线性模式，调节电压，保证所有细胞都在坐标轴范围内，高于FSC阈值，便于去除碎片。补偿矩阵的抗体可以选择CD3、CD8或CD19等。

需要注意的是对于包括FLAER-Alexa488，标本必须单染FLAER，用于调节补偿。

图6

仪器设置方面，PMT调节前，补偿调为0，关闭 logicle or bi-exponential模式。设定电压，未染色淋巴细胞调整PMT电压，不要压线。SSC、FSC选择lin模式，调节电压，保证所有细胞都显示在图内，高于FSC阈值，便于去除碎片。

参见国际指南。以CD64-PE-CY7为例，要求单核细胞与淋巴细胞的区分度＞1.5log，10.1 BD阴性细胞背景太宽，单核细胞和淋巴区分度低于1log，10.1 EXBIO和22 Beckman Coulter均推荐2.5ul（图7）。

图7

新鲜抗凝外周血，不推荐骨髓（存在不成熟粒或单细胞，GPI锚链蛋白会低水平表达，如CD14），反向取样避免气溶胶，枪尖小心移出避免带走任何标本；加入滴定后预混的抗体，轻柔上下抽吸混匀；试管轻柔涡旋混匀避免气溶胶，室温避光孵育20-30min；获取至少50000个中性粒细胞，如发现少量PNH表型细胞，应继续获取细胞，最好达到25万。如果不够25万，则将管内细胞全部获取，以增加检测敏感度。  

由于部分患者出现血管内溶血，或者近期接受输血，使得红细胞的PNH克隆比例往往比实际低，不能真实反映疾病程度。

因此，白细胞PNH克隆比例尤为重要。高灵敏度FCM可以发现PNH小克隆、识别PNH表型特点、量化克隆的大小以及明显降低假阳性率。

图8 高敏感实验的必要性：国际数据42% PNH+%<1%

中国PNH登记组的资料显示，613例PNH克隆阳性患者中49%为经典型。

表2 中国PNH登记组资料

高灵敏度PNH克隆检测时，获取的细胞数、检测的背景值及仪器的洁净度等决定检测的敏感度。

导致假阳性的原因主要有红细胞碎片、非特异性染色、自发荧光、携带污染及错误数据的出现。避免出现假阳性的方法主要为获取足够多的细胞，注意清洗FCM检测管道、对鞘液和PBS进行过滤。

采用高敏感方法分析微量PNH克隆标本或正常标本时，注意显示所有细胞，要看到Ⅱ型和Ⅲ型门内每个细胞的分布位置。

同时注意Ⅱ型门不要用矩形，以免将CD235a和CD59弱表达的非特异性细胞划入Ⅱ型门中（图9）。

图9

获取细胞时，PNH克隆比例＞1%，获取10万个细胞足够。如果10万个RBC中无PNH表型细胞，停止获取，报告“未见PNH克隆细胞”。按照高斯分布，99%以上真正的GPI缺失细胞比例低于0.01%。若PNH克隆比例＜1%，需要增加获取的细胞数。

撰写报告时，刘艳荣教授表示，对于是否存在PNH克隆要清晰，避免模棱两可的术语，直接写PNH克隆细胞。

需要报告RBC中PNH克隆的比例（III和II型细胞比例及总比例），以及WBC中PNH克隆比例（包括粒细胞和单核细胞），单核细胞通常比例更高，II型白细胞报告目前无要求。

描述PNH克隆比例的国际推荐术语：

A. PNH细胞群＞1%：PNH克隆

B. PNH细胞群在0.1%和1%之间：低量PNH细胞群，或低量PNH克隆（minor）

C. PNH细胞群＜ 0.1%：存在少量GPI缺陷细胞，或存在少量PNH表型细胞。

图10 报告形式

最后，刘艳荣教授介绍了PNH克隆检测的国际指南，并表示对于PNH流式检测，目前缺乏相应的商品化室内质控物，国内临床检验中心也未开展相关的室间质评。

因此，建议由开展PNH流式检测的区域中心单位牵头进行室间比对，共同推进PNH克隆检测的规范化。

研究员 硕士生导师

北京大学血液病研究所血液细胞实验室主任

高博流式创新研究院首席学科顾问

擅长：血液恶性肿瘤的免疫分型和基因诊断。

主编《实用流式细胞术-血液病篇》和参与编写全国研究生统编教材《医学细胞生物学》等4部专著。

兼任中国免疫学会血液免疫分会常务委员，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组主任委员。中国生物工程学会常务理事，中国生物工程学会细胞分析专业委员会主任委员。中华医学会血液学分会实验诊断学组第8,9届成员。中国医药质量管理协会医学检验质量管理委员会常务委员。中华医学会血液分会实验诊断组第8,9届委员。中国老年保健医学研究会肿瘤防治分会第一届委员会副主任委员，中国老年保健医学研究会肿瘤防治分会第一届委员会第一学术部（血液肿瘤实验诊断专业）常务副主任委员。中国医药生物技术协会生物诊断技术分会生物检测原材料标准化学组成员。北京市医疗器械评审专家。《中华血液学杂志》审稿专家及《中国实验血液学杂志》编委。

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