引用：邵毅，迟玮，魏雁涛，等.眼底自发荧光在年龄相关性黄斑变性中的应用指南（2023).国际眼科杂志2023;23（8):1235-1241
摘要
眼底自发荧光（FAF）成像是基于视网膜色素上皮和脉络膜中的眼内源性荧光团激发的荧光进行成像的技术，荧光激发物质主要是脂褐质（LF）和黑色素。由于该无创检查技术可通过观察LF和黑色素在眼底的空间分布来反映视网膜色素上皮的功能状况，在诊断、鉴别和随访年龄相关性黄斑变性（ARMD）上具有独特优势。本指南即对FAF在ARMD不同阶段和分类上的临床应用进行规范和解读。
年龄相关性黄斑变性（age – related macular degeneration，ARMD）是一种导致视力进行性损害的全球第三大常见致盲性眼病，严重影响患者的生活质量，是老年人不可逆失明的最常见原因。ARMD的发病机制与视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞内脂褐质（lipofuscin，LF）的逐渐积累密切相关。眼底自发荧光（fundus autofluorescence，FAF）是一种无创成像技术，可通过采集LF在RPE细胞内的分布状态，客观反映ARMD的病情变化。随着成像方法和新型成像设备的发展，FAF越来越多地用于诊断和监测视网膜疾病。使用共焦扫描激光检眼镜（confocal scanning laser ophthalmoscope，cSLO）进行FAF成像是识别非新生血管性ARMD患者高风险特征的可靠技术，也为新生血管性ARMD的鉴别诊断提供了有价值信息。本文涵盖了FAF原理的介绍、ARMD中FAF成像的回顾，以及ARMD研究中FAF对地图状萎缩（geographic atrophy，GA）和早期ARMD表型的最新分类，并总结了ARMD发病过程中萎缩进展和脉络膜新生血管形成的关系。
1 眼底自发荧光原理
自发荧光（AF）是指某些分子在被合适的波长光激发时发光的现象。这些激发分子被称为荧光团，可分为外源性和内源性。前者是为了诊断目的而由外部输入眼内组织的分子，如眼底荧光素血管造影（fundus fluorescein angiogaphy，FFA）中静脉注射的荧光素钠分子，后者是人体组织细胞内固有的荧光因子，该荧光因子常存在于角膜、晶状体、RPE、葡萄膜黑色素细胞和巩膜胶原中。
Delori等[1]首次采用FAF进行体内观察，发现短波长的FAF（short wavelength，SW-FAF）激发波段位于500~800nm，主要来源于RPE细胞中的LF。LF是视网膜内的主要荧光团，是RPE中光感受器外节氧化分解的产物[2]。LF是一类异质类双维甲酸，激发光谱范围为300~600nm，发射光谱范围为480～800nm，其主要荧光团是A2E[3]。当全反式视黄醛离开视觉周期时，其开始与磷脂酰乙醇胺（PE）形成A2-PE。LF前体（主要是A2-PE和二氢A2-PE）被RPE细胞吞噬之前，在光感受器外节发出自发荧光[4]。光感受器中全反式视黄醛的积累导致双维甲酸形成，在氧化过程后生成LF[4-5]。其它已知的LF前体包括异A2E和A2E的次要顺式异构体[4]，并且还观察到丙二醛、4-羟基壬烯醛和晚期糖基化终产物（AGEs）亦参与LF的生成[6]。在临床实践中，通过使用cSLO和数字非散瞳眼底照相机可以获得自发荧光成像。前者使用蓝光激发（488nm）和500nm左右的屏障滤光片，具体取决于所使用的设备[如Spectralis® HRA（海德堡）500nm；F-10（Nidek，Aichi，Japan）510nm；Optomap® Panoramix 200 Tx（Optomap；Optos，Dunfermine，Scotland）540～800nm]，因此，cSLO-AF也称为蓝色自发荧光或短波长（SW）-AF。后者使用约500~580nm的激发滤光片和640~715nm的屏障滤光片，具体取决于设备[如CX-1和CR-2 Plus眼底相机（Canon，Toakyo，Japan）：激发滤光片530~580nm，屏障滤光片640nm；Visucam 200、Visucam 500、Visucam NM/FA和FF450 Plus红外相机（ Carl Zeiss Meditec，Jena，Germany）：激发滤光片510～580nm，屏障滤光片650～735mm；TRC-50DX、TRC-50IX相机（Topeon Medical Systems，Oakland，NJ，USA）：激发滤光片500~610mm，屏障滤光片675~715nm][7]。
黑色素是视网膜内的另一种荧光团，位于RPE和脉络膜内。通过近红外FAF （near – infrared autofluorescence，NIR-FAF）成像可以获得黑色素自发荧光，该成像提供了有关黑色素在RPE细胞/脉络膜复合体中分布的信息。Keilhauer和Delori[7]首次研究了NIR-FAF成像技术，他们使用激发波长为787nm的cSLO和800nm左右的屏障滤光片获得了NIR-FAF。随着年龄老化及观察时间的延长，RPE细胞内起到保护作用的黑色素数量减少，LF和溶酶体残体的数量增加[9]。分离的黑色素激发波长为350～450nm，发射波长为440～560nm。以往研究认为黑色素是非荧光物质。然而，黑色素颗粒体外研究显示出与年龄衰老相关的荧光特性，黑色素自发荧光强度也会像LF一样随着衰老而增加，推测可能是其与脂褐素的某种结合所致。黑色素-脂褐素颗粒的荧光最大激发波长为364nm，最大发射波长为540nm[10]。其它荧光团，如蛋白质（血红蛋白和线粒体酶）、黄斑色素蛋白和黄斑区色素也存在于视网膜上。
2 健康眼底的眼底自发荧光成像
在FAF成像技术中，暗像素值代表低发射强度，亮像素值代表高发射强度。在健康的眼睛中，FAF信号强度呈现出特征性分布，其中视乳头由于缺乏RPE和LF而显得暗淡，而视网膜血管由于被血液吸收而显示FAF信号减弱。然而，黄斑区的FAF模式取决于所使用的FAF技术类型，当采用SW-FAF技术获取FAF成像时，由于黄斑色素对激发光的吸收，黄斑区尤其是中心凹周围的自发荧光信号减弱[5]，中心凹旁区的自发荧光信号高于中心凹，但低于视网膜周边区域的背景信号[11]（图1A）。NIR-AF被认为主要起源于RPE黑色素，而非脉络膜黑色素细胞。在NIR-FAF成像中，由于中心凹8.8°范围内黑色素密度最大，因而该区域荧光信号最强（图1B）。
图1眼底自发荧光成像A：短波长眼底自发荧光（488nm激发）；B：近红外眼底自发荧光（787nm激发）。
3 年龄相关性黄斑变性的眼底自发荧光成像
ARMD是60岁以上人群视力障碍和失明的最常见原因[12]。尽管ARMD的病理生理学机制尚有待挖掘，但氧化损伤参与其发病过程已被证实，其中LF堆积起了重要作用[13]。ARMD分为非新生血管性（干性或非渗出性）和新生血管性（湿性或渗出性）。玻璃膜疣被认为是非新生血管性ARMD的临床标志，根据其特征，可将非新生血管性ARMD分为早期、中期和晚期。在此分类中，小玻璃膜疣（<63μm）被认为是与年龄相关的正常变化，中等大小的玻璃膜疣（63~125μm）被认为是早期ARMD，而中期ARMD表现为存在大玻璃膜疣（≥125μm）或中等大小的玻璃膜疣并伴有色素变化。近20%的ARMD患者进展为两种晚期ARMD形式之一，即GA和新生血管性ARMD，两者均与严重视力丧失相关。GA代表干性ARMD的萎缩晚期，约占所有晚期ARMD患者的35%[15-16]。
3.1早期和中期非新生血管性ARMD
玻璃膜疣的成像是ARMD的早期表现（图2A），玻璃膜疣有软性玻璃膜疣、屈光性玻璃膜疣、基底层玻璃膜疣和表皮玻璃膜疣等亚型[17]。位于视网膜下方的网状假性玻璃膜疣（RPD）是玻璃膜疣的另一种亚型。
常规眼底红外IR照相显示黄斑区斑驳样高反射信号（图2B）。在FAF成像上，玻璃膜疣可以有不同的外观[18]。由于玻璃膜疣内或覆盖玻璃膜疣的RPE细胞中存在LF，表现为高自发荧光外观，而退化的玻璃膜疣或退化的RPE细胞则表现为低自发荧光外观。中小型玻璃膜疣会产生可变的FAF图像，不同的FAF表现提示玻璃膜疣的性质不同[18]。软性玻璃膜疣表现为超自发荧光区域，在FAF成像中其边缘比中心略显著。表皮玻璃膜疣呈点状、低自发荧光。玻璃膜疣色素上皮脱离显示出高自发荧光和低自发荧光区域的斑片状图案[19]。RPD因位于视网膜下而不同于其它玻璃膜疣类型，被认为是进展为晚期ARMD的危险因素[20-21]。RPD患病率随年龄增长而增加，多见于女性[18]。FAF成像在证明RPD的存在方面比彩色眼底照相（CFP）更敏感[22]，在眼底检查中表现为小的黄白色圆形或椭圆形病变，在FAF成像中表现为多个小簇（直径50~400μm，通常<200μm）、排列规则、均匀的圆形或椭圆形区域，具有低对比度的低荧光[18]，多位于中心凹上部（图2C、D）。RPD出现低自发荧光的原因尚不清楚，可能是由于视网膜下沉积物的积聚阻挡了RPE细胞中LF的荧光[23]。
与其它成像技术如CFP、光学相干断层扫描（OCT）（图2E）、FFA（图2F）和吲哚菁绿血管造影（ICGA）（图2G）相比，FAF是识别新生血管转化形成的最敏感技术[24]。一项国际研究对早期ARMD患者的FAF变化进行了分类，国际FAF分类小组（The International Fundus Autofltuorescence
Classification Group，IFAG）[17]在纳入患者中确定了8种不同的自发荧光模式，即正常、微小变化、局灶性增加、斑片状、线状、花边状、网状和斑点状。Batoglu等[18]研究表明，斑片状、线性和网状FAF提示转化为脉络膜新生血管膜的风险很高。因此，在早期和中期ARMD中发现的FAF表型可提供有关疾病预后的信息，并可能根据预后判断确定随访间隔时间。
图2 患者，男，63岁，左眼干性ARMD A：眼底彩照可见黄斑区黄白色点片状玻璃膜疣；B：眼底红外IR照相可见高亮点状荧光；C：SW-FAF可见中心凹上下方区域高自发荧光与低自发荧光相间；D：NIR-FAF显示中心凹区域自发荧光斑驳欠清晰；E：黄斑区OCT-B scan扫描可见RPE层不规则隆起；F：眼底视网膜血管造影显示黄斑区早期未见高荧光，随着造影时间延长可见散在小片状高荧光，边界不清；C：脉络膜血管造影可见后极部斑驳低荧光。
3.2 地图状萎缩
GA被认为是非新生血管性ARMD的晚期阶段，其特征是在中心凹旁区域出现斑片状萎缩[25]。在眼底检查中，可以观察到具有脉络膜脉管系统的清晰轮廓的萎缩区域，在该区域可以看到RPE、神经感觉层外层和脉络膜毛细血管的缺损。记录和量化GA的传统技术是使用CFP（图3A）。然而，对于死亡或无功能的RPE细胞、存活但脱色素的RPE细胞（RPE受损时可释放黑色素颗粒，发生脱色素）的眼底表现，CFP常很难区分。常规眼底红外IR照相显示黄斑区高反射信号（图3B）。
由于RPE萎缩导致LF损失，因此观察到FAF信号显著降低，萎缩区域与其它完整区域的FAF信号强度对比差异非常明显。与CFP相比，FAF图像中萎缩区域的轮廓更加清晰（图3C），且眼底照相无法识别的FAF特征可能成为提示晚期萎缩性ARMD预后的决定因素[26]。Khanifar等[27]研究表明，FAF成像提供了更多的GA可重复性测量结果，并且能够更好地检测微小的GA区域。
SW-FAF在伴有白内障的GA患眼中检测受限，当使用cSLO成像系统时，由于视网膜叶黄素会吸收激发光并阻止来自底层RPE的FAF，因此难以识别靠近黄斑中心的GA边界[28]。最近，NIR-FAF被用于观察黑色素分布。Pilotto等[29]评估了两种FAF成像之间的差异，并与微观测量数据相关联，观察到GA萎缩的边界在NIR-FAF图像中显示异常，并且与在SW-FAF中观察到的相比，测量数据与眼部功能密切相关，认为这一观察结果对应于受损RPE上的持久感光层区域，表明NIR-FAF成像可能比SW-FAF成像能够更早地检测到受损RPE细胞区域，推测原因可能是这些区域增加了黑色素及LF的形成，或由于感光细胞退化导致的吞噬作用增加而导致氧化黑色素形成。由于黑色素生成或吞噬作用，这种增强的NIR-FAF信号随后会由于光感受器受损导致黑色素数量减少而发生信号减弱。
ARMD患者的GA周围自发荧光增强区域与疾病进展之间存在相关性，与GA相邻的高自发荧光增强意味着具有更快的GA进展[30-32] 。疾病进展FAM研究组[multicentre Fundus Autofluorescenee in Age – redated Macular Degeneration（FAM）Study]提出，在萎缩区域的周围可能不存在任何FAF，，或者可能观察到自发荧光增加，如果观察到任何增加的自发荧光，则将其分类为:（1）局灶型；（2）带状；（3）斑状；（4）弥漫型：1）颗粒状；2）分支状；3）滴流型；4）网状；5）点状斑点[33]。萎缩区周围呈带状或弥漫型的疾病年进展率显著高于其他FAF模式，而弥漫型中的滴流型是进展最快的类型，分析这很可能归因于没有异常和局灶型FAF与带状和弥漫型FAF相比往往GA基线水平更低[34]。诸多学者证实，局部荧光强度增加是ARMD发展的危险因素[35-38]。识别高风险特征将有助于未来研究新的识别技术以减缓ARMD进展。对ARMD患者进行防治干预后观察自发荧光改变，有望对疾病转归及预后提供更多的诊疗依据。GA继发于ARMD，其伴随的光感受器损害和视力预后相关，自发荧光面积变化被认为是提示疗效的指标[39]。有研究对ARMD患者行玻璃体腔注射补体C5抑制后进行观察，发现可减缓GA进展，结果显示药物治疗后GA面积增长较基线降低，光感受器损伤程度减轻，玻璃体腔注射2mg或4mg剂量对降低GA面积增长速率有益，具有临床意义[40]。
黄斑区OCT-B scan扫描可见RPE层及视网膜外层结构萎缩样改变，光学相干断层扫描血管成像（OCTA）检查未见新生血管形成（图3D），FFA显示黄斑区见边界清晰的圆形片状高荧光（图3E），ICGA显示黄斑萎缩区透见脉络膜血管（图3F）。
图3 患者，女，74岁，右眼ARMD萎缩灶 A：眼底彩照可见黄斑区片状萎缩区；B：眼底红外IR照相可见高亮片状荧光；C：SW-FAF可见片状低自发荧光；D：黄斑区OCT-B scan扫描可见IS/OS层及RPE层萎缩，OCTA扫描显示视网膜内外层未见血流信号；E：眼底视网膜血管造影显示黄斑区见圆形片状高荧光，边界清；F；脉络膜血管造影显示黄斑萎缩区透见脉络膜血管。
3.3 新生血管性ARMD
新生血管性ARMD的特点是脉络膜新生血管的存在（图4A），根据新生血管的位置分为1型（新生血管位于RPE下方）、2型（新生血管位于RPE上方）和3型（新生血管位于视网膜内）[41]。红外IR照相显示黄斑区以高反射信号为主，间杂低反射信号（图4B）。FAF成像的特点是出血或脉络膜新生血管可以阻挡部分SW-AF和NIR-AF信号[42]（图4C、D）。
在脉络膜新生血管的早期阶段，由于RPE和感光层完整，SW-AF强度保持不变。经典的脉络膜新生血管由于视网膜下腔的纤维血管复合物导致RPE荧光阻挡而出现低荧光[43]。眼底渗出液由于激发光吸收而表现为低自发荧光，在疾病的更晚期阶段可能变成超自发荧光。Kellner等[42]观察到渗出活动区域的FAF信号存在差异，在SW-FAF成像中，它们通常是超自发荧光，而在NIR-FAF成像中，这些区域通常显示出信号强度降低，并认为这一发现可以解释为什么在某些新生血管性ARMD患者中，SW-FAF观察到的信号增强区域大于NIR-FAF信号增强的区域。
黄斑区OCT-B scan扫描可见视网膜外层结构紊乱、层间囊样水肿伴高反射信号，中心凹下可见视网膜下积液，中心凹鼻侧RPE层紊乱伴缺失，OCTA检查见粗大新生血管形成（图4E），FFA显示黄斑区见簇状高荧光（图4F），ICGA显示黄斑斑驳样低荧光改变，间杂点状强荧光（图4G）。
图4 患者，男，73岁，右眼湿性ARMD A：眼底彩照可见黄斑区黄白色大片渗出，病变中央见片状陈旧出血灶；B：眼底红外IR照相可见后极部片状低反射信号，间杂点片状高反射信号点；C：SW-FAF可见后极部地图状低荧光暗区，中心凹边缘及颞下方黄斑区域呈现高亮超自发荧光；D：NIR-FAF显示中心凹斑驳样低信号强度；E：OCT可见中心凹视网膜下液，中心凹鼻侧视网膜囊样水肿增厚，局部外层结构紊乱缺失，视网膜下散在低反射囊腔及高反射点信号，RPE层结构紊乱不清；F;眼底视网膜血管造影显示随造影时间延长后极部视网膜呈弥漫性高荧光改变，边界不清，部分出血遮蔽荧光；G;脉络膜血管造影显示后极部呈地图样低荧光，其间间杂少量点状高荧光区域。
3.4 FAF与其它多模影像相比
对疾病的不同评估价值
目前多模态眼底影像技术（包括FFA、ICGA、OCTA等）均为ARMD的诊断和治疗提供了可靠依据，但上述检查可能存在有创操作相关风险、操作时长久、对患者配合度要求高等局限性。FAF作为一种新近发展的眼底成像技术，具有非侵入、非接触、无损伤、检查时间短、易获取及可重复操作等优点，并能检测RPE功能和代谢情况[44]。眼底相机传感器和滤光片的改进提高了眼底相机的自发荧光质量，利用其敏感直观的成像准确性，可以发现那些以往难以发现的微小改变，而且能够对其进行量化测量，黄斑荧光团的FAF光谱在通过高光谱成像进行空间和分子精确识别方面具有极大挖掘潜力[45]。观察FAF的分布及其荧光强度有助于进一步明确ARMD的诊断、疗效及预后评价，这必将有助于对ARMD进行更加深入的研究[46]。若能结合CFP、OCT、FFA等临床常用检查将为ARMD的病情追踪和疗效评价提供更多信息[47]。
目前，FAF仍存在局限性：（1）同一种眼底疾病在不同的发展阶段可表现为形态及强弱不同的荧光团，而不同的眼底疾病可以表现为相同或相似的荧光团，因此，FAF技术还需要进行更多临床和实验研究来统一解读标准；（2）LF在RPE细胞内的不同分布或LF的组成可能会影响自身荧光的强度，这一生物学局限性需要在未来的研究中得到解决。
4 小结与展望
FAF可以观察ARMD不同阶段的病变差异，为ARMD的致病机制和进展提供重要信息，是临床医生早期检测、评估和监测ARMD的有效工具。近年来，拍摄获取图像和量化分析技术的改进使该技术在临床应用中的研究增加。识别早期视网膜变化或潜在疾病进展可以为研究人员和临床医生提供重要信息，以便开发新的治疗技术。未来将开展更多临床研究，以深入挖掘该技术的应用潜力。
文章来源：国际眼科杂志
