止血夹是什么材料【五分钟讲实验】原代肝细胞提取实验的干货分享

1. 实验材料

① 动物：健康的6-8周龄雄性C57BL/6小鼠

② 实验试剂：DMEM、胎牛血清

③ 实验器械：饭盒、纱布、剪子、镊子、烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。

2. 实验内容

2.1 实验前准备

①Medium:DMEM(10%FBS以及无血清的）。

②用鼠尾Ⅰ型胶原蛋白将细胞接种所需的孔板进行包被，乙酸溶液（0.006mol/L）：17.3μL乙酸+50mL无菌水，0.22μm过滤除菌，鼠尾Ⅰ型胶原蛋白（0.012mg/mL）：120μL鼠尾胶原蛋白（5mg/mL）+50mL乙酸溶液（6孔板鼠尾Ⅰ型胶原蛋白液体量：1580uL，100mm培养皿鼠尾Ⅰ型胶原蛋白液体量：9170μL）确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净工作台过夜晾干，也可以室温放置1h后，用PBS洗3-4次后直接使用。包被好的器皿放4℃可以保存3个月以上时间。

③10×PBS、Percoll：实验正式开始前配置1×PB和1×EB。

④在200mL1×EB中，加20mgⅠ型胶原酶，40μLCaCl2（2.5M）。

⑤实验正式开始前用75%酒精清洗灌流器5~10min，最后用无菌水清洗10min。

2.2 小鼠肝原代细胞提取

① 麻醉小鼠，用0.6%戊巴比妥钠，20g小鼠对应注射100μL。

② 用手术剪小心剪开小鼠腹部，暴露门静脉和下腔静脉，留置针插入下腔静脉，采用止血夹固定留置针，拔出钢针，留下灌流针的外套塑料针，连接输液器，再剪开肝门静脉，最后打开灌流器开始灌流，PB大概灌流120-150mL之后换为EB，大概灌流100mL

③ 小心剪下整个肝组织用无菌的PBS清洗一下实验正式开始前配置1×PB和1×EB。

④ 以下步骤在冰上操作，且液体用凉的，将肝组织转移到含无血清的DMEM培养基的培养皿中，将肝组织表面的膜撕开，轻轻吹散，过100目滤网到50mL离心管中离心50xg，1min，去上清液。

⑤ 加入无血清培养基至总体积5mL，转移到15mL离心管中0.48mL10×PBS+4.32mLpercoll混匀，转移到15mL离心管中与上述细胞液混匀离心，50xg，10min，弃上清及表面的悬浮物，下层沉淀即为活着的原代肝实质细胞。

⑥ 加入DMEM完全培养基（10%FBS+1%P/S），小心吹散细胞，细胞计数，接种包被好的6孔板，5×105cell/孔，在恒温培养箱中以37℃、5%CO2以及饱和湿度条件下培养，每2~3d换液一次，4h后换新鲜的培养基DMEM+10%FBS+1%P/S。