[摘要] 目的：探讨益气补肾口服液(YQBS)对体外肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)[1]的作用，并从免疫学角度初步探讨其作用机制。方法：采用不连续密度梯度离心法分离T淋巴细胞，观察YQBS对体外TIL培养后存活时间的影响;TIL体外杀伤活性的影响;TIL细胞形态学的变化。结果：YQBS明显延长TIL体外存活时间;对自体瘤细胞、K562细胞的杀伤活性均有显著增强;经细胞涂片和电镜观察，YQBS培养后1周左右，TIL明显增多。结论：YQBS具有明显的增加体外TIL数量和活性的作用，其抗肿瘤的作用可能与提高机体免疫能力有关。
[关键词] 益气补肾口服液;肿瘤;免疫
[中图分类号] `R285.5;R286.91
Effect of Yiqi Bushen oral liquid on Tumor-infiltrating lymphocytes in vitro
RUAN Ye-ping1， HU Xiu-min1，LIU Yu-xia2，LI Fan-zhu1
(1 Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053;
2 Third People’s Hospital in Hangzhou，Hangzhou 310009)
[Abstract] Objective: To study the effect of Yiqi Bushen oral liquid(YQBS)on tumor-infiltrating lymphocytes(TIL)in vitro and its related immunological Mechanism. Methods: Separation of T-lymphocyte by Discontinuous density gradient centrifugation，Observe the impaction of YQBS on survival of TIL .Results: YQBS could prolong survival time of TIL significantly;and Enhanced the Killing activity of Autologous on tumor cells and K562 cells;Moreover, the cell smear and electron microscopy analysis showed that，TIL growth increased significantly by culturing about one week. Conclusion: YQBS could increase the growth and the activity of TIL Notably，the mechanism of anti-tumor effects of YQBS might be related to the strengthened immunity function of mice.
[Key word] Yiqi Bushen oral liquid;tumor;immunity
益气补肾口服液(Yiqibushen Oral Solution，简称YQBS)根据肿瘤手术、化疗、放疗后正气亏虚之病机特点而组方，由黄芪、茯苓、女贞子、枸杞子、猪苓、莪术、半枝莲、等组成，具有明显的调节机体免疫功能的作用。我们已经研究表明，益气补肾口服液具有较好的体内抗肿瘤作用(另文报道)。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是一种新型高效的抗肿瘤效应细胞[1]。目前，文献报道多是用重组白细胞介素-2(IL-2)来诱导扩增和维持TIL的活性，在使用IL-2时有一些不良反应[2]，我们设想YQBS是否具有类似IL-2的作用，如果有，则可为YQBS抗肿瘤作用机制提供细胞免疫的依据。因此，本实验观察了YQBS对体外TIL的作用，并从免疫学角度初步探讨其作用机制，为YQBS的研究开发和临床应用提供实验依据。
材料与方法
1 实验材料
1.1药品与试剂
试验药物：益气补肾口服液一个处方量(黄芪20g、茯苓12g、女贞子12g、枸杞子12g、猪苓12g、莪术10g、半枝莲30g、藤梨根30g、生米仁30g、八月札10g、红枣30g、炙甘草6g)。将药放入锅中浸泡1h，加水煎煮1h，滤出药液，再加水煎煮30min，滤出合并药液将合并的药液浓缩煎至4.28g/1ml、2.14g/1ml、1.07g/1ml三个浓度，分别作为高、中、低3个剂量组的给药浓度。
三根祛瘤方，杭州市中医院制剂室提供，生药浓度1g/ml。
MTT试剂盒由日本东京仁成工业株式会社生产，批号为1313b11;重组白细胞介素-2，10万IU/支 ，沈阳康利制药厂生产,批号：20060605。;淋巴细胞分离液由上海试剂二厂生产，批号为20060206;台盼蓝由Sigma公司生产 批号为117H5001。
1.2实验动物
健康昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半;BALB/C纯系雄性小鼠，体重22±2g，浙江中医药大学实验动物中心提供。合格证号：SK-2004006，全部动物饲养于浙江中医药大学实验动物中心SPF级实验动物房，室温24℃±2℃，相对湿度65%±5%，动物饲养以全价营养颗粒饲料，自由饮食及饮水。实验前先喂养1周为适应期。
1.3细胞株
人红白血病K562,浙江省中医院血液病研究室提供。
自体瘤细胞，恶性胸水(浙江省肿瘤医院提供)中分离，传代培养。
2 实验方法
2.1 不连续密度梯度离心法分离T淋巴细胞
取新鲜抗凝胸水， 1500rpm，10min离心弃大部分上清液，得细胞悬液。取比重1.077淋巴细胞分离液3ml于刻度离心管底部，再慢慢重叠加比重1.055分离液3ml，将胸水细胞悬液3ml置于1.055分离液上面。2000prm，20min离心，在不同液面即可获得较纯得TIL细胞和自体瘤细胞。Hanks液洗2次，细胞计数。
2.2 人TIL经益气补肾口服液体外培养后存活时间的测定[3，4]
取病人抗凝胸水分离TIL及自体瘤细胞，后者传代培养。TIL配成1×106/ml，取10ml培养瓶，分别加入促增殖最佳浓度的益气补肾口服液和三根祛瘤方的提取液和完全培养基(TCM含10%AB血清)2ml/瓶，及TIL悬液1ml/瓶，各3复瓶。37℃、5%CO2的培养箱中培养，根据细胞生长情况换液，观察TIL存活时间长短。
2.3 TIL体外杀伤活性的测定[5，6]
先用正常人周围血淋巴细胞(PBL)及K562(1×105/ml)分别作为效应细胞和靶细胞，采用不同效靶比12﹕1、25﹕1、50﹕1、100﹕1，各100µl混合培养。按前述方法分离胸水中TIL，配成1×106/ml，分别装于培养瓶中，每组3瓶，于接种TIL同时给药：1000IU/ml rIL-2组，125µg/ml益气补肾口服液组，125µg/ml益气补肾口服液+1000IU/ml rIL-2组，32µg/ml三根祛瘤方组，32µg/ml三根祛瘤方+1000IU/ml rIL-2组。设靶细胞对照孔，效应细胞对照孔，空白调零孔，各3复孔。采用MTT比色法在酶标仪上(λ=570nm)测定各孔OD(光密度)值，计算杀伤活性。
2.4 细胞形态学观察
于培养前后离心收集矢量细胞，涂片，自然晾干后，HE染色，通过纯二甲苯两次，中性树胶封存，进行细胞形态学观察并拍照;透射电镜检查，将各药培养24h后的细胞离心(勿用力吹打)约火柴头大小细胞团，缓慢滴入2.5%戊二醛，静置固定。取出凝块切成1mm3小块，缓冲液漂洗、1%锇酸后固定，逐级上升的酒精、丙酮脱水，环氧树脂包埋剂渗透、包埋、聚合。切片，醋酸铀和枸橼酸铅双色染色后，透视电镜观察。
3 统计学处理
所有实验数据以SPSS软件处理，结果以平均值±标准差(`x±s)表示。
结 果
1 人TIL经益气补肾口服液体外培养后存活时间的测定
125µg/mlYQBS与32µg/ml三根祛瘤方提取液的TIL生长情况尚佳，存活时间>17天，与不用药组培养的TIL(7±1天)比较，明显延长，见图1。
2 TIL体外杀伤活性的改变
新分离的人TIL对自体瘤及K562细胞杀伤活性均很低，分别为6.73±1.14%和7.15±1.36%，两者无显著差异(“P>0.05”)，各药培养后有活性增强的趋势。与培养前相比，无论是对自体瘤细胞还是对K562细胞的杀伤活性均有显著增强(“P<0.05”)，尤其是rIL-2、三根祛瘤方提取液培养后TIL对自身瘤细胞的细胞毒性活性明显增强(“P<0.01”)，但并未显示出很强的特异性，与对K562细胞活性相比，无明显差异(“P>0.05”)，而且，在短期内(10-17天)用rIL-2培养的TIL细胞毒活性与另外两组相比，无显著差异(“P>0.05”)。见表1。
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