郭兆安 孟凡辰 于春江
[摘要] 意图 调查芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏结构和功用的影响。 办法 48只清洁级雄性Wistar大鼠按体重随机抽取40只，选用切除右肾加腹腔打针链脲佐菌素（STZ）的办法制备DN模型，造模成功后按24hTP凹凸，两端随机抽取分为模型组、缬沙坦对照组、芪蛭降糖胶囊低剂量组、芪蛭降糖胶囊高剂量组。另取8只大鼠行右肾假切术，腹腔打针等量柠檬酸缓冲液作为假手术组。成模2d起各组给予相应浓度和剂量的药物，给药12周时调查DN大鼠24h尿蛋白定量（24hUPQ）、α1微球蛋白（α1-MG）、β2-微球蛋白（β2-MG）和血糖（BS）、血清肌酐（Scr）、血清胱抑素-C（Cystatin-C）的改动；测定血浆血管严峻素Ⅱ（AngⅡ）、内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）；留取标本后处死一切动物，肾安排行HE染色、PAS染色、免疫组化染色，光镜下调查肾安排病变，PAS染色核算肾小球硬化指数（GSI）、肾间质纤维化指数（IF），电镜调查肾小球毛细血管超微结构；免疫组化检测肾安排转化生长因子（TGF）-β1的表达。 成果 12周后，模型组大鼠24hUPQ、α1-MG、β2-MG较假手术组显着增多（P<0.01），3个医治组DN大鼠的24hUPQ、α1-MG、β2-MG较模型组显着削减（P<0.01），2个中药医治组较对照组也显着削减（P<0.05～0.01），且呈剂量依赖性；模型组大鼠BS、Scr、Cystatin-C亦较假手术组显着升高（P<0.01），2个中药医治组较模型组也显着下降（P<0.05～0.01），对照组BS与模型组比较无显着改动（P>0.05）。3个医治组血浆AngⅡ、ET-1较模型组显着下降、NO显着升高（P<0.05～0.01）。HE染色显现，2个中药医治组大鼠肾安排病理危害显着减轻，PAS染色显现2个中药医治组大鼠肾安排GSI、IF显着减轻（P<0.01）。电镜调查显现，2个中药医治组DN大鼠肾小球基底膜增厚和系膜增生、足细胞足突交融减轻。免疫组化查看显现2个中药医治组DN大鼠肾安排TGF-β1的表达显着下调（P<0.01）。 定论 芪蛭降糖胶囊经过按捺AngⅡ的排泄，减轻血管内皮危害，下调TGF-β1在肾安排的表达，减轻肾小球硬化和肾间质纤维化，改进肾安排病理危害，然后对DN起到医治效果。
[关键词] 糖尿病肾病；芪蛭降糖胶囊；转化生长因子-β1；血管内皮危害
[中图分类号] R277.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）01-31-06
[Abstrac] Objective To study effect of Qizhi Jiangtang Capsule （QJC） on renal structure and function of kedney in DN rats. Methods 48 male Wistar rats were randomLy divided into 5 groups（n=8）： the sham operation group，the model group，Valsartan group （control group）， the low-dosage of QJC group （low dosage group） and high dosage of QJC group （high dosage group）. Except the rats in the sham operation group，the other rats were established DN animal model by removal of the right kidney with intraperitoneal injection of STZ.Medicine was given to each group according to the designed concentration and dosage from 2 days of the model established. 24hUPQ， α1-microglobulin（α1-MG），β2- microglobulin（β2-MG）and serum creatinine（Scr）， Cystatin-C of DN rats were observed at 12th week. AngⅡ、ET-1 and NO were detected ，too. The kidney tissues was stained respectively by HE，PAS and immunohistochemical.Histological change in the kidney tissues was observed by HE stain. GSI and IF were calculated by PAS stain.Glomerular capillary ultrastructure was observed by electron microscopy. The expression of TGF-β1 was detected by immunohistochemical. Results At 12th week ， compared with the sham group， 24hUPQ、α1-MG、β2-MG of model group were significantly raised（P<0.01）. These indicators of 3 treated groups rats were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the control group，the above contents of 2 groups of QJC were obviously decreased （P<0.05-0.01），and dose-dependent manner. BS、Scr、Cystatin-C of the model group were also significantly raised（P<0.01）at same time.To compared with the control group，these indicators of 2 groups of QJC were obviously decreased （P<0.05-0.01）， BS of the control group was shown no significant change（P>0.05）. To compared with the control group，AngⅡ、ET-1 of 3 treated groups rats were significantly reduced（P<0.01）， NO were significantly raised（P<0.01）. HE staining showed that renal pathological damage were lessened by QJC. PAS stain showed that GSI、IF were significantly lessened in 2 traditional Chinese medicine treatment groups（P<0.01）.Electron microscopy observations show that thickening of glomerular basement membrane and mesangium hyperplasia were reduced by QJC， podocyte foot process fusion reduced. Immunohistochemical tests show that the expression of renal tissueTGF-β1 were down-regulated by QJC（P<0.01）. Conclusion Through secretion of AngⅡ was suppressed， vascular endothelial damage reduced，the expression of TGF-β1 in the renal tissues were down-regulated， structure and function of kidney tissues improved， DN is treated by QJC.
[Key words] Diabetic nephropathies； Qizhi Jiangtang Capsule； Transforming growth factor -β1；Vascular lesions
糖尿病肾病（DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的首位[1]及严峻并发症之一，也是导致缓慢肾功用衰竭（chronic renal failure，CRF）的常见病因。临床研讨标明[2-3]，芪蛭降糖胶囊不仅能显着下降DNⅢ期患者的尿mALB及mALB/Ucr，也能下降Ⅳ期患者的很多蛋白尿，安稳肾功用。试验研讨标明[4-6]，芪蛭降糖胶囊能够经过下调肾安排中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、MCP-1 mRNA的表达，下降大鼠肾本质小动脉内膜/中膜厚度比，还能够经过按捺DN大鼠肾安排中VEGF的过度组成和堆积、减轻ECM在肾安排中的积累，然后减轻DN大鼠肾安排和血管结构病理危害；经过干涉BMP-7/Smads/TGF-β1信号转导通路按捺了TGF-β1信号的细胞内转导，对DN大鼠肾间质纤维化起到医治效果。其发病机制触及遗传、糖代谢紊乱、炎症介质、细胞因子、血流动力学改动等多种要素环节。为进一步评论芪蛭降糖胶囊医治DN的的效果机理，本研讨用右肾切除加腹腔打针链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）的办法制备大鼠DN模型，用芪蛭降糖胶囊医治，以缬沙坦为对照，调查芪蛭降糖胶囊对DN大鼠肾脏结构和功用的影响，共调查12周。
1 资料与办法
1.1 试验动物及试剂
清洁级雄性Wistar大鼠48只，6～7周龄，体重（180±20）g，购于山东中医药大学动物试验中心。STZ（美国Sigma）、TGF-β1兔抗大鼠一抗多克隆抗体，通用型免疫组化试剂盒二抗，武汉博士德公司出产。芪蛭降糖胶囊，主要成分黄芪、水蛭、地黄、黄精，（吉林一正药业集团有限公司，Z10950116）。缬沙坦胶囊（代文），（北京诺华制药有限公司，H20040217）。
1.2 DN模型树立与分组
适应性养殖1周后，将48只Wistar大鼠按体重随机取40只，选用右肾切除加腹腔打针STZ60mg/kg（STZ溶于10mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5，依照6mL/kg打针）的办法树立DN模型。DN大鼠造模成功条件为：空腹血糖≥13.9mmol/L， 24h尿蛋白定量（24 huors urine protein quantitative，24hUPQ）≥30mg。依照24hUPQ凹凸排序，两端抽取随机分为模型组、缬沙坦组（简称对照组）、芪蛭降糖胶囊低剂量组（简称低剂量组）、芪蛭降糖胶囊高剂量组（简称高剂量组）。另取8只正常大鼠行右肾假切除术，腹腔打针等量柠檬酸缓冲液作为假手术组。假手术组除不切除右肾外，余进程与模型组相同。
1.3 给药
成模2d后按《试验动物学》依据大鼠体表面积核算给药量。假手术组、模型组给予生理盐水3mL灌胃，对照组给予缬沙坦28.8mg/（kg·d）（相当于成人用量的4倍）灌胃，低剂量组给予芪蛭降糖胶囊1.35g/（kg·d）（相当于成人用量的2倍）灌胃、高剂量组给予芪蛭降糖胶囊4.05g/（kg·d）（相当于成人用量的6倍）灌胃。将药物别离去其外包装，用生理盐水3mL稀释，一切大鼠在试验期间均自在摄食饮水，不运用胰岛素和其他降糖药。
1.4 调查目标和标本的搜集与制备
试验调查12周（即试验完毕）时，将DN大鼠进行尿液查看、血液查看、肾安排的搜集与病理调查。
1.4.1 尿液检测 将大鼠放入单只代谢笼，禁食，给予足够饮水，搜集24h尿液，测定24UPQ，并检测尿α1-MG、β2-MG。
1.4.2 血液检测 腹腔打针10%水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉取血3mL，别离血清，由生化室测定BS、Scr、Cystatin-C，核医学科用放免法严厉依照试剂盒阐明书操作测定AngⅡ、ET-1、NO。
1.4.3 肾安排查看 麻醉取血后，快速切取左边肾脏，剥离包膜，沿纵轴切开，一侧液氮冻存，用于免疫组化剖析；另一侧以10%福尔马林固定24h后，用70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯通明，白腊包埋，每一安排蜡块接连4μm切片六张，HE染色行惯例光学显微镜调查、摄影，PAS染色调查肾小球和小管间质病理改动，别离选用Caij等半定量办法评价肾小球硬化指数（GSI）和间质纤维化指数（IF），半定量剖析评价肾小球和小管间质病理改动。另取部分皮质固定，Epon812包埋，切片沿轴两层染色后，透射电镜调查。
1.4.4 免疫组化染色 选用免疫组化法检测TGF-β1的表达。用Qwin550CW型图画信号搜集与剖析体系进行灰度值丈量。高倍镜下（400倍）每张切片别离取2个视界，每个视界面积约为0.1mm2。丈量时每个视界随机丈量4个随机面积内阳性染色的灰度值。每个调查目标在同一样本中制造2张切片。免疫组化成果判别：呈现黄褐色反应为阳性，相同部位不呈现黄色反应为阴性。依据显色强度和阳性细胞数两项目标判别阳性等级。按显色强度分为：无色、黄色、浅黄色、黄褐色。调查各目标是否胞浆表达。
1.5 统计学办法
各组数据均选用SPSS13.0软件进行处理，以（）标明，组间比较选用方差齐性查验。
2 成果
2.1 各组大鼠一般状况
因麻醉过度，逝世1只大鼠，灌胃期间，模型组逝世1只，余大鼠均无逝世。试验期间模型组大鼠皮裘疏松，暗淡无光，精力萎靡，活动缓慢，食量削减，体重减轻。其他3个医治组大鼠皮裘、精力、活动及饮食均好于模型组，高剂量组大鼠各方面状况挨近假手术组大鼠。
2.2 各组大鼠尿液24hUPQ、α1-MG和β2-MG的比较
试验12周时，模型组大鼠24hUPQ、α1-MG和β2-MG均较假手术组显着升高（P<0.01），对照组、低剂量组、高剂量组均低于模型组（P<0.01），并且三组顺次下降，组间比较有统计学差异（P<0.05）。见表1。
2.3 各组大鼠BS、Scr、Cystatin-C的比较
在试验12周末，模型组大鼠BS、Scr、Cystatin-C均较假手术组显着升高（P<0.01），对照组Scr较模型组显着下降（P<0.01），而BS、Scr、Cystatin-C较模型组下降不显着（P>0.05），低剂量组、高剂量组均显着低于模型组（P<0.01），高剂量组与低剂量组比较也有差异（P<0.05）。见表1。
2.4 各组大鼠血浆AngⅡ、ET-1、NO的比较
试验停止时，模型组AngⅡ、ET-1显着高于假手术组、NO显着低于假手术组（P<0.01）。3个医治组和模型组比较，AngⅡ、ET-1显着下降，NO显着升高（P<0.01）。和对照组比较，低剂量组AngⅡ显着偏高（P<0.05），ET-1、NO无显着差异（P>0.05）；和低剂量组比较，高剂量组AngⅡ、ET-1显着下降（P<0.05）。见表2。
2.5 各组大鼠肾脏安排学改动
2.5.1 HE染色 假手术组肾安排结构正常，模型组大鼠与假手术组比较，肾小球肥壮，部分肾小球萎缩，GBM充满增厚，毛细血管扩张，系膜基质增生显着，肾小管管腔扩张显着，上皮细胞摆放紊乱，并有坏死掉落，球囊粘连现象较显着，纤维化程度高。对照组和低剂量组病变有所减轻，高剂量组肾小球肥壮显着减轻，部分系膜基质增生、基底膜增厚，但程度显着减轻，部分肾小管扩张，肾小管修正现象显着。见图1。
2.5.2 PAS染色 模型组大鼠肾小球毛细血管腔狭
2.5.3 电镜 假手术组大鼠肾安排结构明晰，无显着病理改动。模型组GBM均质性增厚，外疏松层、细密层和内疏松层分层错杂，系膜基质增多显着，系膜细胞增生积累处可见小结节团块状，内皮细胞之间窗孔空隙变大，内皮细胞增生显着，足细胞足突广泛交融，肾小囊可见玻璃滴状病变。对照组和低剂量组病变较模型组轻，高剂量组GBM略增厚，三层滤过膜散布明晰，系膜基质轻度增生，内皮细胞之间窗孔空隙未见显着扩展，足细胞足突交融不显着，肾小囊无玻璃滴状病变。见图3。
2.5.4 各组大鼠肾安排TGF-β1的表达 假手术组上色最浅，阐明TGF-β1蛋白表达很少。DN模型组大鼠肾安排TGF-β1蛋白呈强阳性表达，表现为黄褐色颗粒状堆积，上色较深，较假手术组显着增强，两组间的灰度值具有显着性差异（P<0.01）。对照组、低剂量组、高剂量组大鼠肾安排的上色逐步变浅，TGF-β1表达逐步削弱，各医治组与模型组间灰度值差异具有统计学含义（P<0.05），低剂量组与对照组间、高剂量组与低剂量组间灰度值有显着差异（P<0.05）。见图4、表2。
3 评论
糖尿病发病机制中，AngⅡ能够经过血流动力学和非血流动力学发作两层效果[7]，经过多种途径诱导肾小球GBM中Ⅳ型胶原蛋白组成。动物试验已证明尿蛋白水平与肾脏进行性危害的开展速度呈正相关，这种危害表现为巨噬细胞滋润和细胞外基质的堆积，终究可导致肾小球的硬化[8]。AngⅡ还可经过非血流动力学效应直接介导肾脏细胞增生以及诱导细胞组成排泄TGF、肿瘤坏死因子、血小板源性生长因子、ET、白细胞介素[9]和血小板活化因子。这些细胞因子在DN中的效果触及肾小球血流动力学改动、细胞外基质代谢、细胞增生和细胞肥壮等。有研讨[10]标明高糖诱导培育的内皮细胞Ang-Ⅱ表达上调，Ya-mamoto等[11]也发现2～3周的STZ糖尿病小鼠肾脏Ang-Ⅱ蛋白表达上调，这与咱们的试验成果相一致，提示在糖尿病肾脏存在Ang-Ⅱ反常表达，AngⅡ导致TGF-β1表达显着添加，影响氧自在基及细胞因子的开释，按捺细胞增殖，介导细胞凋亡[12]。TGF-β1直接和直接的上皮-间充质转分化（EMT）效果可使上皮细胞转化为成纤维细胞表型，然后具有了发作ECM的才能，参加了肾纤维化进程。经过干涉DN状态下的TGF-β1升高，阻断其信号转导可按捺肾脏纤维化[13]。
血管内皮细胞功用危害是DN发作开展的重要病理根底。血管内皮危害表现为血管缩短与舒张功用失调。NO是内皮细胞开释的有用的血管扩张剂，在坚持血管稳态上起关键效果。NO能够调理血管内皮细胞排泄组成ET的生理效果，ET除效果于血管平滑肌细胞膜上的ETA受体引起血管缩短外，一起还效果于血管内皮细胞上的ETB受体，影响NOS添加NO的组成，然后负反馈地按捺ET缩短肾脏血管的效果。NO的开释削减或活性下降可能是血管功用障碍和动脉粥样硬化构成的原因之一[14]。ET-1是唯一被以为系内皮细胞根底排泄的内皮素，也是现在已知效果最强和耐久的缩血管物质[15]。DN前期，ET-1表达下调参加了肾小球高滤过和高灌注的构成[16]。跟着DN的开展，糖基化终末产品、TGF-β1等添加则促进了ET-1的添加，加快DN开展[17]。肾脏既是ET组成代谢的重要场所，又是其主要的靶器官，因而血浆ET水平可反映肾脏受损的严峻程度。
芪蛭降糖胶囊具有益气养阴、活血通络的成效。中医关于消渴、水肿的研讨也有着丰厚的经历，但是有用的中成药在临床中很少被证明，DNⅢ期和Ⅳ期以气阴两虚、瘀血阻络为根本病机，而芪蛭降糖胶囊正是针对此病机而组方，黄芪补气健脾，利尿消肿，水蛭逐瘀消徵，黄精与黄芪配伍，加强黄芪补气养阴的效果，一起能补益肾精，生地黄既能清热养阴，又能生津止渴，标本同治。本研讨用右肾切除加腹腔打针STZ的办法仿制DN大鼠动物模型，芪蛭降糖胶囊医治后，DN大鼠血浆AngⅡ排泄显着削减，ET-1、NO改进，肾安排TGF-β1表达显着下调，GSI、IF显着下降，肾功用安稳，尿24hUPQ、α1-MG和β2-MG排泄削减，标明芪蛭降糖胶囊经过按捺AngⅡ排泄、维护血管内皮细胞、下调肾脏安排TGF-β1表达，而起到医治DN的效果。
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（收稿日期：2014-10-15）
