crp用什么仪器检测具核梭杆菌脂多糖诱导THP

1.1.1 菌株

A. muciniphila BNCC 341917 (DSM22959)、Escherichia coli ATCC 25922由本实验室保存；F. nucleatum ATCC 25586，上海交通大学附属仁济医院洪洁教授惠赠。

1.1.2 细胞株

THP-1细胞株购自中国科学院细胞库。

1.1.3 主要试剂和仪器

RPMI-1640培养基、磷酸缓冲液(PBS)，HyClone公司；胎牛血清，BI公司；佛波肉豆蔻醋酸(Phorbol Myristate Acetate，PMA)、Hieff UNICON^® qPCR SYBR Green Master Mix、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒，翌圣生物科技(上海)股份有限公司；IFN-γ，北京达科为生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒，广州美基生物科技有限公司；FastKing cDNA第一链合成试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；TureColor三色预染蛋白Marker，生工生物工程(上海)股份有限公司；LPS提取试剂盒，iNtRON Biotechnology公司；Trypsin-EDTA (0.25%)，Gibco公司；IL-6、IL-10检测试剂盒，爱必信(上海)生物科技有限公司；CRP检测试剂盒，Novus Biologicals公司。多功能酶标仪，Tecan公司；荧光定量PCR仪，ThermoFisher公司；荧光正置显微镜，蔡司公司；微孔板成像检测系统，PerkinElmer公司。

1.2.1 菌株培养

A. muciniphila采用BHI培养基(+4%瘤胃液)在85% N₂、5% CO₂、10% H₂、37 ℃厌氧培养；E. coli ATCC 25922采用LB培养基在37 ℃有氧培养；F. nucleatum采用BHI培养基在85% N₂、5% CO₂、10% H₂、37 ℃厌氧培养。

1.2.2 细胞培养

THP-1细胞采用含10%胎牛血清、0.05 mmol/L的β-巯基乙醇的RPMI-1640培养基培养。细胞在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞传代、细胞冻存等实验操作按照常规方法进行。

1.2.3 脂多糖的提取和电泳分析

(1) 收集培养至OD₆₀₀为0.8−1.0左右的菌体，按照LPS提取试剂盒的说明书操作，干燥、称重后溶于10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)。

(2) LPS经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色等检测后，采用相应的细胞培养液稀释至指定浓度，用于后续细胞实验。

(3) SDS-PAGE分析、银染按文献[]报道方法进行。

1.2.4 LPS处理THP-1细胞贴壁及形态观察

设置96孔板中THP-1细胞密度为5 000个/孔，分别用终浓度为0、0.01、0.1、1、10、20、40 μg/mL的LPS处理1 h后，弃上清，用培养基温和冲洗3次，用显微镜观察拍照、计数，4 h后再次观察并计数。

THP-1细胞贴壁：采用10 ng/mL PMA处理细胞24 h后，用于后续实验。

贴壁的THP-1细胞分别用20 μg/mL的3种LPS进行单独或联合IFN-γ (20 ng/mL)处理，采用微孔板成像检测系统观察各实验组、对照组的细胞形态变化，每3 h拍照一次，连续观察24 h。

1.2.5 总RNA提取、反转录、定量PCR检测

贴壁THP-1细胞分别用20 μg/mL的3种LPS处理3 h后，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，具体操作按说明书进行。然后以500 ng总RNA为模板进行反转录(FastKing cDNA第一链合成试剂盒)后，进行定量PCR (Hieff UNICON^® qPCR SYBR Green Master Mix)，GAPDH (内参)等基因qPCR引物采用Primer 3网站设计，由擎科公司合成，引物序列见。qPCR反应体系(20 µL)：模板DNA 0.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Hieff UNICON^® qPCR SYBR Green Master Mix (25 μmol/L) 10 μL，ddH₂O补足20 μL。qPCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；最后进行溶解曲线分析。采用2^−ΔΔCt进行表达相对定量。

1.2.6 ELISA检测炎症细胞因子IL-6、IL10、CRP

THP-1细胞以每孔5×10⁵个细胞/mL密度加入24孔板，PMA处理贴壁后，换成5%胎牛血清培养基，用20 μg/mL LPS (或联合20 ng/mL IFN-γ)处理24 h。

培养液4 ℃、3 000 r/min离心10 min后，上清用ELISA分别检测IL-6、IL-10和CRP，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.7 统计学分析

结果为3次独立实验的平均值，采用GraphPad 8.4.0的ANOVA方差分析进行统计分析，P < 0.05时认为差异有统计学意义。

2.4.1 3种LPS对PMA处理前后THP-1细胞TLR家族、白介素家族部分基因表达的影响

A. muciniphila、E. coli、F. nucleatum LPS直接处理THP-1细胞3 h，IL-6表达分别显著上调700.8% (P=0.039 5)、1 378.0% (P=0.000 4)和782.9% (P=0.003 1)；但未检测到TLR3、TLR4和IL-10的表达()。

贴壁THP-1细胞用相同浓度A. muciniphila、E. coli、F. nucleatum LPS处理，IL-6分别上调17 763.2% (P < 0.001)、35 458.2% (P < 0.001)、1 123.6% (P > 0.05)；TLR3分别下调了32.3% (P=0.044 7)、311.5% (P=0.001 9)、9.6% (P > 0.05)；TLR4分别下调35.1% (P > 0.05)、17.0% (P > 0.05)和10.3% (P > 0.05)；IL-10分别显著上调729.3% (P < 0.001)、1 223.3% (P < 0.001)、124.4% (P > 0.05) ()，上述数据表明M0细胞对LPS敏感性显著上升，同时，显示不同LPS作用呈现显著差异。

2.4.2 LPS对贴壁THP-1细胞巨噬细胞表面标志基因表达的影响

贴壁THP-1用3种LPS处理后，检测巨噬细胞标志基因表达发现，A. muciniphila、E. coli、F. nucleatum LPS分别略微下调M0标志基因表达(均无统计学意义)；M1标志基因中：CD40分别上调5 011.0% (P < 0.001)、6 048.9% (P < 0.001)和1 011.6% (P=0.009 4)，CD86分别上调637.3% (P < 0.001)、657.9% (P < 0.001)和194.1% (P > 0.05)；M2标志基因中：CD163分别下调39.5% (P=0.001 1)、53.7% (P < 0.001)和5.9% (P > 0.05)，CD206分别下调18.6% (P > 0.05)、88.4% (P=0.005 5)和24.8% (P > 0.05)，详见。