高尿酸血症是一种常见的生化异常，由过量的尿酸盐生成和（或）排泄肾脏尿酸减少引起[1]。高尿酸血症与高血压、高血脂、动脉粥样硬化等疾病发展之间存在密切关联，是严重影响人类健康的疾病[2-5]。血清尿酸的水平的升高，会破坏机体抗氧化能力，影响机体清除自由基的效果。研究表明，高尿酸血症导致患者体内血清脂质过氧化物水平升高，抑制抗氧化酶活力，升高炎症因子表达水平[6]。炎症因子C反应蛋白（CRP）是一种具有代表性的急性期反应蛋白，在炎症中有较高的表达[7]。高尿酸水平下的氧化应激可引起其他系列疾病的发生，多种疾病的病理过程与氧化应激紧密相关，同时以“第二信使”身份在炎症反应中发挥着关键作用[8]。高尿酸血症与肾脏疾病关系密切且互为因果，高尿酸血症可以促进肾脏疾病的发展，而肾脏疾病会进一步影响高尿酸血症[9]。肾脏中尿酸的排泄和尿酸盐转运体1（URAT1）蛋白等一系列多种尿酸转运蛋白密切相关，URAT1在近曲肾小管上皮细胞表面表达，参与尿酸从肾脏转移转运，以及运输到血液的基本过程，是改善血尿酸水平的重要蛋白和重要检测指标[10]。
盐酸小檗碱又称黄连素，由毛茛科黄连等植物中提取出来的有效活性生物碱。小檗碱在抗炎和抗氧化机制等方面有显著作用，加上其不良反应和毒性作用小，价格便宜，在疾病治疗中有着的广泛用处。其抗炎机制包含多个方面，主要是通过减少炎症因子的生成、降低炎症因子的活性来达到针对性抗炎目的[11-12]。其抗氧化作用则是通过减少活性氧的生成、增强抗氧化酶的活性、清除氧自由基、减轻脂质过氧化反应等多种途径来实现药物的治疗效果[13]。减少尿酸的生成和增加尿酸的代谢是治疗高尿酸血症的关键，但由高尿酸血症引发的体内微炎症与氧化应激的损伤也不可忽视，因此继续探寻新的治疗药物，在降低尿酸的同时能逐步改善机体炎症因子的表达，提高机体抗氧化能力显得至关重要。目前研究证明，小檗碱通过扩张血管、改善血流循环和改善胰岛素抵抗状态使尿酸水平得到降低[14-15]。但小檗碱是否对高尿酸血症引起的微炎症和氧化应激的肾脏破坏具有保护改善效应，如今鲜有报道。本研究以高尿酸血症小鼠为实验对象与模型，常见的临床治疗药物苯溴马隆作为阳性对照进行对比研究，通过观察小檗碱对高尿酸血症小鼠体内尿酸和肌酐（Cr）水平，URAT1蛋白的表达，肾脏组织切片以及血清炎症因子水平和氧化应激指标的影响，从抗炎、抗氧化的角度探讨其可能的治疗机制，旨在进一步探究小檗碱降尿酸的具体药理作用，为临床研究提供理论依据。
1材料
1.1动物
60只1月龄SFP级雄性昆明种（KM）小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK（湘）2019-0004，体质量18～25 g。在长沙医学院动物实验室进行分笼饲养，同时允许小鼠自由进食和自由饮水，小鼠适应环境7 d，饲养环境为自然条件的光照，通风情况良好，室温（23±2）℃，相对湿度保持在50%～70%。本研究所有试验操作和步骤均通过长沙医学院医学伦理委员会审核（受理编号2021032）。
1.2试剂与仪器
小檗碱（阿拉丁公司，质量分数：纯度：98%批号B832494）；氧嗪酸钾（麦克林公司，批号P831461）；次黄嘌呤（麦克林公司，批号H81107）；羧甲基纤维素钠（麦克林公司，批号C804626）；苯溴马隆（麦克林公司，批号B838527）；苏木素–伊红染色液（HE，Wexis公司）；CRP试剂盒（伊莱 瑞特，批号E-EL-M0053c）；丙二醛（MDA）试剂盒（伊莱瑞特，批号E-EL-0060c）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒（伊莱瑞特，批号E-BC-K020-M）。
生物组织摊烤片机（武汉俊杰电子有限公司）；酶标仪（ELX800）；电泳仪电源（北京六一生物科技有限公司）；双垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。
2方法
2.1动物模型的建立、分组及给药
将KM小鼠随机分为对照组、模型组、苯溴马隆组及小檗碱50、100、200 mg/kg组，每组10只。参考文献造模方法[16]，除对照组ig等量蒸馏水外，其余各组采用ig氧嗪酸钾和次黄嘌呤药物建立高尿酸血症小鼠模型，其中次黄嘌呤300 mg/kg、氧嗪酸钾250 mg/kg，用3 g/L的羧甲基纤维素钠溶液作为溶媒，配制成对应剂量的混悬液。ig体积均为0.1 mL/10 g，1次/d，共7 d。共48只KM小鼠造模成功，将建模成功的小鼠随机分为6组，每组8只。
实验期间所有小鼠均正常饮食，避免偶然性。从第8天起，每天19:00～20:00时定时进行给药干预，苯溴马隆组ip给予20 mg/kg苯溴马隆，小檗碱各剂量组分别ig 50、100、200 mg/kg小檗碱，对照组和模型组ip等剂量生理盐水，各组均连续给药1周。
2.2生化指标检测
在实验的第14天，末次给药后，将小鼠麻醉后取血至1.5 mL离心管中，室温静置1～2 h后，离心机3 500 r/min、4 ℃离心10 min，取上清，按照实验试剂盒说明书方法检测血清尿酸、Cr水平。
2.3ELISA法检测小鼠CRP水平
在实验的第14天，末次给药后，将小鼠麻醉后 取小鼠静脉血至1.5 mL离心管中，室温静置1～2 h后3 500 r/min、4 ℃离心10 min，取表面上清液，ELISA法检测小鼠血清中CRP水平，具体操作参考试剂盒生产商家说明书。
2.4小鼠肾脏组织HE染色
取两肾脏，其中一肾置于10 %中性福尔马林溶液中固定24 h后进行脱水、浸蜡和包埋，切片（4 μm），按照HE染色步骤操作，进行组织切片HE染色，显微镜观察肾脏病理改变。
2.5肾脏组织MDA含量和SOD活性的测定
取小鼠左侧新鲜肾脏组织，按照一定的比例研磨制备成肾脏匀浆液，4 ℃条件下用低温高速离心机进行离心（3 500 r/min），取实验上清液检测小鼠肾脏组织中MDA含量与SOD活性。
2.6Western blotting检验肾脏组织样本中URAT1蛋白表达水平
取保存好的适当小鼠肾脏组织，RIPA法对小鼠肾脏组织蛋白提取，BCA法对蛋白进行定量及处理。配制分离胶和5 %浓缩胶。上样，计算20～80 μg蛋白的溶液体积；电泳：浓缩胶电压为80 V，40 min，分离胶电压120 V，30～50 min。溴酚蓝跑至胶底即可终止电泳，进行转膜，切PVDF膜，快速转膜仪转膜；封闭：将PVDF膜完全浸没在5% BSA-PBST中，4 ℃过夜：一抗孵育（用5% BSA-PBST稀释，4 ℃孵育过夜）；次日取出PVDF膜，PBST洗膜；再进行二抗孵育（PBST稀释二抗，室温孵育60 min）；再次洗膜；显影：ECL A和B液按体积1∶1混合后均匀滴加在膜上，开始曝光，曝光结束后保存图片，利用Image J图像分析软件进行相关灰度分析，用URAT1与GAPDH的灰度值比值观察目的蛋白相对表达水平。
2.7统计学分析
运用SPSS 24.0软件对数据采用One-way ANOVA法分析是否有显著性差异，以`x± s 表示。
3结果
3.1小檗碱对小鼠血清尿酸、Cr水平的影响
与对照组相比，模型组小鼠血清尿酸和Cr水平显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，苯溴马隆组小鼠血清尿酸和Cr水平显著降低（P＜0.05），小檗碱50、100、200 mg/kg组均能显著降低血清尿酸和Cr水平（P＜0.05），且呈剂量相关性，见表1。
3.2小檗碱对小鼠血清CRP水平的影响
与对照组相比，模型组小鼠血清CRP水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，苯溴马隆组、小檗碱各剂量组CRP水平显著降低（P＜0.01），且小檗碱组血清CRP水平呈剂量相关性，见图1。
3.3小檗碱对小鼠肾脏病理组织的影响
小鼠肾脏HE染色结果提示，对照组保持正常的肾脏组织结构，未见明显肾脏的病理学变化。模型组出现肾小管扩张坏死，肾小球损伤的病理性变化。与模型组相比，小檗碱各剂量组肾脏病理性改变的程度均有所缓解。而小檗碱100、200 mg/kg组与苯溴马隆组比较无明显差异，见图2。
3.4小檗碱对小鼠肾内抗氧化能力的影响
与对照组相比，模型组小鼠SOD含量明显减少，而MDA明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，苯溴马隆组和小檗碱50、100、200 mg/kg组SOD含量明显增多，MDA显著减少（P＜0.01），见图3。
3.5小檗碱对小鼠肾脏URAT1表达的影响
与对照组相比，模型组小鼠肾脏URAT1蛋白表达水平升高（P＜0.01）；与模型组相比，苯溴马隆小鼠肾脏URAT1蛋白表达显著降低（P＜0.01）；小檗碱100、200 mg/kg组能显著下调URAT1蛋白表达（P＜0.01），见图4。
4讨论
高尿酸血症是常见的一种代谢性疾病，某种程度上也是一种炎症反应。由于血管壁和肾脏上沉积的尿酸盐结晶，而造成慢性炎症损伤，大量炎症因子的释放[17]。研究表明，CRP作为标志性因子在炎症过程中表达，CRP的合成受到肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的刺激[18]。此外TNF-α、IL-6水平升高会引发氧化应激反应[19]。说明CRP作为代表性的炎症因子，在氧化应激中也发挥了重要作用。本实验证明小檗碱能够有效的减轻高尿酸血症小鼠体内的炎症反应，这与小檗碱调节小鼠血清CRP水平有关。
由体内嘌呤代谢紊乱引起高尿酸血症，以尿酸前体物质的增加、尿酸分泌排泄的减少，使尿酸酶活性抑制的造模作为理论基础，本研究采取次黄嘌呤联合氧嗪酸钾进行造模实验处理。实验研究表明，高尿酸血症与机体氧化应激之间紧密联系，尿酸作为内源性抗氧化剂中最主要的一种，但持续升高的尿酸水平会导致加强体内的氧化应激[20]。血清尿酸水平的升高，可由多种路径打破机体的氧化和机体的还原平衡，生成大量活性氧在机体内部，导致组织细胞破坏，从而使得机体抗氧化能力降低，导致发生氧化应激的损伤和破坏[21]。SOD是机体保护过氧化损害过程中的关键酶，体现在机体的氧化与抵抗氧化平衡两方面；MDA是一种重要的醛类物质，产生于活性氧自由基引起的脂质过氧化过程中，其含量表示机体受到的过氧化程度和受到活性氧自由基攻击破坏的程度，同时多种病理生理过程与氧化应激有不可分割的联系。提升机体自身的抗氧化水平，同时防治高尿酸血症的有效途径是降低氧化应激对组织的损伤[22]。所以，本课题以炎症过程中的标志因子CRP和氧化应激作为突破口，探索小檗碱对高尿酸血症小鼠的抗炎与抗氧化作用。
此外，在本实验中探索降尿酸的药物，如何建立好高效而准确的高尿酸血症小鼠动物模型尤为重要。对于高尿酸血症的小鼠动物模型，造模的关键点是降低尿酸酶的活性[23]。高尿酸血症也是一种慢性的代谢性疾病，给予的治疗药物会随小鼠每天的代谢进而排出体外，造成实验药品的浪费以及实验造模的不准确，从而影响实验最终的结果分析。本研究以增加尿酸前体物质、减少尿酸的排泄和抑制尿酸酶的活性等3个方面作为实际造模的理论依据，慎重考虑后本实验同时利用次黄嘌呤联合氧嗪酸钾的方法进行ig造模。考虑到现行的造模方式主要为饲喂、ip、sc、ig等。饲喂造模方法对于不同的实验小鼠存在个体差异，进而导致摄入药物剂量不同，从而使得动物血清尿酸水平范围波动大，而ig能够有效地弥补这些方式的不足之处。所以，本研究选择ig方式对小鼠进行实验，并成功地建立了高尿酸血症模型。
综上所述，小檗碱能够有效降低高尿酸血症小鼠尿酸和Cr的水平，调节CRP炎症因子水平，升高SOD活性。减轻高尿酸血症小鼠体内和肾内氧化应激及炎症损伤。本研究实验显示，小檗碱能够下调高尿酸血症小鼠肾脏URAT1的表达从而达到减低尿酸的作用，为临床上小檗碱作为新的降尿酸并改善高尿酸血症肾损伤的有效中药的开发和利用提供理论依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：谭珊，郭振宇，陈程，李桐，李顺欣，冼桂羽，周吉．基于URAT1蛋白表达研究小檗碱对高尿酸血症小鼠炎症反应及氧化应激的影响[J]. 现代药物与临床, 2023, 38(1): 16-21 .
