导语
结果解读：
细胞缺血引起染色质紧缩和基因转录的抑制，这与组蛋白去乙酰化和甲基化有关。免疫印迹实验证实，在人类供体心脏保存期间，H3K9和H3K27组蛋白的总去乙酰化水平降低（图1A）。根据先前的研究，这些组蛋白尾部的乙酰化预计会激活基因表达。为了测试HDAC抑制剂改善供体心脏功能的潜力，作者将人类心脏注入含有VPA的标准组织保存液（HTK），然后进行冷静态保存（4°C）8小时。作者确认这种处理能够在长时间心脏保存后保持组蛋白的乙酰化水平（图1A）。对增加冷静态保存时间的体外供体小鼠心脏功能的评估也表明，尽管在此时间点心脏功能下降，但VPA可以改善心脏的收缩能力长达16小时（图1B和C）。VPA浓度的逐渐增加显示出在10 mM时具有峰值的心脏保护效果。
HDAC抑制剂可以调节代谢途径。已经证明VPA和SAHA能够降低糖酵解和脂质代谢，而TSA则增加了有氧和线粒体代谢。由于心脏能量在决定心脏功能方面起着关键作用，作者使用质谱法评估了VPA处理后人类和小鼠心脏的代谢谱变化。在人类心脏的冷冻保存过程中，琥珀酸盐如预期般增加（图2A）。然而，VPA处理减少了这种有害的琥珀酸盐产生（图2A）。相反，在HTK心脏的冷藏过程中，VPA限制了顺丁烯二酸的降低（图2B和图S2A）。作者发现VPA处理导致琥珀酸盐减少和顺丁烯二酸增加的结果在小鼠心脏的冷静保存（图S2B）和移植中得到了验证。在两个物种的VPA处理组中，心脏保存期间的顺丁烯二酸浓度（人类= 8.0 ± 1.0 pmol/mg组织；小鼠= 8.8 ± 0.8 pmol/mg组织；图2B和图S2B）与富马酸（人类= 43.5 ± 6.6 pmol/mg的组织；小鼠= 29.0 ± 7.5 pmol/mg的组织；图2C和图S2C），这表明顶酸酯可能作为竞争性抑制剂，限制富马酸与SDH的结合（16）。尽管在人类心脏的冷贮存过程中，乙酰辅酶A（acetyl-CoA）、柠檬酸（citrate）和α-酮戊二酸（α-ketoglutarate）的丰度都减少了，但作者在小鼠心脏中在冷贮存期间使用VPA治疗时并未观察到乙酰辅酶A、柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸或苹果酸丰度的任何变化（图2，D至G和图S2，B和C）。然而，在小鼠心脏移植后，使用VPA治疗导致富马酸和苹果酸增加，谷氨酸减少。
鉴于VPA治疗后伊曲康酸的可获得性增加，作者试图确定相关酶（IRG1）的表达是否特异性地受到VPA诱导。使用H3K27ac抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP），随后进行定量聚合酶链反应（qPCR），结果显示，与单独使用HTK相比，VPA处理后8小时，人类心脏组织中IRG1增强子活性增加（图3A）。相应地，IRG1 mRNA转录表达也通过VPA处理而增加（图3B）。在小鼠心脏保存无再灌注（图S3A）和离体灌注（图S3B）期间，所有HDAC抑制剂处理（VPA、SAHA和TSA）均导致Irg1转录表达增加。为了进一步阐明IRG1在保护供体心脏中的作用，作者研究了Irg1 −/− 小鼠在保存-再灌注功能反应中的表现。在离体灌注（图3，C和D）和同基因移植模型（图3，E和F）中，Irg1缺陷减弱了VPA的心脏保护效应。与未经VPA处理的野生型（WT）心脏相比，Irg1 −/− 心脏功能也较差（图3，C和D）。尽管添加VPA减少了α-肌凝蛋白 + 心肌细胞中的末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸末端标记（TUNEL）染色，但这种益处在Irg1 −/− 心脏中丧失了（图3，GG和H）。为了研究Irg1在髓系细胞中的贡献，作者检查了LysM-Cre心脏中VPA治疗的效果。作者发现，在髓系细胞中条件性Irg1缺乏不会影响VPA在离体灌注模型中对收缩或舒张的心脏保护作用（图S3，C和D）。这些结果与乘客白细胞的免疫荧光染色结果一致，表明髓系细胞在离体灌注的心脏中很少见（总细胞数的0.25％；图S3，E和F）。作者通过Litvinukova等人报道的成年人心脏的单细胞数据（表S1）确认了IRG1转录本在心脏细胞（包括心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞）中与髓系细胞中的表达相当。因此，VPA依赖的IRG1表达和顶酸产生在心脏细胞中似乎在心脏保护中起到了作用。
VPA还增加了保存和移植的小鼠心脏中还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽[谷胱甘肽二硫化物（GSSG）]的比例（图4，A和B），与减少的氧化应激一致。VPA治疗还导致离体灌注的野生型小鼠心脏中总核因子红细胞2相关因子2（NRF2）、血红素加氧酶1（HO1）和超氧化物歧化酶1（SOD1）的增加，但不包括SOD2（图4，C和D）。然而，在Irg1小鼠心脏中，抗氧化蛋白表达没有变化（图4，C和D），作者没有检测到仅用HTK保存的WT和Irg1心脏之间的任何差异（图4，C和D）。这些数据表明，VPA需要Irg1表达和增加的丙酮酸盐可用性来上调抗氧化蛋白。先前的报告表明，丙酮酸盐可上调免疫细胞（如巨噬细胞）中的抗氧化蛋白（35），但在非免疫细胞中尚未有明确描述。鉴于体外灌注系统中白细胞的稀缺，作者的数据表明，有益的抗氧化蛋白上调可能出现在其他心脏细胞中。
为了直接评估顺丁烯二酸的效果，作者在体外分别以顺丁烯二酸或4-辛基顺丁烯二酸（4-OI）处理HL-1心肌细胞，同时在正常氧和低氧条件下进行。任何一种化合物的处理都导致抗氧化酶HO1和SOD1蛋白的丰度增加，但未观察到NRF2的变化（图5，A和B，以及附图S5，A和B）。顺丁烯二酸具有高极性和低细胞渗透性；因此，作者在体内研究中使用了可渗透细胞的4-OI（37）。鉴于VPA通过上调Irg1改善了心脏保存质量的发现，作者直接给予供体小鼠4-OI，然后将供体心脏保存16小时。随后的离体灌注显示，4-OI处理改善了心脏的收缩和舒张功能（图5，C和D）。4-OI处理还增加了心脏组织中NRF2的核转位（图5E）。与VPA处理类似，4-OI减少了供体心脏中的氧化性DNA损伤，如减少的8-OHdG荧光显示（图5，F和G）。
为了确定VPA在大动物中的功效，并评估其在临床环境中的可转化性，作者在离体灌注系统中研究了VPA对猪心脏保存及其后续功能的影响。VPA改善了工作模式下供体心脏的收缩和舒张能力，该模式通过加载左心室来评估心脏射血功能，在4小时和10小时保存时间点上均有改善（图6，A和B；附图S6，A和B；视频S1）。与仅使用HTK保存液相比，VPA处理后的心脏输出量在保存4小时后提高了约25％，在保存10小时后提高了100％（图6C）。保存10小时后的心脏功能改善表现为左心室腔内较高的收缩压和较大的主动脉脉搏压差（收缩压减去舒张压）（表S2）。VPA处理后的氧耗也较高，但心脏重量无差异（表S2）。
然后作者比较了小鼠和猪心脏的抗氧化反应。与小鼠观察到的情况相似，经过10小时保存后，猪心脏中的氧化性DNA损伤通过8-OHdG染色明显增加，与4小时相比，而且这种损伤在VPA处理后得到了很大程度的减轻（图7，A和B）。在4小时和10小时保存后，NRF2在离体灌注的猪心细胞中定位于细胞质，而VPA诱导了NRF2在两个保存时间点的核转位，与NRF2的激活和下游信号传导一致（图7C）。VPA还增加了心脏组织中的总Nrf2蛋白（图7D）。
总结
总之，作者已经证明心脏保护代谢途径可以通过药物如HDAC抑制剂的转录过程来特异性激活。通过增加IRG1表达和顺丁烯二酸的可用性，作者能够改善心脏功能，在保护后激活抗氧化过程，抑制炎症，并促进细胞存活。VPA是美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物，几十年来一直被用作抗癫痫药物。它能够上调IRG1表达和顺丁烯二酸的产生，支持将VPA重新用于供体心脏保护的潜力。作者的工作对于推进固体器官的保护生物技术以及改善与缺血相关的病理治疗具有广泛的意义。
