LMK是什么药科研 ｜Nat. Chem. Biol：研究表观遗传药物的新工具

也许这项研究最意想不到的结果是什么观察到MBLAC2是24个异羟甲酸酯分子的脱靶(图2a)。其中包括批准的药物，如帕比司他(pK_d^app =5.9)和常用工具化合物，如Nexturastat A(pK_d^app =7.6)(图4a)。为了确定结合的抑制等于酶活性的抑制，我们采用了一种重组酶活性测定方法，测量了³H标记的棕榈酰-CoA的MBLAC2催化的水解(图4b)。在300 nM药物浓度下，MBLAC2活性几乎受到所有结合剂的影响，并且18个HDACis降低至背景值(图4c)。在化学蛋白质组分析中显示没有或非常弱的MBLAC2结合的HDAC药物(例如西达本胺和PCI-34051)对酶活性的影响很小。11个化合物的全剂量反应分析表明，大多数化合物达到了5-10 nM的实验EC50极限(即pEC₅₀约为8.0-8.3)，相当于应用酶浓度的50%。值得注意的是，这些有效的抑制剂包括批准的药物帕比司他(pEC₅₀>8.0)。相比之下，批准的氨基苯胺酮并不影响MBLAC2的活性。

MBLAC2是一种特征性较差的蛋白质。此外，它已被证明与锌指DHHC型棕榈酰转移酶20(ZDHHC20)相互作用，ZDHHC20是内吞作用介导的表皮生长因子受体(EGFR)内化的调节因子。在分析MBLAC2共调节蛋白(ProteomeHD)的定位和作用时，我们也发现了一致的基因本体论(GO)注释。此外，HDAC6抑制剂Tubacin已被证明能产生一种囊泡表型。当发现Tubacin可以抑制MBLAC2(图2a和4c)时，我们推测囊泡的表型可能与MBLAC2的活性有关。在HEK293细胞中，使用短干扰RNA(siRNA)敲除 HEK293 细胞中超过 85% 的蛋白质对这7112个蛋白质的表达没有实质性影响，这些表达的蛋白质包括那些已知与MBLAC2和囊泡生物学相关的蛋白质。然而，基因敲除确实诱导了细胞培养上清液中细胞外囊泡的积累(图5a)。与其接近的类似物Acy-738(图2a)。相比，Acy-775(图5b)对MBLAC2的药理抑制作用更加明显。在化学蛋白质组分析中，ACY-738和ACY-775以相似的效力抑制HDAC6(Acy-775 pK_d^app =6.4 vs Acy-738
pK_d^app =6.7)，对HDAC6底物α-微管蛋白的乙酰化也有类似的影响。相反，只有Acy-775是有效的MBLAC2结合和抑制剂(pK_d^app =6.1，pEC₅₀=8.2)，而Acy-738不是(pK_d^app <4.5，pEC₅₀=6.3)。综上所述，这些数据表明MBLAC2活性在细胞外囊泡水平中起作用。

目前我们的研究为化学生物学领域做出了一些贡献。本研究中针对HDAC和金属水解酶的53种药物数据是迄今为止最全面的数据，并为化学生物学家和药物化学家提供了丰富的资源。这些集体性的数据使一些分析成为可能，而这些分析在小型数据集中是不可能实现的，并揭示了一些令人惊讶的现象。

首先，新的亲和基质超越了现有技术，因为它富集了11种人类锌依赖性HDACs中的9种，包括IIa类HDAC。这种改善主要源于iC的发展，其特点是为HDAC5抑制开发了二芳基环丙烷异羟肟酸化学类型。在这一系列抑制剂中，对映体CHDI00465983具有IIa选择特异性(图2)，而iC(由三个对映体对组成)表现出泛HDAC和脱靶MBLAC2结合特征。iQ比固定的vorinostat 或任何其他亲和基质都能更好地富集HDAC8。脱靶的GATD3A、ALDH2、ISOC1和ISOC2之所以能够被识别，仅仅是因为它们被iA大量富集。我们注意到iA的空间烷基链也存在于构成B组的所有HDACis中(图2a)，这可能有利地将金属结合异羟肟酸定位在许多其他金属蛋白的活性位点中，并促进它们的富集。我们进一步的工作旨在识别富含HDAC9和HDAC11的细胞系以及专用的HDAC11探针。目前，亲和基质也可用于研究HDACi的再利用，例如针对寄生虫如曼氏血吸虫或恶性疟原虫的再利用。

第二，显然重要的是，我们要知道给定药物与哪些蛋白质结合，该药物对该靶标的效力如何，以及它对其他靶标的选择性如何，以便能够将观察到的生物效应归因于该化合物的靶标。例如，对于指定的HDAC6抑制剂ricolinostat (pK_d^app，HDAC6 =
7.1)和citarinostat (pK_d^app，HDAC6 =
6.7)，本研究将它们的主要抗癌作用归因于抑制HDAC1、HDAC2和HDAC3 (pK_d^app范围为4.9-6.0；图2)而不是HDAC6。更令人惊讶的是，在HDAC6高选择性的假设下，人们在超过100篇出版物中使用了tubastatin A来探索HDAC6的生物学机制。然而，根据我们的结果，tubastatin A对HDAC10的效力比HDAC6高得多(pK_d^app，HDAC10 =
7.5 vs pK_d^app，HDAC6 = 5.0)。我们假设已发表的HDAC活性抑制数据和化学蛋白质组结合数据之间的差异以及细胞内靶向结合数据(NanoBRET)，源于早期研究中所使用的多肽底物的不足；HDAC10只是最近才被注释为多聚氨基酸，而不是蛋白质脱酰基酶。在这方面，我们的试验中最有效的HDAC10结合剂(tubastat A、abexinostat、pracinostat、quisinostat、帕比司他和达西司特)都具有带正电荷的氨基。然而，高选择性是可以实现的。三种药物甚至达到了化学探针的基本标准。ACY-738用于HDAC6，PCI-34051用于HDAC8，TH65用于HDAC10。它们的发现将服务于化学生物学，例如，TH65可以探测HDAC10在多胺生物学和自噬以及成神经细胞瘤中的作用。

第三，从目标前景来看，很明显，区分HDAC1、HDAC2和HDAC3相似活性位点的抑制剂设计是具有挑战性的。在这里，靶向特定HDAC复合物的药物可以获得选择性，如治疗突触病变的CoREST-选择性HDACi 。化学蛋白质组分析保留了HDAC复合物，导致人们可以发现异羟肟酸药物倾向于与CoREST、Sin3和MiDAC复合物结合(图3c)。令人惊讶的是，当与RCOR3而不是替代的核心亚基RCOR1相互作用时，这些药物与HDAC1或HDAC2的作用亲和力高10倍以上。与异羟肟酸相比，氨基酰苯胺类药物似乎能更好地与不属于复合物的HDACs结合。这与最近一份关于氨基酰苯胺类药物与游离HDAC结合并在具有刚性HDAC动力学的复合物形成后滞留在活性部位的报告相一致。数据表明，不同种类的HDAC药物(异羟肟酸与氨基苯胺)可能根据其复合物的不同而差异性地调节HDAC底物的乙酰化。

第四，人们通过化学蛋白质组分析为其他特征明确的药物确定靶点。例如，我们已经确定了激酶抑制剂的新靶点(例如，ATM抑制剂CP466722的激活素受体ALK2。目前的研究发现了5例HDACis，特别是ALDH2 (n = 9种药物， pK_d^app = 6.5)，GATD3A (n
= 7种药物， pK_d^app = 5.8)，ISOC1 (n =
7种药物，pK_d^app = 6.8)，ISOC2 (n =
8种药物， pK_d^app = 8.2)和MBLAC2 (n
= 24种药物，pK_d^app = 7.6)。MBLAC2被几个HDACis基团结合，而其他非靶标似乎优先被HDACis结合。因此，烷基可能有利于脱靶结合，而具有共轭或芳香族接头的HDACs对HDACs更具选择性。除了ALDH2之外，所有脱靶蛋白都是特征性较差的蛋白。HDACi结合是否影响它们的生物学功能从而影响药物疗效，还有待研究。据报道ISOC1敲除可抑制癌细胞增殖和转移，这可能是一种理想的脱靶效应，例如伏立诺他。在我们的试验中，Droxinostat和丁苯羟酸不与HDACs结合，但是它们对一些非靶标的亲和力可用于探测这些蛋白的功能。

第五，在非HDAC脱靶物中，MBLAC2因其能与异羟肟酸HDACis发生频繁且有效的结合而脱颖而出。这种蛋白质最近被证明可以水解酰基辅酶A，而且就像HDACs一样，它利用Zn²⁺进行催化。我们的数据首次显示，HDACis可以在体外抑制该酶的棕榈酰辅酶A水解酶活性，并且一些HDACis以个位数的纳摩尔EC₅₀值抑制该酶的活性。一项研究描述了tubacin对外泌体生物发生的HDAC6非依赖性刺激作用，这使我们假设这种表型可能源于MBLAC2的抑制，MBL AC 2是tubacin唯一的非靶标。鉴于MBLAC2可以水解棕榈酰辅酶A(神经酰胺的初始构建单位)，我们推测MBLAC2可能参与调节神经酰胺水平和外泌体释放。与这种假定的作用相一致，我们用MBLAC2和HDAC6双重抑制剂ACY-775治疗。与用HDAC6选择性ACY-738治疗相比，双重抑制剂ACY-775会导致细胞外囊泡的积聚。这一发现表明MBLAC2在细胞外囊泡生物学中的直接或间接作用，我们通过进行MBLAC2敲除实验证实了这一点。重要的是，人们以前已经观察到ACY-775和ACY738的不同作用，例如在Charcot-Marie-Tooth疾病的遗传小鼠模型中，ACY-775对线粒体数量和轴突运输的活性比ACY-738更明显。因此，通过MBLAC2抑制对细胞外囊泡水平的影响和HDAC6对微管囊泡运输和融合的影响之间存在协同作用是很有吸引力的。然后，我们开始探索脂质体中哪些分子事件连接MBLAC2抑制和细胞外囊泡积累。虽然我们不能证明MBLAC2 C12-神经酰胺酶活性是囊泡形成的潜在调节模式，但MBL AC 2可能水解细胞中的其他脂质。在18种含人金属-β-内酰胺酶结构域的蛋白质中，N-酰基–磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D (NAPEPLD)已经阐明了这种脂酶活性。事实上，MBLAC2敲除对一些脂质家族的细胞内浓度有影响，包括己糖神经酰胺的普遍减少和随之而来的鞘磷脂水平的增加。我们预计，已鉴定的MBLAC2抑制剂将激励生物学家进一步探索MBLAC2细胞功能，并帮助理解其与细胞外囊泡积累的联系。

总之，这项研究显示了混杂亲和探针的设计和合成是如何证明HDACis的靶点前景。在ProteomicsDB中汇编的药物图谱为药物化学提供了信息，并可用作研究生物学的化学探针。MBLAC2被确定为HDACi靶标，这有助于为囊泡病理生物学的药物发现提供理论基础。