npp底物是什么生物技术通报｜高活性脂肪酶的发掘、评价及在甘油二脂合成中应用-上海聚慕医疗器械有限公司

徐远志胡珊代思泽游帅郑明明单凯

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2025-0392

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目的针对国产脂肪酶催化效率低、热稳定性差等问题，筛选高活性脂肪酶菌株，解析催化特性用于酶法高效制备甘油二酯。

方法采用中性红橄榄油平板初筛及对硝基苯酚比色法复筛的方法，从富含油脂的土壤中筛选高产脂肪酶菌株，结合形态学与16S rDNA序列分析进行菌种鉴定，通过PCR扩增获得高活性脂肪酶基因序列，探究酶学性质，建立无溶剂体系评价甘油二酯合成效率。

结果从18份土壤样品中成功发掘到一株高产脂肪酶菌株E12C，胞外酶活为（80 826.4±1 838.9）U/L，经形态学与16S rDNA序列鉴定为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia），命名为B. cepacian OCRI-Lip100，已保藏于中国典型培养物保藏中心。该脂肪酶命名为Lip-12c，最适反应温度为60 ℃、最适反应pH为9.0，在此条件下酶活为（190 761.2±5 181.5）U/L，比活力为（39 254.5±271.3）U/g蛋白，显著高于进口脂肪酶，在40-70 ℃和pH 5.0-10.0范围可维持较高活性，金属离子Na⁺和Mg²⁺对酶活性提升效果显著。在无溶剂体系中40 ℃酶法水解橄榄油4 h，甘油二酯含量达33.5%。

结论土壤中发掘的高产脂肪酶菌株B. cepacian OCRI-Lip100，在无溶剂体系中展现的高效甘油二酯合成能力，不仅丰富了现有脂肪酶菌种资源库，还为功能脂质的高效生物制造提供了技术支撑。

关键词脂肪酶；洋葱伯克霍尔德菌；分离鉴定；酶学性质；甘油二酯

引用本文：徐远志,胡珊,代思泽,等.高活性脂肪酶的发掘、评价及在甘油二脂合成中应用[J].生物技术通报,2025.

DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2025-0392.

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一类甘油酯水解酶，能够催化甘油三酯（triacylglycerol, TAG）的水解，生成甘油、游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）、单甘酯（monoacylglycerol, MAG）和甘油二酯（diacylglycerol, DAG）^［1］，是第三大商业酶。其中DAG是公认安全的食品成分，人体摄入DAG可以减少血清和肝脏中的TAG、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，抑制体内脂肪的积累^［2］。脂肪酶同时还具有酯化、转酯化和消旋化等非水解反应的能力^［3］，广泛应用于油脂加工、生物制药、化妆品及生物柴油等多个工业领域^［4］。例如，脂肪酶在油脂生产加工过程中，通过水解、酯交换进行油脂的脂肪酸富集和结构改性，以获得多不饱和脂肪酸^［5］（如α-亚麻酸和二十二碳六烯酸）与人乳脂肪替代品（1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯和1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯）^［6］等高价值产品；在生物制药中能酯化生成抗坏血酸棕榈酸酯^［7］、没食子酸丙酯^［8］和醋酸维A酯^［9］等抗氧化剂。

脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中，其中微生物来源的脂肪酶如枯草芽胞杆菌^［10］、黑曲霉菌^［11］、米根霉菌^［12］和假单胞菌^［13］等，因具有成熟的遗传操作方法、生产周期短和酶活高等优势成为工业应用的主要来源。此外，微生物来源的脂肪酶还具有催化特异性高、反应条件温和、副产物少以及对环境友好等特性^［14］，被认为是一种安全、高效和可持续的生物催化剂^［15］，在工业化应用中展现出显著的潜力。然而，我国脂肪酶研究与工业化应用起步较晚，用于工业生产的高活性脂肪酶较少^［16］。目前市面上使用的脂肪酶，催化温度和pH范围有限，在高温和酸碱等极端环境下催化活性显著降低，甚至失活^［17］，极大地限制了工业化应用方向。因此，发掘、改造具有高活性的脂肪酶，为我国工业生产提供强大高效的生物催化剂，对于工业生产具有重要价值。

基于此，本研究首先采集全国富含油脂的代表性土壤，结合中性红橄榄油平板法和对硝基苯酚显色法，挖掘高产脂肪酶菌株；采用分子生物学技术鉴定菌株的种属及其脂肪酶基因序列，并命名为菌株B. cepacian OCRI-Lip100和基因bclip12c；进一步探究该脂肪酶的酶学性质，如温度、pH、金属离子耐受性和底物链长选择性等；系统地研究不同条件对脂肪酶催化活性的影响，进一步用于DAG的酶法制备。本研究不仅能丰富脂肪酶资源，还为DAG等功能脂质生物制造提供理论依据和技术支持。

1.1.1 试验材料

本研究以广西壮族自治区钦州市（西南区域丘陵油菜地）、浙江省温州市（东南区域茶园）、河南省项城市（华中区域平原花生地）、四川省内江市（西南区域山区大豆地）典型油料作物种植区域为目标，采集富含油脂的土壤样品。根据采集区域的地势分布采用五点取样法，在每个小区域的中心及4个角落各选择3个采样点，采集3个平行样本。先铲去表层5 cm的浮土，收集离地表5-15 cm土壤100 g装于密封袋中。同时，记录采样地点、时间和环境条件，并将样品存储于4 ℃用于后续实验。

1.1.2 主要试剂

蛋白胨、酵母粉和蛋白标准Marker（赛默飞世尔科技公司）；细菌总DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；2×Taq Master Mix DNA聚合酶、BCA蛋白浓度测定试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；DNA Marker、核酸染料（擎科生物科技股份有限公司）；对硝基苯酚（p-nitrophenol, p-NP）、4-硝基苯基棕榈酸酯（4-nitrophenyl palmitate, p-NPP）等（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；各种分析纯试剂购自国药集团。

1.1.3 培养基与溶液配制

LB（Luria-Bertani）液体培养基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，固体培养基在此基础上添加1.5%的琼脂粉。富集培养基（g/L）：蛋白胨10.0，葡萄糖10.0，牛肉膏5.0，橄榄油10.0，NaCl 4.0，pH 7.0-7.3。中性红橄榄油固体培养基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 2.5，MgSO₄ 0.5，琼脂粉15.0，额外添加橄榄油聚乙烯醇乳化液40 mL/L，1.6%中性红溶液1 mL/L，调节pH 7.0-7.3。发酵培养基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 2.0，（NH₄）₂SO₄ 2.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄ 0.5，橄榄油聚乙烯醇乳化液40 mL/L，调节pH 7.0-7.3。橄榄油聚乙烯醇乳化液：称取2.0 g聚乙烯醇（polyvinyl alcohol 1 750 ± 50, PVA）加入80 mL纯水中，100 ℃油浴加热搅拌溶解，冷却后定容至100 mL得到2%聚乙烯醇溶液，橄榄油与2%聚乙烯醇溶液按照1∶3的体积混合，用手持高压均质仪乳化10 min，即可得到橄榄油乳化液。

1.1.4 主要仪器与设备

Spectra Max i3 多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；ETC811 Plus PCR仪（苏州东胜兴业科学仪器有限公司）；核酸电泳、SDS-PAGE相关仪器（北京六一生物科技有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（日本SANYO公司）；GC 2030气相色谱仪（日本岛津仪器公司）；HPS-400B 生化培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；D1524 R高速冷冻台式离心机（大龙兴创实验仪器股份公司）；MT-30K手持高压均质仪（杭州米欧仪器有限公司）。

1.2.1 菌株的富集培养

称取5 g来自上述不同地区富含油脂的土壤，分别加入装有50 mL蒸馏水的250 mL摇瓶中，每瓶加入30颗玻璃珠（直径2 mm），在30 ℃、220 r/min条件下震荡10 min使样品充分混匀，得到稀释10倍的菌悬液。室温条件下静置30 min待菌悬液明显分层后，吸取1 mL上清接种于含有50 mL富集培养基的250 mL摇瓶中，于30 ℃、220 r/min条件下培养2-3 d。

1.2.2 脂肪酶产生菌的初筛与分离纯化

使用0.9%无菌生理盐水对富集培养液进行梯度稀释，得到稀释倍数分别为10⁶、10⁷、10⁸的稀释液。吸取0.1 mL上述梯度稀释液涂布于中性红橄榄油平板，在30 ℃恒温培养箱中倒置培养2-3 d，挑选有明显变色圈的菌落，划线接种至LB固体平板上进行分离纯化，纯化后的菌株进一步接种至斜面培养基中，4 ℃短期保藏。

1.2.3 产脂肪酶菌株的复筛

将初筛获得的菌株接种于LB液体培养基中，30 ℃、220 r/min条件下培养12 h，按照2%接种量接种于含有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，在相同条件下（30 ℃、220 r/min）培养2 d，以确保菌株充分生长并分泌脂肪酶。培养结束后将菌液于8 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min，分离菌体和上清并收集上清（初筛菌株的脂肪酶溶液）用于酶活力测定，进一步复筛获得产新型高活性脂肪酶的菌株。

1.2.4脂肪酶酶活测定

脂肪酶酶活测定参考Mahadik等^［18］方法进行。称取27.8 mg的p-NP溶于40 mL异丙醇，用Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.0）缓冲液定容至100 mL，得到2 mmol/L的p-NP母液。精确吸取1.6、1.2、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mL使用Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.0）缓冲液定容至20 mL，得到160、120、80、60、40、20、10、5 μmol/L浓度的标准品。测定其在410 nm波长处的吸光值，以浓度为横坐标，OD₄₁₀为纵坐标，拟合的p-NP标准曲线回归方程为Y=8.455 64X+0.005 21，R²=0.999 95，线性关系良好。

称取1.0 g的p-NPP溶于异丙醇，定容至100 mL，超声使其完全溶解（完全溶解后溶液呈透明，命名为溶液A），另称取1.0 g的阿拉伯树胶和12.5 g的曲拉通-X100，溶于超纯水中，定容至400 mL，超声使其完全溶解（命名为溶液B）。将溶液A和溶液B按照1∶4的体积比充分混匀得到p-NPP底物溶液（混合均匀后溶液呈乳白色），置于4 ℃避光保存。

在5 mL离心管中加入0.9 mL脂肪酶检测混合液（p-NPP底物溶液：50 mmol/L Tris-HCl缓冲液：异丙醇=5∶4∶1），置于40 ℃恒温水浴锅中孵育5 min，加入待检测脂肪酶溶液100 μL（空白对照：100 ℃水浴10 min的脂肪酶溶液），在40 ℃条件下反应5 min。反应结束后加入0.6 mol/L三氯乙酸100 μL终止反应，再加入0.6 mol/L碳酸钠溶液100 μL调节pH至显色范围。室温下12 000 r/min离心5 min，吸取200 μL上清测定410 nm波长处的吸光值，代入公式1.1中计算脂肪酶溶液酶活。

酶活单位定义：在40 ℃条件下，每分钟催化生成1 μmol的p-NP所需要的酶量定义为一个活力单位（U），计算公式如下：

（1.1）

式中：C为检测体系中p-NP浓度（mmol/L），V为检测体系总体积（mL），n为样品稀释倍数，T为反应时间（min），v为脂肪酶溶液添加量（mL）。

1.2.5 产脂肪酶菌株的生长曲线绘制

将复筛获得的菌株分别接种于3瓶含有100 mL LB液体培养基的500 mL摇瓶中，在30 ℃、220 r/min条件下恒温培养。以接种时刻0 h为空白对照，每隔2 h在超净台中取一次样，用0.9%无菌生理盐水稀释到菌株生长浓度（OD₆₀₀）为0.6-0.8，测定其在600 nm波长处的吸光值。以取样时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标绘制产脂肪酶菌株的生长曲线。

1.2.6菌种鉴定与脂肪酶基因扩增

形态学观察：将复筛获得的菌株划线接种至LB固体培养基上，在30 ℃恒温培养箱中倒置培养2 d，可见光下观察菌落形态特征；接种环挑取少量菌体，用2.5%戊二醛固定液在4 ℃条件下固定菌体8 h，寄样至科学指南针测试平台拍摄生物扫描电镜。根据《伯杰细菌鉴定手册》^［19］和《常见细菌系统鉴定手册》^［20］描述进行形态学鉴定。

16S rDNA鉴定：参考细菌总DNA提取试剂盒方法，提取菌株的基因组DNA，使用表1中细菌通用引物16S rDNA（27-F/1492-R）进行PCR扩增。PCR反应体系（50.0 μL）：2×Taq Master Mix 25.0 μL，27-F 1.0 μL，1492-R 1.0 μL，基因组DNA 1.0 μL，ddH₂O 22.0 μL；PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物经核酸电泳检测出单一条带，送至擎科生物科技股份有限公司测序验证。将测序得到的16S rDNA序列提交到NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），使用BLAST工具进行序列比对，根据序列比对结果下载与之同源的序列，利用MEGA 11软件构建系统发育树。

表1 PCR中用到的主要引物Table 1 Main primers used in PCR

注：下划线标注为酶切位点

Note: The underlined sections indicate the restriction enzyme cutting sites

脂肪酶基因的扩增与比对：以NCBI数据库中B. cepacian已报道脂肪酶序列GenBank：DQ075249.2^［21］为初始模板，设计引物（F/R）获取菌株前段脂肪酶基因序列，在现有序列的基础上设计引物（12C-F/11-R）获取剩余脂肪酶基因序列，设计引物（KZ-F/KZ-R）扩增完整的脂肪酶基因片段（引物序列见表1）。根据比对结果使用MEGA 11软件构建系统发育树，使用SignalP 6.0信号肽预测（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0）在线网站预测成熟脂肪酶的氨基酸序列，氨基酸序列提交到Alphafold 3（https：//alphafold.ebi.ac.uk）在线软件预测蛋白结构。

1.2.7酶学性质表征

最适反应pH：在pH 3.0-11.0范围内，配制50 mmol/L缓冲液（pH 3.0-8.0的柠檬酸缓冲液，pH 8.0-9.0的Tis-HCl缓冲液，pH 9.0-11.0的甘氨酸-NaOH缓冲液），测定脂肪酶在不同pH下的活力。

最适反应温度：在最适pH下，20-80 ℃范围内每隔10 ℃，测定脂肪酶在不同温度下的活力。

金属离子对酶活的影响：在脂肪酶溶液中加入金属离子Na⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Co²⁺所对应的氯盐，配制成最终浓度为20 mmol/L的溶液，4 ℃冷藏12 h后测定活力，以未加金属离子的脂肪酶溶液活力为空白对照，在40 ℃、pH 8.0条件下测定金属离子对酶活的影响。

底物链长特异性：参照1.2.4中底物溶液配制方法，分别配制4-硝基苯基丁酸酯（C4）、4-硝基苯基辛酸酯（C8）、4-硝基苯基月桂酸酸酯（C12）、4-硝基苯基肉豆蔻酸酯（C14）、4-硝基苯基棕榈酸酯（C16）和4-硝基苯基硬脂酸酯（C18）的底物溶液，在40 ℃、pH 8.0条件下测定不同碳链长度的底物对酶活的影响。

有机溶剂对酶活的影响：选取12种有机溶剂（甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙醚、乙腈、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、正己烷、环己烷和丙三醇）分别添加到脂肪酶溶液中，使有机溶剂的最终浓度为10%（V/V），4 ℃冷藏3 h后，在40 ℃、pH 8.0条件测定活力。将无有机溶剂的脂肪酶溶液测定的活力设为100%，用相对酶活表示有机溶剂对酶活的影响。

1.2.8 与商品化脂肪酶的比活力对比

为进一步探究脂肪酶的活力，将脂肪酶溶液置于30 kD的Millipore超滤浓缩管，在4 ℃、3 000 ×g条件下离心25 min，分离分子量30 kD以下的杂蛋白，再用PBS缓冲液（50 mmol/L、pH 8.0）稀释到原体积。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，配制不同浓度梯度的蛋白标准溶液，与工作液混合后，置于37 ℃恒温培养箱中静置孵育30 min，测定其在562 nm波长处的吸光值OD₅₆₂。以蛋白浓度为横坐标，OD₅₆₂值为纵坐标，拟合的蛋白浓度标准曲线回归方程为Y=0.565 11X+0.018，R²=0.999 6，线性关系良好。脂肪酶溶液与工作液混合后，37 ℃条件下孵育30 min，测定OD₅₆₂并计算样品蛋白浓度；使用p-NPP法测定在温度40 ℃、pH 8.0条件下脂肪酶活力，计算比活力进行比较。

1.2.9 脂肪酶水解橄榄油的产物分析

以橄榄油作为水解底物，加入体积比250%的B液和50%酶液，混合均匀后置于密封反应瓶中，在40 ℃、500 r/min条件下搅拌反应4 h。反应结束后，根据Xu等^［22］方法，使用气相色谱法分析产物中甘油酯组成。取20 μL橄榄油水解后产物（对照组：未水解的橄榄油）溶于1 mL正己烷，混匀后用0.22 μm有机膜过滤除杂，置于气相进样瓶中用于检测。气相色谱分析采用岛津GC 2030，配置氢火焰离子化检测器（FID），色谱柱型号为DB-5HT（15 m × 320 μm × 0.10 μm）。初始柱温温度为170 ℃，保持2 min，然以5 ℃/min的温度速率升至380 ℃，维持6 min，进样器和检测器温度均保持380 ℃。以50∶1的分流比注入1 μL样品，载气为2 mL/min的高纯氦气，空气流速为200 mL/min。

1.2.10 数据处理

所有实验数据均是3个独立样本的平均值±标准差，采用SPSS 22的单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验进行显著性分析，在显著水平P≤0.05上被认为显著差异；采用Origin 2021软件作图；采用MEGA 11软件绘制系统发育树。

对以上采集的富含油脂样品富集培养后，使用中性红橄榄油平板法筛选出40余株产生红色变色圈的菌株，图1-A是具有代表性的8株菌。通过摇瓶放大培养收集脂肪酶溶液，使用p-NPP法检测筛选菌株产脂肪酶活力。结果如图1-B所示，菌株E12C的酶活最高，为（80 826.4±1 838.9）U/L，菌株E12B、E11C和E15B酶活分别为（57 968.3±3 112.1）U/L、（45 055.8±614.2）U/L和（41 162.5±1 431.1）U/L，而菌株D8、A37、B4和F3酶活仅为（10 395.0±750.7）U/L、（4 910.3±120.3）U/L、（2 761.2±273.3）U/L和（1 327.3±182.1）U/L。

图1 产脂肪酶菌株的发掘和生长曲线Fig. 1 Excavation and growth curve of lipase-producing strains

A：产脂肪酶菌株在平板上的变色圈；B：各菌株的脂肪酶活力；C：菌株生长曲线。不同字母表示有显著差异（P≤0.05），下同

A: Discoloration circle of lipase-producing strains on the plate. B: Lipase activity of each strain. C: Strain growth curve. Different letters indicate significant differences (P≤0.05), the same below.

选取酶活较高的株菌E12C、E12B、E11C和E15B，用LB液体培养基培养，绘制生长曲线。结果如图1-C所示，接种后5 h为迟缓期，OD₆₀₀几乎不变；5-22 h为对数期，细菌快速繁殖，OD₆₀₀迅速上升；22 h后为稳定期，OD₆₀₀趋于平稳。菌株E12C和E12B在中性红橄榄油平板上菌落形态相似，最终菌体浓度差异不大，OD₆₀₀稳定在2.1，而菌株E11C和E15B的最终菌体浓度低于菌株E12C和E12B，OD₆₀₀仅达到1.6。

菌株E12C在LB固体培养基上的菌落如图2-A所示，形状为近圆形，边缘整齐无扩散，表面光滑不透明，略微突起；颜色呈乳黄色，随着培养时间增加到第5天，颜色会逐渐加深，菌落生长为大片形状不规则的菌斑，推测具有运动性；臭味较为明显。生物扫描电镜下形态如图2-B所示，直径为0.5-0.8 μm，长度为1.2-3.0 μm，菌体呈杆状或略有弯曲，两端钝圆，表面布满褶皱，单个或成对排列，无芽孢，有鞭毛，参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定为假单胞菌属。以该菌株的基因组DNA为模板，使用细菌通用引物27-F/1492-R进行PCR，产物经核酸电泳检测到1条约1 300 bp的单一条带。将测序结果提交到NCBI数据库，通过BLAST工具进行同源性比对，构建系统发育树（图2-C）得知：菌株E12C属于B. cepacian。将该菌株分类命名为：B. cepacian OCRI-Lip100，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC M 20241369），16S rDNA序列已上传至NCBI数据库中，登录号为PV151362.1（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PV151362.1）。

图2 菌株E12C的鉴定Fig. 2 Identification of strain E12C

A：E12C菌株在LB平板上的菌落形态；B：在400 nm尺寸下的扫描电镜；C：E12C菌株的16S rDNA系统发育树

A: Colony morphology of E12C strain on LB plate. B: Scanning electron microscope at 400 nm. C: Phylogenetic tree of16S rDNA for strain E12C

参考同种属脂肪酶序列DQ075249.2设计特异性引物，获取菌株E12C前段脂肪酶基因序列bclipF和后段序列bclipR（图3-A），拼接后得到一段长度为1 095 bp的编码脂肪酶完整基因bclip12c（图3-B）。使用SignalP 6.0信号肽预测在线网站，预测脂肪酶Lip-12c的信号肽切割位点，结果如图3-F所示。信号肽切割位点位于第40号位氨基酸，该基因在原始宿主B. cepacian OCRI-Lip100中表达的脂肪酶命名为Lip-12c。

图3 脂肪酶Lip-12c的基因鉴定Fig. 3 Identification of lipase Lip-12c gene

A：脂肪酶基因序列bclipF和bclipR；B：成熟脂肪酶基因序列bclip12c；C：脂肪酶Lip-12c的SDS-PAGE结果分析；D：预测的脂肪酶Lip-12c三维结构；E：脂肪酶Lip-12c的系统发育树图；F：信号肽预测结果

A: Lipase gene sequence bclipF and bclipR. B: Mature lipase gene sequence bclip12c. C: Analysis of SDS-PAGE results of lipase Lip-12c. D: Predicted three-dimensional structure of lipase Lip-12c. E: Phylogenetic tree of lipase Lip-12c. F: Signal peptide prediction results

将上述获取的脂肪酶Lip-12c氨基酸序列在Alphafold 3在线软件预测蛋白结构，结果如图3-D所示。在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）中获取甘油酯水解酶信息并下载分类，进一步地在NCBI数据库获取以上甘油酯水解酶的保守结构域，使用MAGE11软件构建脂肪酶Lip-12c的系统发育树（图3-E），可知该脂肪酶与B. cepacian来源的脂肪酶1ys1^［23］同源性最高。图3-C为菌株E12C的蛋白SDS-PAGE分析，可以看到脂肪酶Lip-12c蛋白大小约为33 kD，与预测的大小相同，说明编码脂肪酶Lip-12c的完整基因已被成功获取。

2.4.1 脂肪酶最适反应pH

图4-A为pH对脂肪酶Lip-12c的影响，在pH 3.0-11.0催化范围内，pH为9.0时Lip-12c酶活力最高，为（88 391.2±246.6）U/L；在pH 5.0-10.0范围内反应时，Lip-12c的相对酶活保持在60%以上；但是，在pH为3.0和11.0条件下反应时，Lip-12c酶活力显著下降，仅为pH 9.0条件下的3%-21%。结果表明脂肪酶Lip-12c的催化pH耐受范围是5.0-10.0，最适催化pH为9.0，属于弱碱性脂肪酶。

图4 酶学性质分析Fig. 4 Analysis of enzymatic properties

A：pH对酶活的影响；B：温度对酶活的影响；C：金属离子对酶活的影响；D：底物链长特异性

A: Effect of pH on enzyme activity. B: Effect of temperature on enzyme activity. C: Effect of metal ions on enzyme activity. D: Substrate chain length specificity

2.4.2 脂肪酶最适反应温度

温度对脂肪酶Lip-12c活力的影响如图4-B所示。在20 ℃-80 ℃区间内反应时，脂肪酶Lip-12c在60 ℃ 条件下酶活力最高，为（190 761.2±5 181.5）U/L；在40-70 ℃范围内反应时，Lip-12c相对酶力性仍能保持在40%以上；然而，在20 ℃、30 ℃和80 ℃温度下反应时时，Lip-12c酶活性显著下降，仅为60 ℃反应条件下的7%- 17%。结果表明脂肪酶Lip-12c的最适催化温度是60 ℃，催化温度耐受范围是40-70 ℃，属于中高温脂肪酶。

2.4.3 金属离子对脂肪酶活力的影响

在20 mmol/L的金属离子溶液中，金属离子K⁺、Na⁺和Mg²⁺能不同程度地提高Lip-12c的酶活（图4-C）。其中，Na⁺和Mg²⁺提升Lip-12c酶活效果显著，分别提高至（92 950.4±1 482.9）U/L和（98 608.2±2 015.0）U/L，比初始筛选条件提高了15%和22%；K⁺对Lip-12c酶活提升效果不明显，仅提高了9%；然而，Mn²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe²⁺和Zn²⁺对Lip-12c酶活有不同程度的抑制作用，其中Zn²⁺对酶活抑制最显著，酶活为初始条件的30%，仅为（23 520.5±471.4）U/L。

2.4.4 脂肪酶的底物特异性评价

为验证脂肪酶Lip-12c对不同链长底物是否具有催化特异性，如图4-D所示。选取不同链长的4-硝基苯基酯（C4-C18）为底物，检测脂肪酶Lip-12c水解能力。结果显示，脂肪酶Lip-12c对4-硝基苯基肉豆蔻酸酯（C14）底物具有偏好性，酶活力由（80 826.4±1 838.9）U/L提升至（115 640.0±535.7）U/L，提升了43%；对底物4-硝基苯基辛酸酯（C8）、4-硝基苯基月桂酸酸酯（C12）和4-硝基苯基棕榈酸酯（C16）的催化水解能力相当，仅为C14的80%；然而，脂肪酶Lip-12c对4-硝基苯基丁酸酯（C4）和4-硝基苯基硬脂酸酯（C18）的水解能力较差，仅为37%-59%，属于中短链脂肪酸选择性脂肪酶。

2.4.5 有机溶剂对脂肪酶活力的影响

选取了12种不同油水分配系数（Log P：-1.76-3.5）的有机溶剂，探究其10%浓度下对脂肪酶Lip-12c活力的影响（表2）。结果显示，脂肪酶Lip-12c在以上有机溶剂中的相对酶活高于70%，在疏水性有机溶剂（正己烷、环己烷和乙醚）中具有较好稳定性，保留了初始活性的85%-104%，在亲水性有机溶剂（乙酸、丙酮和丙三醇）中稳定性显著下降，相对酶活仅为70%-87%。值得注意的是，脂肪酶Lip-12c在甲醇、乙醇和乙腈中表现出良好的稳定性，相对酶活显著高于别的亲水性有机溶剂（91%-97%），在有机合成与生物能源领域展现出巨大的应用潜力。

表2 有机溶剂对脂肪酶Lip-12c活力的影响Table 2 Effect of organic solvents on the activity of lipase lip-12c

注：组间不同字母表示有显著差异（P≤0.05），下同。

Note: there are significant differences in different letters between groups(P≤0.05), the same below.

检测脂肪酶Lip-12c与商品化脂肪酶液的蛋白浓度和酶活，计算比活力，结果如表3所示。本文发掘的脂肪酶Lip12c蛋白浓度为（1.57 ± 0.04）mg/mL，较商品酶来源C. rugosa lipase AY 400SD（2.487 ± 0.12 mg/mL）和C. rugosa lipase CRL（1.21 ± 0.18 mg/mL）处于同一数量级；Lip-12c蛋白浓度显著高于商品化来源C. rugosa lipase AY SD（0.27 ± 0.05 mg/mL）和C. rugosa lipase AYS（0.26 ± 0.05 mg/mL）。值得注意的是，脂肪酶Lip-12c比活力达到了（39 254.5 ± 271.3）U/g，显著高于商品化来源的脂肪酶；与文献报道最高来源脂肪酶相比^［24］，脂肪酶Lip-12c的比活力是Aeromonas caviae LipT51来源的1.15倍，Lip-12c是目前研究已知比活力最高的脂肪酶。

表3 不同脂肪酶的比活力对比Table 3 Comparison of specific activity of different lipases

为了进一步分析脂肪酶Lip-12c对底物的水解程度，使用气相色谱检测其水解产物分布，结果如图5所示。初始底物中主要成分为96%的TAG，DAG的含量约为4%。使用脂肪酶Lip-12c催化水解后，产物中TAG含量由96%下降至56%，约有40%的TAG被脂肪酶Lip-12c水解为FFA（8%）、MAG（2.5%）和DAG（33.5%），DAG中1，2-DAG与1，3-DAG的含量分别为18%和82%。

图5 脂肪酶Lip-12c水解产物气相色谱图Fig. 5 GC of hydrolysis products of lipase Lip-12c hydrolysates

DAG是油脂中的天然成分，通常以低浓度存在，具有控制脂肪积累、降低血脂和血糖水平等功能。酶法合成的反应条件温和、有害副产物少且不易产生污染，大多使用市售的进口脂肪酶，如李桥妹等^［26］采用固定化酶Lipozyme RM IM水解苍子核仁油，Liu等^［27］固定化脂肪酶Amano PS lipase甘油解植物油，但高昂的成本极大限制了大规模的工业化应用。本研究通过中性红橄榄油平板法从土壤中发掘的产高活性脂肪酶菌株，分离鉴定为B. cepacian。B. cepacian最初是从洋葱的腐烂表皮中分离得到的一种革兰氏阴性菌，广泛分布于土壤、水体及动植物体内，具有分泌脂肪酶的能力。所产脂肪酶B. cepacian lipase具有良好的有机溶剂耐受性，被应用于生物柴油、手性拆分和医药中间体等有机合成^［28］，但在DAG酶法制备方面因其转化率低和稳定性差而鲜有报道。

秦蓁天等^［29］报道采用中性红葵花籽油从厨余垃圾中筛选到5株可降解油脂菌株，最佳降解率可达65%。其原理是脂肪酶能够水解油脂导致培养基局部酸化，使中性红形成红色变色圈，红色变色圈的大小和颜色的深浅通常与脂肪酶的活力成正比。本研究发掘的菌株活力与变色圈大小相对应，进一步验证了筛选方法的可行性。菌株的产酶性能不仅取决于脂肪酶本身的催化活力，还与菌体生长状态密切相关。细菌生长曲线能够提供关于细菌生长能力和代谢活性等重要信息^［30］，李仰龙等^［31］探究了菌株B. cepacian JLS17在LB培养基中生长情况，培养24 h后进入稳定期，OD₆₀₀稳定在1.6，而B. cepacian OCRI-Lip100稳定在2.1。由生长曲线可知，菌株B. cepacian OCRI-Lip100对环境适应能力强，生长速率快，种群数量稳定后可达到的种群密度较大，这为其高产高活性新型脂肪酶奠定重要基础。

在酶促合成DAG过程中，反应温度显著影响酶的活力和稳定性。Chen等^［32］的研究揭示了温度对脂肪酶Rhizopus chinensis lipase（CRL）构象变化的影响，在可逆温度范围内温度的升高使得盖子结构域的打开，促进其催化反应，超过60 ℃后二级结构显著损失，结构遭到破坏而失活。这与本研究Lip-12c最适温度为60 ℃相一致，而Abd Razak等^［33］在使用脂肪酶Candida antarctica lipase B（CALB）制备DAG中最适温度为45 ℃，这一差异源于脂肪酶的构象不同，CALB的盖子结构域较小，不能完全覆盖活性口袋，在高温环境中更容易被破坏。反应体系中pH的变化，使得脂肪酶的活性中心处于最佳的离子化状态^［34］，能够高效地与底物结合并发挥催化作用，而金属离子可以与脂肪酶表面的氨基酸残基结合^［35］，导致蛋白质结构稳定或破坏，从而影响酶活。Karabulut等^［36］验证了脂肪酶Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM和Novozym 435在水解反应中，不同链长（C6-C22）的催化效率呈钟形分布，对C14底物具有特异性。脂肪酶Lip-12c活性中心对短链底物结合力较弱，催化效率随链长减少而下降；中链底物结合力适中，既不会难与疏水口袋结合，又不会因结合过强而难以释放产物，催化效率最高；长链底物因过强的结合力导致难以释放产物，降低酶的周转率。

有研究以菜籽油为底物，优化水解条件后，使用磷脂酶C水解制备DAG，最终含量为27%^［37］，本研究最终含量为33.5%，DAG中有82%以1，3-DAG的稳定形式存在。1，3-DAG是减少脂肪累积的主要成分，人体摄入后代谢生成1-MAG，因其位阻较大不能合成TAG，从而降低血脂水平^［38］。与直接酯化法和甘油解法相比，水解法具有反应底物简单，无须额外添加酰基受体，反应过程简单迅速等优势，但副产物难以调控，水解过度会生产额外的MAG和游离脂肪酸。因此，提高DAG含量的关键在于控制水解度，需系统优化反应温度、时间、水含量和酶添加量，以达到最佳水解度。

本研究从茶树根际土壤样品中筛选到一株高产脂肪酶菌株E12C，通过形态学观察与16S rDNA鉴定为B. cepacian，命名为B. cepacian OCRI-Lip100。使用特异性引物对KZ-F/KZ-R扩增到975 bp的成熟蛋白基因命名为bclip12c。该菌株产生的新型高活性脂肪酶Lip-12c，在最适温度60 ℃和最适pH 9.0条件下，酶活可达到（190 761.2 ± 5 181.5）U/L，Na⁺和Mg²⁺能显著提高脂肪酶活力，且对C14底物有链长选择性。成功应用于DAG的定向水解制备，含量达33.5%，说明该脂肪酶在酶法制备领域具有较好的应用前景。

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