近年来，蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras,PROTACs）作为一种新兴的技术，通过降解癌基因蛋白稳态，在肿瘤治疗中展现出巨大潜力。然而，传统PROTACs在选择性响应疾病环境刺激和精确扰动目标蛋白方面仍面临挑战，且其高分子量和异双功能结构限制了其在体内的渗透性和疗效。
近日，Angew. Chem. Int. Ed. (IF 16.9）期刊上一篇名为“Enzyme-Activated Orthogonal Proteolysis Chimeras for Tumor Microenvironment-Responsive Immunomodulation”的研究型文章，为了克服这些限制，提出了一种新型的肿瘤微环境响应型酶激活正交蛋白降解嵌合体（Enzyme-Activated Orthogonal Proteolysis Chimeras,ENCTACs）。该技术利用肿瘤微环境中异常表达的酶，通过点击化学反应在肿瘤区域原位形成异双功能降解剂，实现对目标蛋白的特异性降解。这一策略不仅提高了PROTACs的选择性和疗效，还显著增强了其在肿瘤组织中的渗透性，为肿瘤治疗提供了新的思路和方法。
ENCTACs的设计原理：通过点击化学反应在肿瘤区域特异性形成异双功能降解剂，实现对目标蛋白的降解，同时减少对正常细胞的影响。
1. 将3×10³个4T1细胞接种于96孔板的每孔中，每孔总体积为100μL。其中，4T1细胞分别用载体对照（vehicle control）和联合片段Y952 + J558（均为10 μM）处理，处理时间为24小时、36小时和48小时。
2. 在37℃下与CCK-8共同孵育2小时后，使用96孔微孔板读数仪分别测定450nm处的光密度（OD）值。
结果解读：
结果显示，点击化学片段（Y952 + J558）能够显著抑制4T1肿瘤细胞的增殖，且具有时间和剂量依赖性。这种抑制作用是特异性的，对正常细胞（如HEK-293T细胞）的影响较小，表明该点击化学片段具有良好的肿瘤细胞选择性。
实验中使用到的试剂
步骤2中使用到的是MCE的CCK-8试剂盒，货号为HY-K0301。
产品链接：
https://www.medchemexpress.cn/inhibitor-kit/cell-counting-kit-8.html
研究方法与结果
首先，研究人员通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析验证了Y952片段在CTSB酶作用下的裂解过程以及与J558片段的点击化学反应，表明该反应在生理条件下可行。
随后，研究人员利用4T1肿瘤细胞和HEK-293T正常细胞，通过Western blot分析和流式细胞术，证实了点击化学片段在肿瘤细胞中选择性降解BRD4蛋白，而对正常细胞无明显影响，且CTSB活性和蛋白酶体功能对降解过程至关重要。
接下来，研究人员构建了3D 4T1多细胞肿瘤球体（MCTSs）模型，发现点击化学片段相比预合成的Y1106降解剂，在MCTSs中具有更好的渗透性和蛋白降解效率，尤其是在MCTSs的核心区域。
随后，研究人员通过Western blot、免疫荧光成像和流式细胞术，证明了点击化学片段在4T1肿瘤细胞中显著降低了BRD4和PD-L1蛋白水平，显示出其在调节免疫检查点蛋白方面的潜力。
最后，在4T1肿瘤小鼠模型中，通过每日静脉注射点击化学片段、预合成的Y1106降解剂和JQ1，发现点击化学片段显著抑制了肿瘤生长，促进了肿瘤组织中BRD4的降解和PD-L1表达的下调，并增加了CD4+和CD8+效应T细胞的浸润，重塑了肿瘤免疫微环境，增强了抗肿瘤免疫反应。
结语
综合上文，总结了以下关键结论：
-
选择性蛋白降解：ENCTACs能够特异性地在肿瘤细胞中降解BRD4蛋白，而不影响正常细胞。
-
免疫检查点调节：通过降解BRD4蛋白，ENCTACs能够显著降低PD-L1蛋白水平，为肿瘤免疫治疗提供了新的策略。
-
肿瘤渗透性：与传统PROTACs相比，点击化学片段在多细胞肿瘤球体模型中表现出更好的渗透性和蛋白降解效率。
-
体内疗效：在4T1肿瘤小鼠模型中，ENCTACs显著抑制了肿瘤生长，并重塑了免疫微环境，增加了免疫细胞的浸润。
该研究提供了一种新的策略，通过正交点击化学和酶激活的PROTACs技术，实现了在肿瘤微环境中特异性降解目标蛋白，为肿瘤治疗提供了新的思路和方法。这种方法不仅提高了PROTACs的选择性和疗效，还减少了对正常组织的影响，具有潜在的临床应用价值。
参考资料来源：doi.org/10.1002/anie.202423057
本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。
