文章来源
Frontiers in Endocrinology. November 2021;12 :774997
研究类型
实验性研究
材料方法
1.收集胎盘组织：收集IVF-ET妊娠（n=3 ）和自然妊娠（n=3 ）后行剖宫产分娩的胎盘组织样本。并收集8 例IVF-ET 妊娠和8 例自然妊娠来源的胎盘组织作为验证队列。尽可能的在整个胎盘中部选取组织，以最大限度地减少其他部分对基因表达的影响。所有胎盘组织用预冷的PBS 冲洗，并保存在-80°C ，直到随后提取RNA 。组织采集经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准，所有患者在采集样本前均征得书面知情同意。
2.纳入标准：①纳入标准：IVF-ET妊娠后单胎足月分娩；37~42孕周；婴儿出生体重2500~4000 g；年龄20~35岁，无任何妊娠并发症；②选择与之严格匹配的自然妊娠产妇作为对照组，匹配参数包括：产妇的年龄、产次、孕周和胎儿性别等。
3.RNA的提取和测序：分离RNA、验证RNA浓度和完整性，然后对样品进行文库准备和测序。每个样本的测序读段至少为10M，质量大于20的碱基比例大于95%，质量控制符合数据分析的要求。
4.差异表达分析：利用R 3.5.2的DESeq2包 分析差异表达的miRNAs(DEmiRs)和基因 (DEG s)，并使用贝叶斯方法来校正批次效应。以变化倍数>1.5和P<0.05为筛选标准，筛选出差异表达的miRNAs和mRNAs。
5.转录因子靶标的GO富集分析：DEmiRs被上传到FunRich软件，用于筛选上游转录因子以及转录因子途径的增强靶标，并进行GO富集分析。
6.MiRNA-mRNA调控网络的构建:使用miRWalk V2.0、StarB ase和TargetScan数据库预测DEmiRs的靶基因。随后，将预测的靶基因与DEGs 进行匹配，并利用Cytoscape 软件构建miRNA-mRNA 调控网络。
9.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）: 使用ReverTraAce qPCR RT Kit将1 mg总RNA反转录为cDNA。用特异性引物合成miRNAs的cDNA。进行实时荧光定量PCR，将结果归一化到U6，并用2-∆∆CT 方法计算相对表达量的变化。
研究结果
(1) 体外受精–胚胎移植胎盘差异表达基因的鉴定：总共鉴定了12个差异表达的miRNAs包括4个下调的miRNAs：hsa-miR-1269a、hsa-miR204-5p、hsa-miR-224-5p和hsa-miR-941，以及8个上调的miRNAs：hsa-miR-1269b、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-193B-3p、hsa-miR-193B-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-371a-5p、hsa-miR4286和hsa-miR-9-5p。还鉴定了258个差异表达的mRNAs，其中52个下调，206个上调。
(2) 实时荧光定量PCR检测胎盘组织中的DEmiRs：与对照组相比，IVF-ET 组hsa-miR-204-5p 、hsa-miR-1269a和hsa-miR-941的相对表达水平显著下调，而hsa-miR-4286、hsa-miR-31-5p和hsa-miR-125b-5p的相对表达水平分别上调。结果表明，这些miRNAs 的表达失调发生在IVF-ET 来源的胎盘组织中，但需要进一步的验证才能支持测序数据和研究分析的准确性。
(3) 转录因子和GO富集分析:确定了SP1、EGR1、SP4、KLF7、ONECUT1、MYF5、TCF3、NFIC、SRF和HOXB4与DEmiRs之间存在相互调控作用。SP1能够调节大多数DEmiRs。GO富集分析表明，DEmiRs的前5位生物学过程涉及信号转导、核苷酸碱基、核苷酸和核酸代谢的调节、转运、细胞凋亡和免疫反应的调节。大多数基因涉及转录因子活性、转运蛋白活性、RNA结合、受体信号复合支架活性和GTPase活性。前5位富集的细胞成分是细胞核、细胞质、高尔基体、溶酶体和膜筏等。
(4) miRNA-mRNA调控网络的构建：该网络中共有109个DEGs与12个的DEmiRs相互作用。其中下调的DEmiRs，特别是hsa-miR-204-5p、hsa-miR1269a和hsa-miR-941，形成了最广泛的靶基因相互作用网络，而上调的DEmiRs具有更离散的靶基因。
(5) DEGs的功能富集分析：结果发现与血管生成、妊娠、细胞黏附、RNA聚合酶II启动子转录的正调控以及血管生成的正调控相关的生物学过程显著富集。此外，蛋白质结合、poly(A)RNA结合和转录激活剂活性占分子功能的大部分，而最丰富的细胞学组分是细胞外泌体、膜和胞外区域等。KEGG显著富集的通路包括PI3K-Akt信号通路、RAS信号通路以及细胞黏附等。
(6) 蛋白质相互作用(PPI)网络的构建：使用在线STRING 数据库和Cytoscape中的工具构建了一个PPI网络，评估了它们的连接度，并确定了10个关键基因。
(7) 关键基因的生物学分析：使用Cytoscape的cytoHubba插件揭示了IVF-ET中DEGs之间最密切相关的十个基因相互作用。最有可能的关键基因包括EGFR, FOS, SERPINE1, LEP, HGF, EGR1, SPP1, HNRNPA2B1, IGF2 和ENG，这10个基因的KEGG富集分析显示，MAPK信号通路以及PI3K-Akt信号通路被显著富集。
讨论
(1)本研究发现，与自然妊娠胎盘组织相比，IVF-ET妊娠胎盘组织中共有12个差异表达的miRNAs。其中，hsa-miR-204-5p、hsamiR-1269a和hsa-miR-941被证实在IVF-ET胎盘组织中特异性下调。尽管潜在的机制仍不清楚，但有研究表明这三个miRNAs都与胎盘功能障碍和胎儿生长相关。
(2)排名最靠前的转录因子是特异性蛋白1 (SP1)，它是一种锌指转录因子，与多种富含GC的基序结合，调节miRNAs的表达和功能与胚胎发育和分化相关的基因的表达。
(3)我们的研究发现了10个关键基因，大多与胎盘发育和胎儿生长相关。
(4)在miRNA-mRNA调控网络中，下调的DeMiRs具有更广泛的靶基因，特别是miR-204-5p，miR-1269a和miR-941，且这些基因参与调节胎盘功能。 该网络有助于研究这些靶基因是如何受到miRNA的调控而发生表达改变的。DeMiRs对靶基因的调控及对胎盘功能的影响，我们会在后续实验中进一步研究。
(5)由于验证时的所选取样本量相对较少，可能会降低研究结果的可靠性。此外，生物信息学分析提出的分子相互作用和功能关系，需要在实验中验证。
结论
我们的数据揭示了先前发现的与胎盘功能障碍和妊娠并发症相关的miRNAs 和mRNAs以及新的候选基因。这些数据为后续研究IVF-ET对胎盘发育和功能的影响提供了现成的资源，并可能为今后预防和改善不良围产期结局提供基础。
翻译：
张永杰
郑州大学第三附属医院生殖中心研究生
审核：
杨书衡
郑州大学第三附属医院生殖中心研究生，参与完成科技攻关项目一项，参与发表SCI及中文核心论文多篇
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