什么凝胶最过敏新型雾化治疗剂，喷一喷即可高效治疗过敏性哮喘-上海聚慕医疗器械有限公司

研究背景

由于暴露于烟草烟雾和空气污染的增加，呼吸系统疾病逐渐成为全球性问题，同时对临床治疗构成严重挑战。哮喘是一种以呼吸道炎症和气流受限为特征的慢性非传染性疾病，由于其与基因-环境相互作用的复杂相关性，是最常见和最难治的疾病。哮喘患者中有58%发生粘液堵塞，往往粘液堵塞是导致哮喘突然加重的关键因素。因此，除了使用支气管扩张剂逆转支气管收缩之外，粘液溶解治疗对于确诊为呼吸道粘液阻塞的哮喘患者至关重要。几十年来，还原剂一直被用作哮喘的粘液溶解疗法，但由于其较低的还原活性和非靶标刺激作用，仅获得了有限的临床结果。因此，开发生物相容及有效的粘液消解剂在治疗呼吸道梗阻性疾病方面具有重要意义。

工作介绍

近日，中国科学院长春应用化学研究所贺超良研究员团队开发了一种由还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和精氨酸接枝的壳聚糖(CS-Arg)组成的纳米凝胶(CAT)，用于过敏性哮喘的粘液溶解治疗。纳米凝胶与粘蛋白混合后，通过离子相互作用抑制较大粘蛋白聚集体的形成和二硫键的断裂，从而显示出有效的粘蛋白溶解能力。可有效地减轻呼吸道细支气管区和肺泡区的粘液阻塞，并减轻呼吸道炎症反应。所开发的生物相容性抗菌纳米凝胶作为过敏性哮喘治疗的有效粘液溶解剂具有很大的应用潜力。

1.制备了由还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和精氨酸接枝的壳聚糖(CS-Arg)组成的纳米凝胶(CAT)

2.所制备的CAT纳米凝胶在体外可以有效地抑制了粘蛋白大聚集体的形成、破坏粘蛋白中的二硫键，同时对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的增殖均显示出高效的抑制作用。

3. 将纳米凝胶雾化吸入BALB/c过敏性哮喘小鼠后，可有效地减少细支气管和肺泡的粘液阻塞，减轻呼吸道炎症。

Scheme 1. (a) CAT纳米凝胶溶液的制备

和雾化过程 (b)纳米凝胶

作为粘液溶解剂在治疗过敏性哮喘中的应用

该工作发表在ACS Nano上，IF=18.027。

研究思路

论文导读

Figure 1. CAT纳米凝胶的制备及表征

CS-Arg_11.3和CS-Arg_22.7的Arg接枝率分别为11.3%和22.7%，用于研究Arg接枝率对纳米凝胶物化性能和治疗效果的影响。通过核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱和傅里叶变换红外光谱证明了精氨酸成功地连接到壳聚糖骨架上(Figure. 1b-d)。采用离子凝胶法将CS-Arg和TCEP进行交联，得到了CAT纳米凝胶。用CS-Arg_11.3和CS-Arg_22.7制备的CAT纳米凝胶分别命名为CAT-1和CAT-2，并用透射电子显微镜对其形貌进行了表征。在pH为5.5时，CAT-1呈不规则球形结构，而CAT-2主要呈球形结构(Figure. 1e-f)。根据130多个纳米凝胶的统计分析，CAT-1和CAT-2的平均尺寸分别为146±33 nm和90±26 nm(Figure. 1g-h)。测试了纳米凝胶在磷酸盐缓冲液中的粒径和zeta电位，结果表明CAT-1和CAT-2的平均尺寸分别为159.9±2.1 nm和128.0±2.1 nm(Figure. 1i-g)。粒径的轻微增加可以归因于纳米凝胶在水溶液中的膨胀以及pH的变化。在纳米凝胶溶液中加入5，5‘-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，考察纳米凝胶的还原活性。添加DTNB后，TCEP、CAT-1和CAT-2纳米凝胶的溶液呈现明亮的黄色，而PBS、CSArg_11.3和CS-Arg_22.7的溶液呈现无色(Figure. 1k)。这一结果清楚地表明了2-硝基-5-硫代苯甲酸酯(NTB)的生成是由于CAT纳米凝胶的还原作用导致DTNB的二硫键断裂所致。还研究了TCEP从CAT纳米凝胶中的释放行为，通过测量释放介质与DTNB混合后的NTB量来计算释放过程中TCEP的有效量(Figure. 1l)。CAT-1和CAT-2在1-3 h内均表现出较快的TCEP释放，表明TCEP能快速有效地破坏DTNB二硫键。

Figure 2. CAT纳米凝胶抗菌能力

粘液纤毛清除功能障碍会导致某些病原菌的定植，产生的毒素和代谢产物会引发炎症反应，从而加重哮喘。因此，抑制细菌生长对哮喘的治疗具有重要意义。评估了CS-Arg、TCEP和CAT纳米凝胶对金黄色葡萄球及大肠杆菌的抗菌活性。细菌所对应的光密度(OD)值随着材料浓度的增加而以相似的速度逐渐下降，表明它们的抗菌效果相似(Figure. 2a-b)。而TCEP对大肠杆菌无明显抑菌作用，可能是因为不同细菌对半胱氨酸(Cys)残基的需求不同。此外，CAT-1和CAT-2纳米凝胶对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的增殖有明显的抑制作用(Figure. 2c-k)。培养1h后，CAT-1和CAT-2纳米凝胶对细菌的抑菌率均大于99.99%；24h后，抑菌效果几乎接近100%(Figure. 2d-i)。细菌活死染同样证实了CAT纳米凝胶优异的抗菌效果(Figure. 2j-k)。

Figure 3. CAT纳米凝胶的生物安全性及粘液溶解能力

由于吸入药物的潜在毒性在临床应用中是至关重要的，通过与NIH 3T3、A549和L929细胞培养，采用CCK-8法评估CS-Arg、TCEP和CAT纳米凝胶的细胞相容性。如Figure. 3a-c所示，与CS-Arg或CAT纳米凝胶孵育的细胞在材料浓度高达5 mg m L⁻¹时细胞存活率仍在80%以上，这表明该纳米凝胶具有较低的细胞毒性和较好的细胞相容性。此外，在NIH3T3、A549和L929细胞与纳米凝胶孵育24小时后的活死染色显示有很高的存活细胞百分比，这进一步验证了CAT纳米凝胶良好生物相容性(Figure. 3d)。虽然CS-Arg_11.3和CS-Arg_22.7共聚物分别与CAT-1和CAT-2纳米凝胶具有相似的抗菌效果和细胞相容性，但共聚物的溶解性低于纳米凝胶。CS-Arg共聚物倾向于形成粘性流体在PBS中缓慢扩散，而CAT-1和CAT-2纳米凝胶迅速分散在PBS中并形成均匀的水溶液(Figure. 3f)。纳米凝胶改善了水的分散性和溶解性，有利于雾化和肺部吸入。将与呼吸道粘液的组成相似的猪胃粘蛋白分别与CS-Arg、TCEP或纳米凝胶混合，研究其与粘蛋白之间的相互作用。用透射电子显微镜观察了混合物的形态，由于钙离子和二硫键介导的粘蛋白−粘蛋白相互作用，发现了许多粘蛋白颗粒的大聚集体(Figure. 3e)。然而与CAT-1或CAT-2纳米凝胶孵育的粘蛋白完全分散在尺寸小于1μm的小颗粒中，这可能是由于离子相互作用和粘蛋白内部二硫键被破坏的共同作用。这表明CAT-1和CAT-2纳米凝胶具有比TCEP或CS-Arg更强的粘液溶解能力。

Figure 4. CAT纳米凝胶在过敏性哮喘模型中的应用

建立卵清蛋白(OVA)诱导的Balb/c小鼠过敏性哮喘模型。如图Figure. 4a所示，于第27−31天分别给予不同的化合物，如PBS、NAC、TCEP、CAT-1纳米凝胶和CAT-2纳米凝胶。治疗结束后处死小鼠，取肺进行AB-PAS和H&E染色，收集支气管肺泡灌洗液(BLF)进行Wright Giemsa染色。由于粘液阻塞在过敏性哮喘突然加重的因素中起着关键作用，AB-PAS染色用来观察呼吸性细支气管和肺泡粘液阻塞情况。PBS和NAC组的肺图像显示紫蓝色染色的面积比其他组大，这表明PBS或NAC治疗的过敏性哮喘小鼠肺部粘液显著积累，而CAT-1组的粘液面积百分比与健康组相当，表明其显著的粘液溶解效果(Figure. 4b)。虽然经TCEP治疗的过敏性哮喘小鼠肺泡内黏液积聚明显减少，但呼吸性细支气管内黏液积聚并未减少(Figure. 4c)。黏液从呼吸性细支气管处的清除受到抑制可能会导致呼吸道细菌感染和慢性炎症，随后采用H&E染色和Wright Giemsa染色评价呼吸道炎症反应。PBS组、NAC组和TCEP组的细支气管炎性细胞聚集，表明肺和细支气管炎性改变，相比之下，CAT-1、CAT-2和健康组小鼠细支气管周围未见明显的炎性细胞聚集(Figure. 4d)。此外，收集浸泡在BLF中的炎性细胞并用Wright Giemsa试剂进行染色，结果CAT1和CAT-2处理组BLF中的炎性细胞数量减少，与健康组相当(Figure. 4e)。以上结果表明，CAT-1和CAT-2可有效减轻哮喘小鼠的呼吸道炎症反应。

论文亮点

1. 所制备的CAT纳米凝胶具有良好的生物相容性、优异的抗菌效果以及有效的粘液溶解能力。

2. 该纳米凝胶可有效地减少细支气管区和肺泡区的粘液阻塞，减轻呼吸道炎症。有望成为一种有效治疗过敏性哮喘和其他黏膜阻塞性疾病的粘液溶解剂。

文献链接

Dan Zhao, Dong Li, Xueliang Cheng, Zheng Zou, Xuesi Chen, and Chaoliang He*

Mucoadhesive, Antibacterial, and Reductive Nanogels as a Mucolytic Agent for Efficient Nebulized Therapy to Combat Allergic Asthma. ACS Nano. 2022. DOI: 10.1021/acsnano.2c03993.