二次谐波生成（Second Harmonic Generation, SHG）是一种非线性光学效应，源于光与物质相互作用后发射出波长为入射光一半的光子。该过程无需荧光标记，可直接对非中心对称结构（如胶原蛋白纤维、微管等）进行成像。SHG显微镜通常集成于常规多光子成像系统之中，为厚组织样本乃至活体大脑的无标记成像提供了前所未有的技术手段。
传统脑显微镜技术长期面临对比度不足与厚组织成像困难的挑战。SHG技术凭借其高分辨率、三维成像能力及对特定生物结构的特异性，成为解决这些问题的关键工具。它尤其擅长对胶原纤维和其他非中心对称蛋白原纤维进行成像，不仅适用于固定样本，更可直接应用于活体大脑研究。
脑与脊髓损伤
SHG成像能清晰显示损伤后脑组织中胶原沉积的变化，为创伤修复机制研究和治疗效果评估提供了重要的形态学依据。
脑肿瘤与纤维化
在胶质瘤研究中，SHG可有效可视化肿瘤相关基质中胶原网络的结构重塑，这对于理解肿瘤侵袭性和肿瘤微环境变化至关重要。此外，该技术在监测与肿瘤发生相关的纤维化进程中也表现出巨大潜力。
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease）
SHG为观察该疾病进程中可能出现的异常蛋白聚集和细胞外基质改变提供了新的视角，有助于揭示其病理机制。
神经植入物引发的异物反应
通过SHG成像，研究人员能够细致观察神经植入物周围由机体免疫反应引发的胶原包裹的形成过程，为改善植入物生物相容性提供了直观的研究手段。
脑膜成像
SHG技术能够对脑膜中的胶原结构进行高对比度成像，为研究脑膜相关疾病提供了新的工具。
除了SHG，三谐波产生（Third Harmonic Generation, THG）技术也展现出重要价值。当三光子共振与血红蛋白的Soret吸收带增强结合时，THG能够高分辨率地解析血管壁的微观结构以及神经血管单元中星形胶质细胞终足（end-feet）的形态。SHG与THG的结合使用，为全面研究脑部微观结构（尤其是神经血管界面）提供了更强大的多模态成像方案。
SHG显微镜不仅是胶原成像的利器，同样是研究星形胶质细胞和神经纤维内部微管结构的有力工具，拓展了其在神经科学研究中的应用范围。
随着图像数据量的激增，人工智能（AI）技术，特别是机器学习与深度学习算法，正被广泛应用于SHG显微镜数据的自动化处理与分析中。AI方法显著提升了对复杂生物结构的识别、分割和量化效率，为从海量图像中提取具有生物学意义的信息提供了强大支持。
SHG显微技术在脑成像领域的应用前景广阔。其方法论不仅限于神经科学，在更广泛的组织病理学研究中也具有极大的推广潜力，例如在心脏病、肝纤维化或皮肤病理学等领域。未来的技术发展将致力于进一步提升成像速度、深度和分辨率，并加强与其它光学成像模式及功能学测量的融合。
