以合成信使RNA（mRNA）为基础的治疗方法在基因和细胞治疗、基因组工程、酶替代治疗及现在全球SARS-CoV-2大流行期间的疫苗开发中越来越受欢迎。可以通过酶促体外转录（IVT）反应合成mRNA，并输入体内。成熟的mRNA需要一个5’帽子结构，以保证基因表达和mRNA的稳定性。有两种加帽方法：通过两步多酶法或共转录法。与酶法加帽相比，共转录法可以最大限度地减少反应步骤与酶的使用量。CleanCap® AG共转录法在体外转录上，可使样品体外转录后得到5mg/ml，有94%的5’-cap 1结构。这与第一代帽子类似物（如mCap和ARCA）相比效率较高。第一代帽子类似物会引入Cap0结构，效率和反应产量较低。这篇文章介绍了使用TriLink生物技术公司的CleanCap® AG进行体外共转录加帽。
介绍
合成的信使RNA（mRNA）在各种临床应用中显示出巨大的潜力，如疫苗和遗传疾病治疗，蛋白替代疗法、干细胞重编程和基因编辑。转录表达合成mRNA在这些应用中是可取的，因为它避免了病毒系统带来的基因组插入风险。mRNA在制造、可扩展性和传递方面的优势，扩大了它作为治疗手段的应用。目前，多种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗正在进行临床试验，形成了现代生物史上的快速药物开发项目。现有两种mRNA疫苗被美国FDA授权用于紧急使用，其中一种使用的是CleanCap技术。
mRNA是由RNA聚合酶从DNA通过转录所得。RNA聚合酶与DNA的启动子区域结合，形成一个转录起始泡。与DNA互补的核苷酸通过形成磷酸二酯键在5’至3’的方向上添加。在体外，将DNA模板、RNA聚合酶和核苷酸三磷酸（NTPs）与含镁缓冲液、RNase抑制剂和无机焦磷酸酶混合，可得到同样的过程。
图1成熟mRNA的结构，依次从左侧5’端至右侧3’端。UTR：非翻译区；ORF：开放阅读框（或目标基因的编码序列）；Poly(A)尾巴会有长短变动。
传统的T7 RNA聚合酶反应用三磷酸鸟苷启动转录，形成一个5’-三磷酸RNA，产生一个帽子结构，然后需要第二次酶处理。除此方法外，加帽可通过在体外（IVT）使用加帽类似物来构建，即共转录加帽，加帽类似物与NTPs、DNA质粒和RNA聚合酶一起被加入体外反应中，在一个容器中反应生成成熟的mRNA。这种 “一锅式 “反应减少了生产步骤，从而减少了整体处理时间、纯化步骤和处理时间、纯化步骤和所需酶量，降低了mRNA制造的成本和复杂性。第一代帽子类似物会生成Cap0结构，且反应产量和盖帽效率低。因此，开发了一种新的帽子类似物，由RNA聚合酶结合生成Cap1结构。如图2A所示，用CleanCap AG三聚体进行共转录加帽，在一锅法合成中产生94%（或更高）的cap 1 mRNA，从而使mRNA体外产量达到5mg/ml。转录由T7启动子序列的下端开始，CleanCap三聚体通过互补碱基配对与模板的+1和+2核苷酸结合，后续再在+3位置加入互补的NTP，如图2B所示。
图2 用于与T7 RNA聚合酶共转录的CleanCap AG类似物结构。(A）CleanCap AG三聚体的结构(TriLink Biotechnologies, cat no. N-7113)。(B）T7 RNA聚合酶启动子序列（下划线部分）与CleanCap AG所需的起始序列。箭头表示转录起始点，标注了核苷酸的位置。
方法描述了使用CleanCap AG试剂进行共转录加帽，通过体外反应合成5mg/ml的cap 1 mRNA，可选择用DNase I处理，（Protocol 1）。在体外合成后，mRNA被纯化，并通过紫外可见分光光度法和变性凝胶电泳法进行分析，（Protocol 2）。
Protocal1合成策略
DNA模板设计
DNA模板设计对于成功转录是一个重要组成部分。一个mRNA的体外转录需要一个含有编码所需信息的DNA模板，起始包括一个RNA聚合酶的启动子位点。模板可以是线性化质粒或PCR产物的形式。模板必须包含T7 RNA聚合酶启动子序列、5’-UTR、ORF和3’-UTR。使用生物信息学软件对ORF进行序列优化可以改善应用范围(Vaidyanathan et al., 2018)。mRNA的转录也需要加尾poly（A）tail。加尾可以包含在质粒中，通过PCR添加，或通过酶促聚腺苷酸化在转录后添加。值得注意的是，酶促聚腺苷酸化会导致加尾长度的不均一性。最佳的加尾长度因序列和应用而不同（Jalkanen, Coleman, & Wilusz, 2014）。质粒设计必须涵盖一个特定的限制性酶切位点，用于下游纯化所需的3’-端，如图3A所示。如果需要一个超出质粒内加尾长度的更长加尾，或目前质粒不包含转录所需的T7启动子区域，那么倾向于用PCR模板的方式，如图3B。
图3 DNA模板结构的例子。(A) 质粒DNA模板必须包含IVT所需的所有要素，并涵盖一个针对poly(A)尾部的限制性酶切位点。(B) PCR引物可以添加或缺少的要素，如T7启动子或poly(A)尾巴。(a) 抗生素抗性；（b）复制起源；（c）T7启动子；（d）5’-UTR；（e）ORF；（f）3’-UTR；（g）poly（A）；（h）限制性酶切位点。
虽然CleanCap有可能在SP6或T3 RNA聚合酶上发挥作用，但据目前所知，CleanCap AG只在T7 RNA聚合酶上进行过测试。图2B显示了正确的T7启动子序列（下划线）和CleanCap AG起始序列。
在酶切或PCR之后，DNA模板须被纯化，以去除酶和反应成分。市售的柱纯化，如QIAGEN的Plasmid Plus试剂盒（cat no. 12941等），或苯酚/氯仿提取后乙醇沉淀（Dowhan, 2012）。这些是常用的DNA纯化方法。如果模板是通过苯酚/氯仿提取制备的，在IVT之前须从DNA模板上去除残留的苯酚，因为苯酚可能会引起酶的变性。
无核糖核酸酶的环境
在IVT反应中，RNase会使mRNA产物降解。所有的试剂须是严格的无RNase环境，在可能的情况下，使用专用的无RNase、带过滤的吸头。
IVT后
确定转录后是否需要进行任何额外的酶促反应。例如，采用DNase I处理来降解模板，当使用不容易从DNA中分离出RNA的纯化方法时，DNase I是必不可少的。纯化和分析方法应在开始IVT前确定。长期储存反应混合物对IVT产品有负面影响。所以需确保下游步骤中的所有设备和试剂都是可用的。可参考图4的工作流程
图4 工作流程图。Protocol 1描述了使用CleanCap AG共转录加帽类似物的IVT，其中 DNase I可选。样品可进行粗略分析或纯化后分析。Protocol 2描述了mRNA纯化的选择，并详细说明了LiCl 沉淀的细节。虚线代表可选的工作流程。实线表示需要的工作流程。
用CleanCap进行IVT
本部分描述了用包含T7启动子位点和poly（A）轨道的DNA模板，与CleanCap AG类似物共转录，来进行IVT，以产生cap 1 mRNA。一个DNase I处理步骤是可选的。反应组分将被混合并在37℃下孵化一段时间，发生RNA聚合反应。反应规模可根据目标加帽mRNA的产量进行调整。下述方案可平均收获5mg/ml的加帽RNA；实际产率会受模板长度和模板质量影响。通过对合成条件的优化，可获得更高的产量。如需要，可将粗制的mRNA的等分试样在纯化前通过凝胶电泳分析，来确认反应是否成功(步骤12)。随后应立即进行IVT产物的纯化（见Protocol 2）。
试剂耗材信息
10% 漂白溶液
无RNase无DNase污染的水
RNaseZAPTM (Ambion, cat. no. AM9782) 或类似产品
70% 乙醇溶液
ATP, 100 mM (Thermo Fisher, cat no. R0481 或其他类似产品)
CTP, 100 mM (Thermo Fisher, cat no. R0481或其他类似产品)
GTP, 100 mM (Thermo Fisher, cat no. R0481或其他类似产品)
UTP, 100 mM (Thermo Fisher, cat no. R0481或其他类似产品)
CleanCap AG®, 100 mM (TriLink Biotechnologies, cat. no. N-7113)
10×IVT缓冲液
纯化的DNA转录模板 (500-1000 μg/ml)
10× DNase I 反应缓冲液 (可选; NEB, cat no. B0303, 或其他类似产品)
DNase I, 无RNase (可选, NEB, cat no. M0303, 或其他类似产品)
RNase抑制剂, 小鼠, 40 U/μl (NEB, cat no. M0314, 或其他类似产品)
无机焦磷酸酶, yeast, 0.1 U/μl (NEB, cat. no. M2403, 或其他类似产品)
T7 RNA聚合酶, 50 U/μl (NEB, cat. no. M0251或其他类似产品)
37°C水浴或加热块
微型离心管，不含核酸酶 (VWR, cat. no. 87003-294, 或其他类似产品)
台式涡旋
微型离心机
微量移液管
低温酵素冷却器或冰桶
封口膜
准备试剂
1. 在开始反应前清洁工作区，避免常见的实验室污染物。用10%的漂白剂处理表面和移液器，确保没有核酸交叉污染。让漂白剂在表面停留10分钟。用不含RNase的水擦拭所有漂白过的表面和移液器，然后用RNaseZap和70%乙醇擦拭。
经常更换手套以确保没有来自实验室其他区域的RNase污染。
2. 平衡水浴在37℃条件下。
3. 在室温下解冻NTPs、10×IVT缓冲液和质粒转录模板。涡旋NTPs和10×IVT缓冲液直至均匀。短暂旋转试管以收集瓶盖中的液体。
检查转录缓冲液是否有沉淀。如果发现有沉淀，将缓冲液在37℃加热2分钟。再次涡旋并检查是否有沉淀物。重复升温和搅拌，直到没有沉淀物为止。
切勿涡旋模板或酶。
准备反应
4. 在一个无RNase的试管中混合各组分。对于一个1ml的反应，参照表1中列出的用量。反应可根据最终所需的mRNA产量，以约5mg/ml mRNA为基础，加减这些用量。按照表中所列的顺序加入各成分。
加入10×转录缓冲液后，涡旋该溶液以确保在添加其他试剂之前已充分混合。短暂旋转试管从管帽中收集液体。
通过移液枪吹打混匀或轻轻倒置来混合模板，然后在适当大小的离心机中短暂的旋转。长模板（>8kb）可以加到100μg/ml的最终浓度，以达到与短模板相似的摩尔浓度。
酶在台面上时应使用冰桶或酶冷却器保持低温。轻轻地弹动酶或倒置以进行混合。由于酶是高度粘稠的，需缓慢移液。
5. 小心的移液将总反应混合均匀。用封口膜密封。
避免用力搅拌或产生气泡。
孵化反应
6. 在37℃的水浴中或加热块中孵育反应。
建议使用parafilm封口膜以防止样品蒸发和潜在的污染。
对于短于4kb的转录本，孵化2-3小时。对于长于4kb的转录本。孵化2小时，以减少可能导致RNA降解的热暴露。
DNase I处理（可选）
7. 解冻10×DNase I反应缓冲液并涡旋混合。
在IVT孵化过程中开始解冻缓冲液。
8.将10×缓冲液加入结束的IVT反应液中。表2中的体积可以放大或缩小，以配合实际使用量。
9. 将DNase I 酶加入结束的IVT反应液中
处理酶的注意事项与上述相同。
10.轻轻混合至均匀。
11.在37°C下孵育DNase反应至少15分钟。
对于较大的反应体积，溶液可能无法立即平衡到37°C；考虑在使用前预热DNase缓冲液。
留样分析
12. 保存20微升反应液于4℃，用于排除故障。
具体参见结果讨论部分。
纯化IVT产物
13. 将剩余的IVT反应液纯化（protocal2，步骤3）。
protocal2 mRNA纯化分析
有几种纯化带帽 mRNA 的方法可供选择。CleanCap AG mRNA的方法适用于未加盖、酶法加盖或ARCA加盖mRNA的纯化。本操作规程描述了氯化锂沉淀法，类似于Dowhan (2012) or Walker and Lorsch (2013)的方法，本操作规程描述了氯化锂沉淀IVT，氯化锂沉淀采用高浓度的锂阳离子来选择性地沉淀RNA。mRNA被沉淀后，含有IVT盐、游离NTPs、蛋白质和DNA的上清液被丢弃。在这个纯化方法中，转录后的DNase I处理是可选的，已将确保完全去除模板DNA。
纯化后，应检测mRNA产物以评估产量和质量。最常见的可视化技术是凝胶电泳。电泳技术通过利用RNA分子恒定的质量电荷比，实现了基于大小的分离。电泳通常是通过琼脂糖凝胶电泳进行的，它利用琼脂糖板的多孔性，以样品特定的浓度上样，将核酸与已知大小的标记物一起分离。在样品溶液中施加电压，带负电荷的RNA 分子被迫通过一个尺寸选择性矩阵向阳极迁移。在变性条件下，RNA通过基质的迁移率几乎完全由其长度决定。。这个操作规程提供了使用乙二醛负载染料使RNA变性的步骤。它通过消除二级结构对凝胶迁移的影响来提高尺寸的准确性。
试剂与耗材
70% (v/v)乙醇
mRNA原液 ( Protocol 1, step 13)
7.5 M 氯化锂溶液 (Thermo Fisher, cat. no. AM9480 或类似产品)
可选的复溶缓冲液：例如，无RNase的水，1×TE缓冲液, pH 8.0, 1mM 柠檬酸钠 pH 6.4
琼脂糖
NorthernMaxTM-Gly 凝胶制备/检测缓冲液, 10× (Thermo Fisher, cat. no.AM8678)
NorthernMaxTM-Gly 样品上样染料 (Thermo Fisher, cat. no. AM8551, or similar)
溴化乙锭
MillenniumTM RNA 标记物 (Thermo Fisher, cat. no. AM7150, 或类似产品)
冷藏离心机和适合在18,500×g下离心的转子
适当容量和强度的离心管
NanoDrop（Thermo Fisher）或带比色皿的紫外可见分光光度计
50°C水浴或加热块
带电源的凝胶设备
凝胶成像仪
琼脂糖凝胶电泳的其他试剂和设备（见Protocols: Armstrong & Schulz, 2008)
准备试剂
1. 准备好70%的乙醇，使用前在-20°C冷藏至少1小时。
溶液也可在干冰上快速冷却。
2. 开始冷却离心机至4°C。
如果样品在-20°C孵化过夜，这个准备步骤可以在第二天进行。
沉淀样品
3. 将Protocol 1 第 13 步中的mRNA原液转移到一个能承受至少18,500×g；容量为当前体积1.5倍的离心管中。
经过DNase I和粗保留（见Protocol 1），体积应约为1.3ml。
如有必要，可将RNA溶液分成多个离心管。只是这可能会降低样品回收率。
4. 加入2.5M终浓度的氯化锂溶液。
7.5M氯化锂的体积将是mRNA溶液体积的二分之一。对于1300μl的RNA，加入650μl的LiCl，新的总体积为1950μl。
5. 通过轻轻的倒置或旋转进行混合。不要涡旋或摇晃。
6. 在-20°C冷冻至少30分钟。
较长的孵化时间通常会导致较大的沉淀物形成，从而增大样品的回收率。如有必要，样品可在氯化锂中存放过夜。避免孵化时间超过24小时。
7. 在18,500×g，4°C下离心30分钟。
注意管子在转子中的方向，以便知道离心后预期的颗粒会在哪里找到。例如，在一个1.7ml的样品管中，盖子的铰链可以放在转子的最外缘。离心后，颗粒将被发现在铰链下方的管壁上。
8. 8. 丢弃上清液，注意保留颗粒和可能较小的颗粒碎片。
9. 9. 用步骤1中准备的70%的冷乙醇清洗颗粒。使用沉淀管允许的最大体积，将乙醇加入到沉淀颗粒上，直到它从管壁上移开，让沉淀颗粒在乙醇中轻轻移动。
10. 将沉淀颗粒在70%的乙醇中离心5分钟，12,000×g，4℃。
11. 丢弃上清液。在不干扰沉淀物的情况下，尽可能多地去除残留的洗涤液。
12. 重复步骤9-11，进行第二次洗涤。
13. 沉淀物干燥。
洗涤后，颗粒将是白色和不透明的。随着乙醇的蒸发，它将变得越来越半透明。让尽可能多的乙醇蒸发，不要让颗粒完全变干。通常干燥时间为5到10分钟。
复溶mRNA沉淀样品
14. 将沉淀物复溶于选择的缓冲液中。
根据mRNA目标浓度决定缓冲液体积进行复溶。假设回收率大约为初始 mRNA 质量（5 mg）的 80%，除非沉淀物的量与之明显不符。例如，为了达到 4 mg/ml 的浓度，加入 1 ml的复溶缓冲液。
如果颗粒难以溶解，可将其在复溶缓冲液中短暂加热至37°C 以增加溶解度，或在4°C的复溶缓冲液中孵化过夜。
为了样品稳定，选择pH值为6-8的缓冲液。浓度为1mM的EDTA将保护mRNA不受二价阳离子影响。然而，它将抑制任何下游纯化的酶处理。因为酶的活性需要这种阳离子。相同浓度的柠檬酸钠也能够螯合二价阳离子，此外还能作为一个低pH值的缓冲系统。
测量mRNA浓度
15. 根据制造商的说明，使用NanoDrop读取纯化的mRNA在260nm处的吸光度。
对于传统的比色皿读数，在10mM Tris-HCl pH 8.0中1:10稀释样品。请参考protocal Gallagher & Desjardins (2011)。为了用确切的消光系数，对于长的RNA可以使用40 OD/μg的转换系数来估算样品的浓度。
通过凝胶电泳使mRNA结果可视化
可参考 Protocol Armstrong and Schulz (2008)
16. 在1× NothernMaxTM-Gly running缓冲液中融化琼脂糖。
凝胶百分比取决于预期的mRNA长度；在大多数情况下1%的琼脂糖就足够了。
17. 让琼脂糖冷却 10 分钟。每100ml融化的琼脂糖加入1μl溴化乙锭，搅拌混合。将琼脂糖倒入仪器中，让其定型30分钟。等凝胶凝固后，用1×running缓冲液填充样品室。
18. 用NorthernMaxTM-Gly上样染色液处理RNA样品。样品在50°C下孵育30分钟。
上样染色液将以1:1的比例加入到RNA中。根据孔的容量，在与染色剂混合之前，RNA可以在混合前用水预先稀释。在protocal 1，步骤12中保存的原液可以和纯化的产品一起分析。
这种染料含有乙二醛，通过将乙二醛加合物共价连接到碱基配对所需的氢键位置，使RNA不可逆转地变性。（Rio，2008）。
19. 将size marker和变性的RNA样品装入凝胶孔中并施加电压。
20. 凝胶成像
分装留样
21. 纯化后，将加盖的mRNA等分到一次性小瓶中，在-80℃下长期保存。
短期储存在-20°C可保存几周。
单个分装量根据后续应用而定。
试剂和溶液
体外转录（IVT）缓冲液，10×
400 mM Tris-HCl pH 8.0
165 mM 乙酸镁
100 mM二硫苏糖醇（DTT)
20 mM精氨酸
0.02% (v/v) Triton X-100
新鲜的转录缓冲液对于最佳聚合酶活性至关重要，因为DTT可能会随着时间的推移而氧化。可选择在-20°C储存单次使用量，或在使用前新配置10×缓冲液。
背景介绍
作为基因表达的中间代码，信使RNA可以被用于一些研究和治疗。通过直接传递合成的mRNA到细胞，几乎任何目标蛋白质都可以被暂时表达。通过体外mRNA的生产优化，可以获得高纯度和完整的分子结构。如果缺少适当的流程，就会费时且费钱。IVT产品的纯度和结构在传递到细胞时十分关键。模式识别受体（PRR）检测到来自非自身的RNA，并在结合双链RNA（dsRNA）、未加帽的RNA或部分加帽的RNA时触发干扰素、白细胞介素和促炎细胞因子的释放。为了解决dsRNA诱导的免疫原性问题，修饰的NTP如假尿苷（Ѱ）、N1-甲基-Ѱ、5-甲氧基尿苷等已被替换为尿苷碱，以逃避PRR的激活。另外，离子配对反相（IPRP）HPLC方法；纤维素色谱法可以用来清除IVT后的dsRNA污染物。为了合成5’-cap这个唯一不直接来自模板DNA的物质，已经开发了两种主要的方法：多步酶法加帽或共转录加入cap类似物。
5’-帽结构由一个N7-甲基化的鸟苷（m7G）组成，通过5’-到5’-O-三磷酸桥与第一个核苷酸相连（称为cap 0）。对+1核苷酸的核糖进行可选的2’-O-甲基化会产生cap 1结构（ m7 GpppN 2’ Ome N），对+1和+2核糖进行2’-O甲基化会产生cap 2结构。通过酶促反应可以有效地产生cap 0，它可以通过另外2’-O-甲基转移酶转化为cap 1。这些反应涉及对温度敏感的甲基供体S-腺苷蛋氨酸，并发生在T7 RNA聚合酶IVT反应之后。这第二种酶促反应需要更多的产品处理流程和高温下更长的孵育时间，以使分子的5’-末端的结构失效，从而利于酶的接近，整个过程可能导致mRNA的降解。
与ARCA二聚体共转录加帽产生一个cap 0结构，需要IVT中特定的GTP浓度，以允许加帽类似物竞争单一的核苷酸来启动转录。这导致了较低的反应产量（约3mg/ml的反应量），较低的mRNA质量（由于有限的NTP耗尽，全长产品被截断），以及较低的5’加帽率，因为需要额外的纯化以消除最终mRNA产品中的免疫原性5’-三磷酸物质。在哺乳动物体内使用时，cap 1通常会导致更高的基因表达，而cap 2 mRNAs还没被广泛地研究。因此，需要在单一步骤中进行可扩大的共转录cap 1 mRNA生产。
将化学合成的cap类似物从二聚体扩展到三聚体，可以直接生产cap 1，且对+1核苷酸的碱基组成有更大的灵活性（美国专利号：20180273576；Hogrefe, Lebedev, McCaffrey, & Shin, 2018）。同样，将加帽类似物从三聚体扩展到四聚体，在IVT期间有可能出现cap 2引发的5’-端。CleanCap AG三聚体可以有94%或更高的cap 1 mRNA一步反应，IVT的RNA产量也从3增加到5mg/ml。由于在转录过程中没有NTP浓度的限制，与其他方法相比，全长mRNA的质量也有所提高，因为其他方法往往在GTP底物耗尽时出现截断产物。
Sikorski等人（2020年）最近的结果表明，共同转录三聚体帽子类似物的概念，结果显示在某些细胞类型中，cap 1比cap 0的基因表达量增加。然而，模板序列没有针对三聚体杂交和相对于 “TATA “框的+1和/或+2位置的帽子类似物进行适当的调整。我们发现，当DNA模板被设计成与+1和+2位置的帽状类似物杂交时，加帽效率会提高（图2B）。
相关讨论
产品产量质量低
步骤中组分的混合对 IVTs的结果都很重要。如果反应液没有被混合均匀，某组分在使用前没有被混合均匀，或者省略了某个成分，就可能出现mRNA产量质量低的情况。需注意，反应缓冲液需要新鲜的DTT以获得最佳的酶活性。氧化的缓冲液可能导致低产量低质量的mRNA，增加截断的转录物的产生。热传导不完全也可能导致低的反应产量；混合均匀的水浴加热是可行的。避免使用反应抑制剂，如RNase和EDTA。将IVT中的NaCl量限制在100mM以下。在反应过程中以及在任何后续过程中保持pH值在8或更低，以避免mRNA的碱性水解。加入DNase酶会立即降解T7 RNA聚合酶的DNA临时底物，该步反应只应在指定的IVT反应时间后进行。
IVT过程中CleanCap试剂和NTPs的比例对于加帽和mRNA的反应产量至关重要。如果反应设置中每个NTP比Clean Cap的摩尔过量，使NTP在启动时与Clean Cap三聚体竞争（在+1和+2位置与模板杂交），则可能发生不完全加帽。Protocal 1中的适当比例是每个NTP为5mM，Cap类似物为4mM。
DNA模板序列和质量也会影响mRNA的质量。模板DNA序列必须包括完整的T7启动子共识序列（下划线），后续序列为5’-AG （TAATACGACTCACTATAAG）。TATA 框中的3’-A并不作为启动点。酶法或ARCA加帽设计的传统转录模板必须经过诱变，以5’-AG为起始点。如果模板中存在高度结构化的序列，如T7终止点或热力学上有利的发夹，在聚合过程中产生阻滞，可能会发生mRNA的截断。最佳的模板设计可能需要根据经验来确定。通常认为DNA的A260/A280纯度比应接近1.8。比率较低可能表明有残留的苯酚，它在280nm处吸收最大。如果在IVT后观察到比预期长或短的RNA分子，应确认DNA模板具有适当的大小。不完全的线性化可能导致较长的RNA分子，因为T7 RNA聚合酶将继续通过任何未酶解的DNA模板进行读取。短于预期的分子可能是由质粒酶切中的多个切割点或PCR中的多个引物结合点无意中形成的截断的DNA模板造成的。
RNA的完整性
RNA可能很难处理，因为它不如DNA稳定，而且很容易被核糖核酸酶（RNases）降解。RNases可以通过试剂、吸头、试管、瓶子、表面和人体接触引入。如同在上文中所讨论的，只使用不含RNase的耗材。在设置、转录和处理 mRNA 产品时一定要戴上手套。经常更换手套。表面和移液器可以用RNaseZap或类似的RNase清洁液擦拭以破坏RNase。
设置必要的纯化和分装样品是保持分子完整性的关键。在整个过程中，限制处理时长是至关重要的。减少IVT后mRNA的加工步骤和处理时间。避免冻融，并预先准备好一次性使用的冻存分样管来储存最终产品。
mRNA的纯化
转录反应必须被淬灭和纯化，以获得不含蛋白质、DNA、NTPs 和缓冲剂成分（如镁）的 mRNA，因为镁在高温下可能导致磷酸二酯的裂解。残留的 DNA 和蛋白质可能会影响 mRNA 的后续应用，而残留的游离 NTPs 会导致紫外光谱仪测量的数量虚高。去除dsRNA污染物对体内使用至关重要，以防止免疫反应。
沉淀是一种手工纯化方法，需要熟练的技术来避免原料的损失。替代的纯化方法包括硅膜柱、制备型HPLC或Poly(A) tail的oligo(dT)捕获。硅膜纯化试剂盒，如RNeasy(Qiagen, cat no. 75162)，用乙醇和混盐处理RNA溶液，选择性地结合核酸，使盐类、游离的NTPs和蛋白质在比氯化锂沉淀更短的处理流程中被去除（见Protocols：Dowhan, 2012）。这种膜会保留完整的模板DNA；需要在转录后再进行DNase I处理。固定化的oligo(dT)将与mRNA的poly(A)尾结合。这种方法的结果是全长样品的高纯度，大部分截断的mRNA分子会被洗脱掉。通常，固定化的oligo(dT)树脂和mRNA样品在高盐缓冲液（约0.5M NaCl）中平衡，以防止带负电荷的磷酸盐骨架之间的排斥。mRNA被加载到树脂上，其poly(A)尾部与oligo(dT)形成氢键，通过典型的碱基配对固定下来。中间盐洗（约0.1M NaCl）去除未结合的杂质，纯化的mRNA用低盐缓冲液或水洗出。适合使用spin柱或磁珠进行小规模oligo(dT)纯化的商业试剂盒广泛存在（例如Qiagen, cat no. 70022, NEB, cat no. E7490, 或 Thermo Fisher, cat no. AM1922.）。
mRNA分析
根据不同的应用，可能需要对 IVT 生产的 mRNA 进行额外的精密分析，而不限在本文中提到的检项。这些分析可能包括加帽效率、序列验证、残余溶剂、残余DNA、dsRNA含量和poly(A)尾部长度确认。加帽效率可以通过不同的方式进行检测。然而，最精密的方法是采用质谱法。
与凝胶法相比，测量mRNA长度和质量且有较高灵敏度的替代技术包括毛细管电泳和分析型HPLC。毛细管电泳需要更复杂的仪器，如Bioanalyzer或Fragment Analyzer（Agilent 部件号分别 G2939BA or M5310AA）。RNA样品被注入充满筛分凝胶的熔融石英瓶中，一般是聚合物溶液，如线性聚丙烯酰胺或羟乙基纤维素。沿着毛细管的长度施加电压，RNA通过介质迁移到阳极。聚合物之间的缠结阻碍了RNA的迁移，实现了基于尺寸的分离。当RNA分子到达位于毛细管两端附近的检测器时，凝胶中存在的荧光基团可以被定量检测。结果是荧光信号与时间的关系图，称为电泳图。RNA ladder与样品一起运行，以建立迁移时间和RNA大小之间的关系，使测试样品片段大小能被量化。mRNA的质量可以通过比较全长转录的荧光信号和降解产物或其他污染物的荧光信号来进行量化。
图5 使用NanoDropTM OneC (Thermo Fisher, cat no. ND-ONEC-W)对加帽的mRNA进行紫外-可见测量的例子。
原则上，分析性高效液相色谱法可以通过任何能够按大小分辨mRNA的色谱技术来实现。两种最成熟的技术是IP-RP HPLC和尺寸排除色谱法（SEC）。IP-RP将mRNA样品与疏水树脂结合在一起，包括聚合物，如聚苯乙烯二乙烯基苯，C18或其他硅胶支持物上的疏水层，或两者的组合。流动相含有一种离子配对试剂，通常是烷基胺，如三乙胺或正己胺，它可以促进RNA磷酸酯骨架和疏水固定相之间的互动。梯度的有机溶剂，如乙腈，将按大小顺序洗脱RNA。SEC将RNA样品加载到一个装有惰性多孔珠的柱子上。较小的RNA在柱子的长度上表现出较慢的线性流动，因为它更容易扩散到珠子里。SEC和IP-RP通常采用在260nm的紫外-可见光检测。
结果讨论
RNA的紫外-可见光光度法测量
使用此方案纯化的CleanCap AG mRNA的预期反应产量（IVT的RNA质量）为5mg/ml，吸光度最大值为260nm，A260/A280比例值为2.0-2.2。图5显示了纯化后的典型IVT样品，吸光度峰值在260nm，纯度比为2.15（A260/A280）。如果在260nm处没有观察到吸光度的峰值，说明样品中很少或没有RNA。如果用传统的比色皿测量来代替NanoDrop，最佳的稀释系数将因样品浓度和比色皿的长度而不同。请参考仪器手册以确保在仪器的定量范围内获得准确的读数。如果在比色皿中使用大的稀释系数，RNA浓度可能低于仪器的检测极限。尝试测量更多的样品来验证最初的结果。
如果反应产量确实低于预期，通过凝胶电泳比较IVT原液（protocal 1，步骤12中保留的样品）和纯化的mRNA。这种比较可以用来确定RNA是否在纯化过程中丢失或IVT反应是否不成功。为了装胶，假设IVT原液产量为5mg/ml，并对原液和纯化的样品装入相同的质量。在电泳后的凝胶图像中，条带强度与质量负荷相关。如果在原液样品中观察到一条暗带，而在纯化样品中没有，那么RNA可能在沉淀过程中丢失。如果在粗制的IVT中观察到一条强度较低的带子，那么可能发生了副反应。见上文的问题讨论，以改善IVT反应。
A260/A280比率为1.8或更低，可能表明有残留的DNA或蛋白质。mRNA的纯度可能不足以满足后续的应用。建议再进行一轮纯化或改变原本的纯化方法。
图6 加帽mRNA的1%琼脂糖乙醛凝胶实例。凝胶内容从左到右为RNA marker，DNase后转录样本原液A-E，纯化的转录样本A-E。在1×NorthernMaxTM-Gly缓冲液（Thermo Fisher，AM8678）中电泳前，每孔约2.5μg粗制样品或0.5μg纯化样品用NorthernMaxTM-Gly样品上样染料在50℃处理30分钟。在凝胶的顶部可观察到染色剂。
凝胶图像分析
相对一个适当ladder，在乙二醛凝胶中的核糖核酸将迁移到接近真实尺寸的位置（以核苷酸为单位的长度）。凝胶带的大小出现各种情况，表明可能有各种问题，如污染、临时板酶解不完全或IVT反应不完全。图6显示了一个典型的CleanCap mRNA的凝胶。
一个比预期分子量低的的凝胶带表明RNA样品的降解，而在未纯化的样品中可能有较高分子量条带，因为有残留的盐。当凝胶过载导致条带强度增加时，低分子量条带也会出现。较长的RNA分子通常不太稳定，因为随着RNA长度增加，键的数量增加，磷酸二酯键断裂的概率也会增加，因此低分子量的条带在较长的RNA中更为普遍。在图6第4-6道所示的原液样品中观察到明显的低分子量和高分子量的条带。在样品纯化后，这些条带通常会减少，样品分析显示出一个干净的单带，如图6中的第10道（即纯化的第5道的原液样品）和第11道（即纯化的第6道的原液样品）。
如果缺乏变性，即通过原生凝胶分析RNA，将导致相对较高的流动性，产生低于预期大小的条带或多条条带。
时间方面的考虑
IVT反应、纯化和分析可以在1-2天内完成。IVT反应前准备大约需要1小时，包括试剂解冻时间。IVT的反应操作将需要2-3小时，可选的DNase I处理将需要大约30分钟。氯化锂净化可分2天进行，样品在-20°C下孵育过夜。紫外测量在10分钟或更短的时间内完成，凝胶分析可能在30到90分钟之间，取决于凝胶大小和预制凝胶的选择。
原文来源：Cap 1 Messenger RNA Synthesis with Co-tranional CleanCap® Analog by In Vitro Tranion
