来源：中华肝脏病杂志
作者：张强 刘勤 牛春燕
摘要
目的
研究胰高血糖样肽-1受体激动剂（GLP-1RAs）对游离脂肪酸（FFA）诱导的肝细胞脂肪变性的影响，并探讨细胞自噬在该过程中的作用。
方法
体外人肝细胞培养诱导出非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型，加入浓度梯度的利拉鲁肽（LRG）观察其对细胞存活率和肝细胞脂肪变性的影响；用氯喹抑制细胞自噬，雷帕霉素(RAPA)激活自噬，探究利拉鲁肽改善肝细胞脂肪变性与细胞自噬的关系。实验分组：对照组，DMEM完全培养基培养的细胞中加入一定浓度BSA；FFA模型组，用1 mmol/L的FFA（OA∶PA=2∶1）诱导肝细胞脂肪变性；LRG组，细胞中同时加入FFA（1 mmol/L）和LRG（100 nmol/L）；自噬抑制组，细胞中同时加入FFA（1 mmol/L）、LRG（100 nmol/L）和氯喹（20 μmol/L）；自噬激活组，细胞中同时加入FFA（1 mmol/L）和RAPA（1 μmol/L）。用油红O染色、全自动生化分析仪观察肝细胞内脂质沉积情况，蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白（Beclin1、P62、LC3B）水平，观察细胞自噬水平。多组间均数比较用单因素方差分析。
结果
在一定浓度范围内，随着LRG浓度的增加，肝细胞存活率不断上升，胞内脂质沉积程度不断减轻，LRG浓度达到100 nmol/L时效果最佳，且与FFA组相比差异有统计学意义（P < 0.01）。在肝细胞脂肪变性程度与细胞自噬关系的探究中，LRG组肝细胞内甘油三酯含量显著低于FFA组（P < 0.01），Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平较FFA组升高，P62水平较FFA组下降，细胞自噬增强；自噬抑制组与LRG组相比，胞内甘油三酯含量有所增高（P < 0.01），Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平下降，P62水平增高；自噬激活组中RAPA显著减轻了FFA诱导的肝细胞内甘油三酯沉积，自噬相关蛋白水平变化与LRG作用效果一致。
结论
GLP-1RAs可以改善FFA诱导的脂毒性肝细胞损伤，并通过促进细胞自噬来改善NAFLD中肝细胞脂肪变性。
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病率在全球范围内呈持续上升趋势，已成为世界许多地区慢性肝病的主要病因。然而目前国际、国内NAFLD治疗指南中仍然没有确切的标准化药物治疗方案，更多的是采取控制饮食、加强体育锻炼等生活方式的改变以及减轻肝脏炎症等对症治疗[ 1] ，但难以持久，因此难以获得恒定疗效。胰高血糖素样肽-1受体激动剂（glucagon-like peptide-1 receptor agonists，GLP-1RAs）是通过对降糖类药物胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）中部分氨基酸结构改造而得，被批准用于2型糖尿病（T2DM）的治疗[ 2] ；近来研究发现GLP-1RAs可以改善T2DM合并的NAFLD，但对于单纯NAFLD的治疗研究甚少报道，且其具体的作用机制尚未阐明。
自噬（autophagy）是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径，已有研究表明自噬在调节脂质代谢、胰岛素抵抗和保护肝脏细胞死亡过程中发挥重要作用 [ 3] 。那么GLP-1RAs是否可以通过调节自噬而促进脂质代谢而成为NAFLD的有效治疗药物？为此本研究拟通过体外细胞实验验证GLP-1RAs对于NAFLD的改善作用，探究在此过程中脂质代谢和细胞自噬的变化情况及其相应的作用机制，为将来NAFLD的分子靶向治疗研究提供一定的参考。
材料与方法
1．实验材料：
HepG2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，HL-7702细胞购自武汉巴菲尔生物技术有限公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒、油红O染色液购自北京索莱宝科技有限公司，油酸（oleic acid，OA）、棕榈酸（palmitic acid，PA）购自美国Sigma公司，甘油三酯（TG）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，氯喹（chloroquine，CQ）购自阿拉丁试剂有限公司，雷帕霉素（rapamycin，RAPA）购自美国selleck生物科技有限公司，兔抗Beclin1单克隆抗体、兔抗LC3B多克隆抗体、小鼠抗SQSTM1/P62单克隆抗体均购自英国Abcam公司，利拉鲁肽（liraglutide，LRG）为诺和诺德（中国）制药有限公司生产。
2．细胞培养及处理：
HepG2细胞和HL-7702细胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基悬浮,接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃、5%CO2 饱和湿度条件下培养；待细胞贴壁后，实验组用含1 mmol/L游离脂肪酸（free fatty acids）FFA（OA∶PA = 2∶1）的DMEM完全培养基24 h诱导肝细胞脂肪变性，同时加入不同浓度梯度的利拉鲁肽25、50、100 nmol/L，对照组用含相同浓度牛血清白蛋白的DMEM完全培养基培养24 h。
3．细胞自噬水平检测分组及处理：
取处于对数生长期、生长状态良好的HL-7702和HepG2细胞按上述方法培养，细胞贴壁后，实验组用含1 mmol/L FFA（OA∶PA=2∶1）的DMEM完全培养基24 h诱导肝细胞脂肪变性，其中抑制自噬组加入利拉鲁肽（100 nmol/L）和氯喹（20 μmol/L），诱导自噬组加入雷帕霉素（1 μmol/L），对照组用含相同浓度牛血清白蛋白的DMEM完全培养基培养24 h；检测各组细胞内自噬水平。
4．MTT细胞增殖和细胞毒性检测：
取处于对数生长期、生长状态良好的HL-7702和HepG2细胞，用培养基调整细胞密度到8×104 个/ml，接入96孔板，每孔100 μl细胞悬液，同时设空白孔，37℃培养24 h，在细胞孔周围孔内加入100 μl无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）；待细胞贴壁后，实验组用含1 mmol/L FFA（OA∶PA=2∶1）的DMEM完全培养基诱导肝细胞脂肪变性，同时加入不同浓度梯度的利拉鲁肽25、50、100、200 nmol/L，对照组用含相同浓度牛血清白蛋白的DMEM完全培养基培养；37℃培养24 h后每孔加入10 μl MTT 37℃培养4 h。吸出培养基，加入150 μl二甲基亚砜震荡10 min；酶标仪568 nm测各孔吸光度值。
5．油红O染色观察细胞内脂滴：
取生长状态良好的细胞接种到12孔板中，按上述不同的分组处理24 h后弃培养基，4%多聚甲醛固定10～15 min后PBS洗2～3次，60%异丙醇浸洗15～30 s，油红O染液染色10 min，再用60%异丙醇分化至背景无色，PBS洗3次，苏木精复染1 min，PBS洗3次后中性树脂固定封片；显微镜下观察。
6．全自动生化分析仪检测TG含量：
将细胞接种到12孔板中，按上述不同的分组处理24 h后，收集细胞到1.5 ml EP管中，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀，用PBS清洗1～2次，再次1 000 r/min离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；加入0.2～0.3 ml匀浆介质进行匀浆，水浴条件下超声波破碎（300W，3～5 s，间隔30 s，重复3～5次）；全自动生化分析仪检测。
7．蛋白质印迹法检测细胞自噬相关蛋白的表达：
收集各组细胞，加入适量RIPA裂解液于冰上裂解30 min，在4℃条件下，12 000 r/min离心10 min，取适量上清液用BCA蛋白定量试剂盒测定提取的蛋白浓度；提取的剩余蛋白上清液与5×蛋白上样缓冲液（体积比按照4∶1混合），放入沸水中进行沸水浴10 min，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶泳（SDS-PAGE）分离蛋白，分离后将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h；PVDF膜中加入特定的第一抗体稀释液，4℃过夜；次日，TBST洗膜后，将PVDF膜浸泡于第二抗体孵育液中，37℃摇床孵育1 h，TBST再次洗膜，用ECL Plus超敏发光液和化学发光成像仪（Bio-Rad ChemiDoc Touch）曝光显影。
8．统计学方法：
采用GraphPad Prism 8.0进行数据分析。数据用均数±标准差（±s）表示，多组间的数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
1．利拉鲁肽可以改善FFA导致的细胞脂毒性损伤：
用MTT法进行细胞增殖和细胞毒性检测发现，与BSA对照组相比，FFA干预后HepG2细胞和HL-7702细胞存活率均明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)；FFA中加入不同浓度LRG（25、50、100、200 nmol/L）与细胞共培养后，两株细胞存活率均较FFA组明显上升且存在LRG浓度依赖性，当LRG浓度达到100 nmol/L时，细胞存活率最高，与FFA组相比差异有统计学意义(P < 0.01)（图1）。
2．利拉鲁肽可以改善肝细胞脂肪变性：
油红O染色可将肝细胞中的脂滴染成橘红色，核呈蓝色。如图2所示，HepG2细胞和HL-7702细胞培养皿中加入FFA后，两株细胞胞内均出现明显的橘红色脂滴积聚，即FFA诱导两株细胞出现了脂肪变性；而同时加入FFA和LRG 25、50、100 nmol/L的组中，肝细胞胞内的脂滴积聚程度较FFA组减轻，且随着LRG浓度的增加，脂滴积聚程度减轻得更为明显。肝细胞内TG水平的定量检测可以准确反映细胞内脂质沉积情况，我们用全自动生化分析仪检测了各组细胞中的TG含量。结果如图3所示，在HepG2细胞和HL-7702细胞中，FFA组细胞TG水平与对照组相比明显升高(P < 0.01)；同时加入FFA和不同浓度LRG（25、50、100 nmol/L）的组中，细胞TG水平随着LRG浓度的增加逐渐降低，当LRG浓度为100 nmol/L时TG含量最低，且与FFA组相比存在明显的统计学差异（P < 0.01）。上述结果证实LRG可以改善FFA诱导的肝细胞脂肪变性，且综合MTT结果提示LRG改善FFA诱导的肝细胞脂肪变性具有LRG浓度依赖性。
3．利拉鲁肽通过促进细胞自噬改善肝细胞脂肪变性：
如图4所示，LRG可减少FFA诱导的HepG2细胞和HL-7702细胞内脂滴积聚，同时加入氯喹的组中肝细胞脂滴积聚程度减轻不明显，说明LRG改善肝细胞脂肪变性这一作用被氯喹抑制[4] ；而雷帕霉素与LRG作用一致，可以减少FFA诱导的肝细胞脂滴积聚，从而改善肝细胞脂肪变性[5] 。我们进一步对HepG2细胞和HL-7702细胞中各组胞内的TG含量进行了测定，结果与油红O染色结果吻合，见图5。与BSA对照组相比，FFA组肝细胞出现脂肪变性，TG含量显著增高，差异有统计学意义（P < 0.01）；LRG可显著减轻FFA导致的肝细胞内TG沉积（P < 0.01），而氯喹作为自噬抑制剂，部分抑制了LRG减轻胞内TG沉积这一作用，与FFA+LRG组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）；与氯喹相反，雷帕霉素显著减轻了FFA诱导的肝细胞内TG沉积。根据上述结果我们推断LRG改善肝细胞脂肪变性这一作用与促进细胞自噬有关，因此我们检测了细胞自噬相关蛋白Beclin1(酵母Atg6同源物)、P62、LC3B[ 6,7,8] 的水平以进一步验证这一推断，结果见图6。在HepG2细胞和HL-7702细胞中，与BSA对照组相比，FFA组Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平均降低，P62条带增强，细胞自噬减弱；FFA+LRG组和FFA+RAPA组Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平与FFA组相比明显升高，P62水平下降，细胞自噬增强，说明LRG与RAPA一致，均可促进细胞自噬。以上结果表明LRG可以通过促进细胞自噬改善肝细胞脂肪变性。
讨 论
NAFLD是一种与糖尿病、代谢综合征等密切相关的疾病,可导致严重的肝脏相关并发症和整体死亡率的上升[ 9] 。关于其发病机制，随着大量研究结果不断涌现，被更多研究者所认可的”多重平行打击”学说正在取代经典的”二次打击”学说，这一学说认为遗传多态性和表观遗传学改变、脂毒性、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、内质网应激、线粒体功能受损、肠道菌群等多重因素作为”平行打击”共同促进了NAFLD的发生发展[ 10,11] 。由于NAFLD发病机制的复杂性，迄今仍没有公认的诊疗方案，因此亟需针对其中关键的分子机制进行大量研究,为开发NAFLD靶向治疗药物提供证据。近年研究发现，GLP-1RAs除了降低血糖、治疗肥胖症外，还可减少肝细胞内的脂肪酸合成及TG贮存，减轻肝脏脂肪变及坏死性炎症，并促进肝细胞的生存能力，提示GLP-1RAs直接影响肝细胞内脂质积聚及肝脏炎症而发挥作用。我们选用GLP-1RAs的代表药物LRG作为干预药物来探究其在NAFLD中的作用，实验结果证明LRG可有效改善FFA诱导的肝细胞脂毒性损伤和肝细胞内脂滴积聚，并且这种作用在一定范围内具有LRG浓度依赖性。
自噬作为真核细胞维持稳态、实现自我更新的一种重要的进化保守机制，最基本的功能是降解受损或老化的细胞器，在机体处于应激状态时为细胞提供能量，维持细胞能量稳态 [ 12] 。研究发现自噬可以水解细胞内储存的脂滴，对于维持细胞内脂质的稳态至关重要，这一功能被称之为”脂噬” [ 13] 。越来越多的证据表明细胞自噬功能缺失和NAFLD的发生发展密切相关，Sun等 [ 14] 发现用3-MA（一种自噬启动的抑制剂）抑制自噬后，细胞脂质分解和脂肪酸β氧化水平下降，导致了肝细胞内脂质积聚；Zhang等 [ 15] 通过小鼠体内实验证明，营养缺乏激活自噬后可刺激LC3B-II与脂滴的结合，包含有脂滴的自噬体数量也同步增加。这些结果提示细胞自噬可能介导了肝细胞内脂滴的降解，药理性激活肝脏自噬成为NAFLD治疗的潜在靶点之一。那么GLP-1RAs对于NAFLD的改善与细胞自噬之间有何关系呢？我们发现FFA诱导肝细胞出现脂肪变性时，调控自噬启动的关键蛋白Beclin1和自噬小体形成的标志物LC3B-II水平明显降低，而与自噬活性负相关的特异性自噬底物P62水平明显升高，表明细胞自噬受到抑制；加入LRG后肝细胞Beclin1和LC3B-II水平均明显升高，P62水平下降，表明LRG恢复了NAFLD肝细胞中的受损的自噬功能。此外，有证据表明LRG诱导的自噬激活直接参与了HepG2细胞和Huh7细胞内脂质沉积水平的降低；首先，LRG在恢复细胞自噬水平的同时显著降低了肝细胞中的TG含量；其次，溶酶体功能抑制剂氯喹部分消除了LRG对细胞内TG含量和自噬水平的影响，说明LRG在自噬溶酶体形成之前激活了自噬的其他上游通路；最后，自噬激动剂雷帕霉素和LRG作用效果一致，在激活细胞自噬的同时减轻了肝细胞中的脂质沉积。
综上所述，本研究结果表明：LRG通过上调细胞自噬功能直接促进细胞脂质代谢和脂质清除从而改善NAFLD的脂肪变性。研究结果进一步证实：（1）自噬参与脂质代谢，激活自噬是治疗NAFLD的潜在靶点；（2）GLP-1RAs可通过正向调节自噬显著改善NAFLD，为GLP-1RAs作为潜在靶向药物用于NAFLD的治疗提供了有力证据。关于GLP-1RAs通过哪些信号通路和分子机制介导自噬仍需进一步研究。
参考文献
[1] European Association for the Study of the Liver (EASL); European
Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association
for the Study of Obesity (EASO). EASL-EASD-EASO Clinical
Practice Guidelines for the management of non-alcoholic fatty
liver disease[J]. J Hepatol, 2016, 64(6): 1388-1402. DOI: 10.1016/
j.jhep.2015.11.004.
[2] Jones B, Bloom SR, Buenaventura T, et al. Control of insulin
secretion by GLP-1[J]. Peptides, 2018, 100: 75-84. DOI: 10.1016/
j.peptides.2017.12.013.
[3] Wu WKK, Zhang L, Chan MTV. Autophagy, NAFLD and NAFLD-
Related HCC[J]. Adv Exp Med Biol, 2018, 1061: 127-138. DOI:
10.1007/978-981-10-8684-7_10.
[4] Wang Y, Zhao H, Li X, et al. Tangshen formula alleviates hepatic
steatosis by inducing autophagy through the AMPK/SIRT1
pathway[J]. Front Physiol, 2019, 10: 494. DOI: 10.3389/fphys.2019.
00494.
[5] Zhou W, Ye S. Rapamycin improves insulin resistance and hepatic
steatosis in type 2 diabetes rats through activation of autophagy[J].
Cell Biol Int, 2018, 42(10): 1282-1291. DOI: 10.1002/cbin.11015.
[6] Lin R, Wu D, Wu FJ, et al. Non-alcoholic fatty liver disease induced
by perinatal exposure to bisphenol a is associated with activated
mTOR and TLR4/NF-kB signaling pathways in offspring rats[J].
Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10: 620. DOI: 10.3389/
fendo.2019.00620.
[7] Masuda S, Mizukami S, Eguchi A, et al. Immunohistochemical
expression of autophagosome markers LC3 and p62 in preneoplastic
liver foci in high fat diet-fed rats[J]. J Toxicol Sci, 2019, 44(8): 565-
574. DOI: 10.2131/jts.44.565.
[8] Jiang P, Mizushima N. LC3- and p62-based biochemical methods
for the analysis of autophagy progression in mammalian cells[J].
Methods, 2015, 75: 13-18. DOI: 10.1016/j.ymeth.2014.11.021.
[9] Zheng YY, Wang M, Shu XB, et al. Autophagy activation by Jiang Zhi
Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury[J].
World J Gastroenterol, 2018, 24(9): 992-1003. DOI: 10.3748/wjg.v24.
i9.992.
[10] Tilg H, Moschen AR. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty
liver disease: the multiple parallel hits hypothesis[J]. Hepatology,
2010, 52(5): 1836-1846. DOI: 10.1002/hep.24001.
[11] Suzuki A, Diehl AM. Nonalcoholic steatohepatitis[J]. Annu Rev Med,
[12] Singh R, Cuervo AM. Autophagy in the cellular energetic balance[J].
Cell Metab, 2011, 13(5): 495-504. DOI: 10.1016/j.cmet.2011.04.004.
[13] Singh R, Kaushik S, Wang Y, et al. Autophagy regulates lipid
metabolism[J]. Nature, 2009, 458(7242): 1131-1135. DOI: 10.1038/
nature07976
[14] Sun Y, Xia M, Yan H, et al. Berberine attenuates hepatic steatosis
and enhances energy expenditure in mice by inducing autophagy and
fibroblast growth factor 21[J]. Br J Pharmacol, 2018, 175(2): 374-387.
DOI: 10.1111/bph.14079.
[15] Zhang E, Yin S, Song X, et al. Glycycoumarin inhibits hepatocyte
lipoapoptosis through activation of autophagy and inhibition of ER
stress/GSK-3-mediated mitochondrial pathway[J]. Sci Rep, 2016, 6:
38138. DOI: 10.1038/srep38138.
*文章系本平台转载，若有侵权请联系删除
1、 “肿瘤黑幕”涉事上海医生被暂停执业，相关企业罚没款165万元
2、 悲痛！两位年轻医生猝然离去，博士 海归 SCI 国自然，全成浮云……
3、 急性胰腺炎急诊诊断及治疗专家共识（2021年）
4、 慢性乙型肝炎抗病毒新药的临床研究
5、 为女性患者开这药，9名医师医保资格被暂停！
小伙伴们好，跟大家说句悄悄话。
因为微信更改了推送规则，推文不再按照时间线显示，如果不点 『在看』或者没有 『星标』，可能就看不到我们的推送了！
如果不想错过我们的精彩内容，就赶紧星标⭐我们吧！
好看的人都在戳在看
