在关键发育时期长期暴露于压力之下会增加患精神疾病的风险，且可能产生性别特异性的后果。在此，我们研究了慢性青春期社交隔离压力后小鼠行为变化所涉及的神经回路。压力下的雄性小鼠表现出攻击性增强，而压力下的雌性小鼠则表现出社交退缩。对自由活动动物进行的多通道在体记录表明，压力下的雄性小鼠前额叶皮质（PFC）锥体神经元在攻击期间的放电活动显著减少，而压力下的雌性小鼠在社交性测试期间，其 PFC 锥体神经元的放电率增加幅度减弱。化学遗传学和电生理学证据表明，PFC 功能减退和基底外侧杏仁核（BLA）主神经元过度活跃导致压力下雄性小鼠攻击性增强，而 PFC 功能减退和中脑腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元活性降低导致压力下雌性小鼠社交性减弱。这些结果为理解压力产生性别特异性不同效应的神经回路和生理机制提供了框架。
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一、介绍
应激激素在人的一生中会产生深远且复杂的影响。由于青春期前后激素水平和神经发育的巨大变化，青少年的大脑对压力源特别敏感。在人类中，早期的逆境，如情感忽视、社会排斥和青春期前后的压力，对异常的攻击性和反社会行为以及焦虑和抑郁障碍的形成有显著影响。早期生活压力的动物模型，如反复的母子分离、断奶后的社会隔离以及青春期的不可预测压力，也会表现出许多与人类相似的行为症状。长期的社会隔离会严重扰乱应激激素。
一个重要的但研究不足的问题是早期生活压力的性别差异效应。大多数关于青春期社交隔离压力的动物研究都集中在雄性身上，雄性表现出焦虑加剧、易出现成瘾相关行为以及攻击性增强。对于雌性如何应对隔离压力，人们知之甚少。在人类中，攻击和暴力行为的发生率在男性中显著更高，而抑郁症的发生率在女性中显著更高。近期的研究表明，压力对男性和女性在行为、情绪和转录水平上产生了不同的影响。
人类大脑在结构连接组方面存在性别差异。为了理解应激在两性中产生不同影响的生理基础，确定控制应激不同后果的神经回路至关重要。脑成像显示，具有攻击冲动行为的人在特定区域（如杏仁核和内侧眶额叶皮质）的活动发生了改变，但这些结果大多是相关性的而非确定性的。在此，我们利用活体动物行为中的神经元放电记录以及化学遗传学方法，对涉及攻击行为、社交性和情绪障碍的三个相互关联的关键应激靶区的神经活动进行探究：前额叶皮质（PFC）、基底外侧杏仁核（BLA）和腹侧被盖区（VTA）。前额叶皮质（PFC）作为控制高级「执行」功能的指挥中心。这些功能包括工作记忆、决策、社会认知和情绪控制。我们推测，由于前额叶皮层及其相关神经回路功能失调，导致情绪调节失常，从而引发攻击性或社交退缩行为。本研究获得的结果将有助于理解压力的性别差异效应的生理基础。
二、结果
慢性隔离压力会诱发雄性动物的攻击行为，这与攻击期间前额叶皮质锥体神经元活动减弱有关。
为了探究压力对雌雄两性的影响，我们将3周龄的小鼠暴露于慢性隔离压力（单笼饲养5周）中，并对群养对照组（GH）和社交隔离应激组（SI）的雌雄小鼠进行了比较（图S1A）。我们首先测量了社交隔离对攻击行为的影响，攻击行为是多种压力源诱导的行为变化。在对神经元脉冲活动进行多通道在体记录期间，我们使用了经典的反应性攻击行为检测方法——居民-入侵者（RI）测试（图1A）。行为测试表明，与GH雄性小鼠相比，SI雄性小鼠首次攻击的潜伏期显著缩短，攻击次数增多，攻击持续时间延长（图1B），表明攻击水平升高。然而，在SI雌性小鼠中未发现攻击行为有显著变化（图S1B – S1D）。
图 1.在常驻-入侵者（RI）测试中，处于隔离应激下的雄性小鼠在攻击期间表现出攻击性增强，且前额叶皮质锥体神经元的尖峰活动减弱。（A）在 RI 测试期间对雄性小鼠进行的体内多通道记录（左），来自内侧前额叶皮质（mPFC）记录的三个分离良好的单个单元（黄色、绿色和蓝色簇）（右上），用于体内记录的 16 通道电极（右下），以及显示电极植入 mPFC 的显微照片（白色箭头，右下）。（B）条形图展示了群养（GH；n = 15）和单养社交隔离（SI；n = 11）雄性小鼠在 RI 测试中的攻击行为（攻击潜伏期：p = 0.01，曼 – 惠特尼 [M-W] 检验；攻击次数：p < 0.001，t 检验；攻击时间：p < 0.001，t 检验）。
为了探究导致社交孤立雄性个体攻击性行为的原因，我们通过自由活动动物的单细胞记录来检测前额叶皮质（PFC）神经元的活动，因为PFC在调节由压力引发的过度攻击行为方面发挥着关键作用。我们使用了16通道多电极阵列（4×4）来定位内侧前额叶皮质（mPFC），包括前扣带回（PrL）和下扣带回（IL），并且在实验后通过组织学方法确认了电极的位置（图1A）。我们总共记录了228个分离良好的神经元。
共记录了228个单位（来自7只7周龄雄性GH小鼠的73个单位，来自15只15周龄雄性SI小鼠的155个单位），其中包括164个锥体神经元（PNs，占71.9%）、26个快发放窄峰间期中间神经元（FSINs）和38个非快发放窄峰间期中间神经元（NFSINs）（图1C）。
然后，我们比较了GH和SI雄性小鼠在RI测试期间mPFC神经元（PN）的放电率。在RI测试前3分钟的基线期，记录到的PN单位的平均放电频率在SI小鼠中显著低于GH小鼠（图1D）。在RI测试中，攻击期相对于非攻击期的平均放电率在不同的PN单位中表现出混合变化，有增加、减少和无变化的情况（图1E和1F）。对攻击相关放电率变化指数（CI）的量化表明，SI雄性小鼠的PN单位显著低于GH雄性小鼠（图1G）。如图1H所示，SI雄性小鼠在攻击期间放电率降低的PN单位更多（GH，14.0%；SI，29.8%），而放电率增加的PN单位更少（GH，12.0%；SI，7.0%）。对放电率降低的PN单位的进一步检查显示，SI雄性小鼠中这一细胞群的放电率显著降低（图1I和1J）。来自SI雄性小鼠的这些PN单位在攻击开始（0秒）到攻击后6秒之间的归一化活动（Z分数）曲线下也显示出更大的负面积（图1K和1L）。对GH和SI雄性动物具有代表性的PN单元的记录表明，在GH雄性动物中，短促攻击期间的脉冲率基本未变（图1M），而在SI雄性动物中，脉冲率显著降低与长时间攻击的发起和执行密切相关（图1N）。与SI雄性动物PN单元的变化相反，在所记录的FSIN和NFSIN单元中未观察到显著变化（图S2）。这些数据表明，SI雄性动物攻击性增强的同时，其前额叶皮质中一部分PN的活动减弱。
慢性隔离压力会导致雌性出现社交退缩，这与社交刺激对前额叶皮质锥体神经元激活作用的减弱有关。
接下来，我们测量了慢性隔离应激对社交性的影响，社交性是另一种常与各种应激源相关联的行为变化。社交性采用社交互动（SA）测试（图2A）。与GH雌性小鼠相比，SI雌性小鼠与社交刺激物的互动时间明显缩短（图2B），表明存在社交缺陷。相反，SI雄性小鼠未观察到明显的社交性变化（图S1E – S1G）。
图 2.在社交趋近（SA）测试中，暴露于隔离压力的雌性小鼠表现出社交缺陷，并且其前额叶皮质锥体神经元对社交刺激的激活反应减弱。（A）在 SA 测试期间对雌性小鼠进行的体内多通道记录（左），来自 mPFC 记录的三个分离良好的单个单元（黄色、绿色和蓝色簇）（右上），用于体内记录的 16 通道电极（右下），以及显示电极植入 mPFC 的显微照片（白色箭头，右下）。（B）柱状图展示了生长激素（GH）组（n = 8）和选择性缄默（SI）组（n = 8）雌性小鼠在社交回避（SA）测试中的社交互动行为（互动时间：p < 0.001，t 检验）。插图：SA 测试中一只 GH 雌性小鼠和一只 SI 雌性小鼠的代表性移动轨迹。S，社交刺激。
为了探究社交回避在社交互动减少型雌性小鼠中的驱动因素，我们对自由活动的小鼠进行了前额叶皮质（PFC）神经元活动的单细胞记录，因为PFC是与社交参与高度相关的关键区域。总共记录了276个分离良好的单元（8只正常社交雌性小鼠中有124个，12只社交互动减少型雌性小鼠中有152个），其中包括185个假定的锥体神经元（占67.0%）、40个快发放抑制神经元和51个非快发放抑制神经元（图2C）。
然后，我们比较了GH和SI女性小鼠在社交回避（SA）测试期间mPFC神经元（PN）的尖峰活动。在SA测试前5分钟的基线水平上，记录的PN单位的平均放电频率在GH和SI女性小鼠之间没有差异（图2D）。在SA测试期间，社交互动时期相对于无互动时期的平均放电率表现出混合变化，不同PN单位的放电率有增加、减少和无变化（图2E和2F）。对与互动相关的放电率变化指数（CI）的量化表明，GH女性小鼠的PN单位显著增加，而SI女性小鼠则没有（图2G）。如图2H所示，SI女性小鼠在互动期间放电率增加的PN单位较少（GH为30.8%，SI为16.0%），而放电率降低的PN单位略多（GH为15.4%，SI为18.1%）。对放电率增加的PN单位的进一步检查显示，SI女性小鼠中这一细胞群体的放电率增强程度显著低于GH女性小鼠（图2I和2J）。来自SI女性小鼠的这些PN单位在互动开始（0秒）到互动后6秒之间的标准化Z分数曲线下面积也较小（图2K和2L）。来自GH和SI雌性动物的代表性PN单元的记录表明，在GH雌性动物中，显著的放电率增加与持续社交互动的开始和执行密切相关（图2M），而在SI雌性动物中，短暂互动期间放电率基本未变（图2N）。与PN单元的变化相反，没有显著的在SI雌性小鼠的记录FSIN和NFSIN单位中发现了变化（图S3）。综合来看，这些结果表明，SI雌性小鼠的社会退缩行为与社会刺激对前额叶皮质中一群兴奋性神经元的激活减弱有关。
在处于压力状态的雄性个体中，对前额叶皮质进行化学遗传学刺激可恢复其在入侵者测试期间前额叶皮质锥体神经元的活动，并减轻攻击行为。
鉴于SI男性中攻击性增强与前额叶皮质（PFC）锥体神经元（PNs）活动减弱之间的关联，我们接下来研究了增加PFC神经元活动是否能够减轻攻击行为。我们向其内侧前额叶皮质（mPFC）注射了由CaMKII启动子驱动、带有mCherry标签的腺相关病毒（AAV），该病毒表达hM3D（Gq），以激活PNs。
我们首先在进行回避冲动测试（RI测试）时，评估了腹腔注射生理盐水或氯氮平诺（3毫克/千克）的生长激素（GH）和回避冲动（SI）雄性小鼠（其前额叶皮质中植入了hM3Dq）的体内尖峰活动。在所有记录的前额叶皮质神经元（PN）单元中，氯氮平诺的给药并未显著改变基线放电（图3B）。然而，与生理盐水处理相比，回避冲动雄性小鼠中有一部分PN单元在氯氮平诺给药后表现出显著升高的活动（图3C），这证实了hM3Dq能够激活前额叶皮质的PN单元。在回避冲动测试中，回避冲动雄性小鼠接受氯氮平诺治疗后，攻击期的放电活动相对于非攻击期得到了正常化（图3D – 3H），并且阻止了与攻击相关的放电频率降低（图3F）。此外，氯氮平诺治疗使回避冲动雄性小鼠的放电比例分布趋于平衡，攻击期间放电频率降低的PN单元减少（生理盐水 + 回避冲动，35.4%；氯氮平诺 + 回避冲动，22.5%），而放电频率增加的PN单元增多（生理盐水 + 回避冲动，7.7%；氯氮平诺 + 回避冲动，16.3%）（图3G）。进一步对放电频率降低的PN单元进行检查发现，氯氮平诺治疗减轻了回避冲动雄性小鼠中这一细胞群体的放电频率降低（图3H）。与氯氮平酮（CNO）对体内神经元活动的恢复作用相关，CNO治疗还显著降低了攻击行为，这从RI测试中攻击次数减少和攻击持续时间缩短可以得到证明（图3I）。然而，在没有DREADD的SI雄性对照组中，CNO注射未能降低其升高的攻击行为（图3I）。
图 3.在社交隔离的雄性小鼠中，对前额叶皮质锥体神经元进行化学遗传学刺激可提高其在体放电活动，并在居民 – 入侵者测试中减轻攻击行为。（A）来自雄性小鼠大脑切片的免疫荧光图像，显示在前额叶皮质（mPFC）中表达的 hM3D(Gq)-DREADD（mCherry 标签）。PrL，前扣带；IL，内侧扣带。电极表明了在体（B-G）或离体（J 和 K）时前额叶皮质的记录部位。（B）在生理盐水或 CNO（3 毫克/千克，腹腔注射）注射的先前在 mPFC 中感染 hM3Dq 的 GH 和 SI 雄性小鼠中，记录的 PN 单位在基线（RI 测试前 3 分钟）的平均放电频率分布图（每组 6 – 8 只小鼠，n = 25 – 65 个单位）。（C）由 CNO 激活的来自 SI 雄性小鼠的 PN 单元亚群的平均放电率的柱状图（n = 12 个单元，8 只小鼠；p = 0.002，配对 t 检验）。插图：一个 PN 单元在 CNO 给药前（上）和给药后（下）的代表性散点图和脉冲直方图。（D 和 E）在生理盐水或 CNO 注射的 GH 或 SI 雄性（hM3Dq 在内侧前额叶）的 RI 测试中，攻击期与非攻击期所有 PN 单元放电率的散点图。（F）所有 PN 单元攻击相关放电率变化指数（CI）的散点图（F[1, 159] 处理 = 6.0，p = 0.02，双向方差分析）。
为了探究氯氮平（CNO）对在体神经元放电活动影响的生理基础，我们对来自生理盐水或氯氮平注射的雄性 GH 和 SI 小鼠的前额叶皮质切片进行了体外全细胞记录，以检测突触功能。如图3J所示，与GH对照组相比，SI组雄性小鼠前额叶皮质神经元的自发性兴奋性突触后电流（sEPSC）的幅度显著降低，而频率未受影响，氯氮平处理可恢复其幅度。氯氮平处理的长期效果持续超过4小时（图S7）。由一系列刺激诱发的EPSC的输入输出曲线表明，SI组雄性小鼠前额叶皮质神经元的突触强度显著降低，而氯氮平处理可将其恢复至对照水平（图3K）。综上所述，这些结果表明，对SI雄性小鼠前额叶皮质进行化学遗传激活可增强突触兴奋性，阻止其在RI测试中部分前额叶皮质神经元的活动丧失，从而抑制攻击行为。
在处于压力状态的雌性动物中，对前额叶皮质进行化学遗传学刺激可促进社会刺激对PFC锥体神经元的激活，并减轻其社交退缩行为。
在社交退缩的雌性小鼠（SI雌性）中，我们发现社交刺激对前额叶皮质锥体神经元的激活作用减弱与社交退缩行为之间存在关联。接下来，我们研究了增加PFC神经元的活动是否能够增强社交性。将GH雌性和SI雌性小鼠的前额叶皮质注射hM3Dq（图4A），并评估了在进行社交回避测试时，注射生理盐水或氯氮平-N-氧化物（CNO）的小鼠PFC的在体脉冲活动。当对所有记录的PN单元进行计数时，CNO给药并未显著改变基线放电（图4B），但与生理盐水处理相比，SI雌性小鼠中有一部分PN单元在CNO给药后表现出显著增强的活动（图4C），这证实了hM3Dq能够增加SI雌性小鼠PFC PNs的活动。
图 4.在社交隔离的雌性小鼠中，对前额叶皮质锥体神经元进行化学遗传学刺激可提高其对社交刺激的在体放电激活，并增强其在社交回避测试中的社交性。（A）来自雌性小鼠大脑切片的免疫荧光图像，显示在前额叶皮质（mPFC）中表达的 hM3D(Gq)-DREADD（mCherry 标签）。电极展示了在体内（B-G）或体外（J 和 K）记录前额叶皮质的部位。（B）在生理盐水或 CNO 注射的先前在前额叶皮质（mPFC）感染 hM3Dq 的 GH 或 SI 女性中，基线（SA 测试前 5 分钟）记录的 PN 单位平均放电频率的分布图（每组 6 只小鼠，n = 43 – 56 个单位）。（C）由 CNO 激活的来自 SI 雌性小鼠的 PN 单元亚群的平均放电率柱状图（n = 9 个单元，6 只小鼠；p = 0.002，配对 t 检验）。插图：一只 PN 单元在 CNO 给药前（上）和给药后（下）的代表性散点图和脉冲直方图。（D 和 E）在盐水或 CNO 注射的 GH 或 SI 雌性（mPFC 中的 hM3Dq）的 SA 测试中，社交互动期间与无互动时期所有 PN 单元的放电率散点图。
在社交互动测试中，对社交互动受限（SI）雌性小鼠使用氯氮平（CNO）处理后，其在社交互动时段的放电活动相对于非互动时段恢复正常（图4D-4H）。与社交互动相关的放电率对比指数显示，氯氮平处理的SI雌性小鼠的前额叶皮质神经元放电率显著增加，而生理盐水处理的则无此现象（图4F）。此外，氯氮平处理使SI雌性小鼠的神经元放电率比例分布趋于平衡，放电率在社交互动期间增加的PFC神经元数量增多（生理盐水处理的SI雌性小鼠为15.8%，氯氮平处理的为34.0%），放电率在互动期间降低的神经元数量减少（生理盐水处理的SI雌性小鼠为19.3%，氯氮平处理的为7.6%）（图4G）。进一步对放电率增加的神经元进行分析发现，氯氮平处理的SI雌性小鼠中这一细胞群的放电率增强程度显著高于生理盐水处理的SI雌性小鼠（图4H）。这与PFC神经元活动的增加相关联。在SI+CNO组中，社会刺激可改善社交性，CNO给药也提高了这些小鼠的社交性，这从SA测试中更长的社交互动时间可以得到证明（图4I）。然而，在没有DREADD的SI雌性对照组中，CNO注射未能改善其社交性降低的情况（图4I）。
对来自生理盐水或氯氮平诺沙芬（CNO）注射的GH和SI雌性（其前额叶皮质中带有hM3Dq）的PFC切片进行的全细胞记录（图4J和4K）显示，SI雌性的前额叶皮质神经元自发性和诱发性兴奋性突触后电流（EPSC）的幅度显著降低，而CNO治疗（SI+CNO）则可恢复这一情况。这些结果表明，对SI雌性前额叶皮质进行化学遗传激活可增强突触兴奋性，从而促进其在社交回避测试中对社交刺激的反应，进而减轻社交回避行为。
在处于压力状态的雄性个体中，由于前额叶皮质功能减退而导致的杏仁核基底外侧核（BLA）主要神经元的过度活跃，会促使攻击性增强。
接下来，我们探究了介导SI雄性个体攻击行为的神经回路。青春期前后压力诱导的攻击行为与杏仁核过度激活有关。前额叶皮层通过自上而下控制基底外侧杏仁核（BLA）来调节情绪行为（图5A），其方式是通过与BLA主要神经元形成直接兴奋性突触和前馈抑制性回路，因此我们研究了PFC到BLA通路在SI诱导的雄性攻击行为中的作用。
图 5.在社交隔离的雄性小鼠中，杏仁核基底外侧区（BLA）的主要神经元过度活跃，而通过化学遗传学刺激前额叶皮质（PFC）锥体神经元可逆转这一现象，并且化学遗传学抑制 BLA 可减轻在复归隔离测试中的攻击行为。（A）示意图显示病毒被注射入内侧前额叶皮质（mPFC）并在基底外侧杏仁核（BLA）进行记录（左），以及感染病毒的 mPFC 锥体神经元向 BLA 中的主神经元和 GABA 能中间神经元投射（右）。（B）图示为在先前于前额叶皮质（mPFC）感染了 hM3Dq 的 SI 雄性小鼠的基底外侧杏仁核（BLA）主要神经元中，在浴液中应用氯氮平-N-氧化物（CNO，5 毫摩尔）之前（基线）、期间（CNO）和之后（洗脱）的归一化自发动作电位（sAP）、自发抑制性突触后电流（sIPSC）和自发兴奋性突触后电流（sEPSC）频率的曲线（n = 5 – 6 个细胞，每组三只小鼠；sAP：F = 11.1，p = 0.0001；sIPSC：F = 3.6，p = 0.04；单向重复测量方差分析）。（C）柱状图显示了来自生理盐水或氯氮平诺特（CNO）注射的 GH 和 SI 雄性小鼠（mPFC 中的 hM3Dq）的 BLA 主神经元中的 sIPSC（n = 11 – 16 个细胞，每组四只小鼠；sIPSC 频率：F[1, 51] 交互作用 = 15.3，p < 0.001，双向方差分析）。（D）柱状图显示了来自生理盐水或 CNO 注射的 GH 或 SI 雄性小鼠（mPFC 中的 hM3Dq）的 BLA 主神经元中由突触驱动的 sAP 的频率（每组 n = 9 – 20 个细胞，每组四到五只小鼠；F[1, 51] 组 = 11.9，p = 0.001，双向方差分析）。（E）来自雄性小鼠大脑切片的免疫荧光图像，显示 BLA 中（Gi）-DREADD（mCherry 标签）的表达。（F）柱状图展示了在注射氯化钠（生理盐水）前和注射氯硝西泮（CNO）后，下丘脑生长激素（GH）和促性腺激素释放激素（SI）雄性小鼠（BLA 区域植入 hM4Di）在攻击性反应（RI）测试中的攻击行为（每组 n = 4 – 7 只小鼠；攻击次数：F[1， 9] 组别 = 4.3，p = 0.07；攻击时间：F[1， 9] 处理 = 15.2，p = 0.004；双向重复测量方差分析）。（G 和 H）图示为从注射生理盐水或氯氮平诺沙芬（CNO）的 GH 和 SI 雄性小鼠（BLA 中的 hM4Di）的 BLA 主神经元中记录到的 sAP（G）和 eAP（H）的频率（sAP：n = 11 – 21 个细胞，每组四到五只小鼠，F[1， 55] 交互作用 = 5.8，p = 0.02，双因素方差分析；eAP：n = 8 – 14 个细胞，每组四只小鼠，F[3， 36] 组 = 3.5，p = 0.02，双因素重复测量方差分析）。
我们首先测量了前额叶皮质（PFC）激活对基底外侧杏仁核（BLA）主要神经元的影响。将hM3D（Gq）双侧注射到对照组小鼠的内侧前额叶皮质（mPFC）中，并在BLA切片上施加氯氮平（5毫摩尔）以刺激PFC到BLA的突触末梢，同时对BLA主要神经元进行膜片钳记录。如图5B所示，氯氮平的浴液应用显著抑制了社交隔离雄性小鼠BLA主要神经元的突触驱动自发动作电位（sAP）频率。此外，氯氮平显著增加了自发抑制性突触后电流（sIPSC）的频率（图5B），但不影响自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的频率（图5B）。这表明PFC输入通过占主导地位的前馈抑制性回路对BLA主要神经元的活动产生净抑制作用。
接下来，我们研究了雄性动物中由应激引发的前额叶皮质（PFC）至基底外侧杏仁核（BLA）通路的变化。与生长激素（GH）雄性相比，应激诱导（SI）雄性基底外侧杏仁核（BLA）主要神经元的突触后抑制性突触后电流（sIPSC）频率显著降低，而激活前额叶皮质（感染了hM3Dq）并用氯氮平（CNO）处理后，这一变化在很大程度上得到了逆转（图5C）。
同时，慢性隔离应激使雄性小鼠基底外侧杏仁核（BLA）主要神经元的自发性动作电位（sAP）频率升高，而前额叶皮质（PFC）的化学遗传激活可部分缓解这一现象（图5D）。这些数据表明，雄性小鼠的慢性隔离应激会导致BLA神经元的抑制作用减弱和过度活跃，这是由PFC功能减退所引起的。相反，慢性隔离应激并未改变雌性小鼠BLA主要神经元的神经元活动和突触功能（图S4）。
鉴于SI雄性小鼠的杏仁核基底外侧区（BLA）主要神经元表现出过度活跃，我们接下来研究了直接抑制BLA主要神经元的影响。我们向BLA注射了由CaMKII启动子驱动、带有mCherry标签的hM4D（Gi）（图5E），并对注射生理盐水或氯氮平-N-氧化物（CNO）的GH和SI雄性小鼠进行了行为和电生理实验。在RI测试中，CNO处理降低了攻击行为，表现为攻击次数减少和攻击持续时间缩短（图5F）。如图5G和5H所示，SI雄性小鼠（SI + 生理盐水）BLA主要神经元显著增加的自发动作电位（sAP）和诱发动作电位（eAP）频率在化学遗传抑制BLA后（SI + CNO）恢复至对照水平，这与攻击行为的正常化相关。这些神经元的静息膜电位（图S6A）、产生sAP所需的注入电流（图S6B）或输入电阻（图S6C）均未发现显著差异。
在处于压力状态的雌性个体中，由于前额叶皮质输入减少，中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元活性降低，从而导致社交退缩。
接下来，我们探究了介导社交退缩行为的社交隔离雌性小鼠的神经回路。腹侧被盖区（VTA）受前额叶皮质（PFC）投射的调节，在动机和社交行为以及应激反应中发挥着核心作用，因此我们研究了PFC到VTA通路在社交隔离诱导的雌性社交退缩中的作用。
我们首先通过注射hM3D（Gq）来操控前额叶皮质（PFC）的活动，并检测了社交隔离（SI）雌性小鼠中PFC至腹侧被盖区（VTA）通路的变化（图6A）。我们重点关注腹侧被盖区的多巴胺能（DA）神经元，这些神经元通过其显著的超极化激活电流（Ih）和起搏器样放电得以识别。如图6B所示，与生长激素（GH）对照组（GH + 生理盐水）相比，社交隔离雌性小鼠（SI + 生理盐水）的腹侧被盖区DA神经元的突触后兴奋性电流（sEPSC）幅度和频率显著降低，而通过化学遗传学激活社交隔离雌性小鼠（SI + CNO）的前额叶皮质后，这种变化得以恢复。在社交隔离雌性小鼠的腹侧被盖区DA神经元中，突触后抑制性电流（sIPSC）的幅度和频率未发现显著变化（图6C）。此外，社交隔离雌性小鼠腹侧被盖区DA神经元的兴奋性降低在很大程度上得以恢复。通过用氯氮平（CNO）激活前额叶皮质（感染了hM3Dq）（图6D）。在SI雄性小鼠的腹侧被盖区多巴胺能神经元中，未发现突触功能、神经元兴奋性和Ih有显著变化（图S5）。
图 6.在社交隔离的雌性小鼠中，腹侧被盖区（VTA）多巴胺能（DA）神经元活性降低，而通过化学遗传学刺激前额叶皮质（PFC）锥体神经元可逆转这一现象，并且化学遗传学激活 VTA 可增强社交回避测试中的社交性。（A）示意图展示了向内侧前额叶皮质（mPFC）注射病毒，并在腹侧被盖区（VTA）进行记录的过程，用于（B）-（F）部分。（B）柱状图显示了先前在前额叶皮质（mPFC）感染了 hM3Dq 的盐水或 CNO 注射的 GH 或 SI 女性 VTA 中拟多巴胺神经元的自发性兴奋性突触后电流（sEPSC）（n = 13 – 16 个细胞，每组四只小鼠；sEPSC 幅度：F[1, 56] 交互作用 = 3.5，p = 0.07；sEPSC 频率：F[1， 56] 交互作用 = 3.4，p = 0.07；双向方差分析）。（C）GH 组和 SI 组雌性小鼠中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的 sIPSC 条形图（每组 n = 15 或 16 个细胞，每组 3 只小鼠）。（D）来自生理盐水或 CNO 注射的 GH 或 SI 女性（mPFC 中的 hM3Dq）的 VTA DA 神经元的 sAP 图（每组五或六只小鼠，n = 16 – 18 个细胞；F[1， 63] 处理 = 9.0，p = 0.004）。（E）雌性小鼠脑切片的免疫荧光图像，显示了 hM3D(Gq)-DREADD（mCherry 标签）的表达情况，以及在腹侧被盖区（VTA）的记录情况（见 H – L）。（F-I）在先前于腹侧被盖区（VTA）感染了 hM3Dq 的生理盐水或 CNO 注射的 GH 或 SI 女性小鼠的 VTA DA 神经元中，sEPSC（F）、sAP（G）、eAP（H）和 Ih（I）的图谱（n = 14 – 23 个细胞，每组四到六只小鼠；sEPSC 幅度：F[1， 60] 交互作用 = 3.7，p = 0.06；sEPSC 频率：F[1， 60] 交互作用 = 7.1，p = 0.01；sAP 频率：F[1， 66] 处理 = 21.1，p < 0.0001，双向方差分析；eAP 数量：F[3， 66] 组 = 12.4，p < 0.0001；Ih：F[3， 77] 组 = 8.7，p < 0.0001，双向重复测量方差分析）。
鉴于SI雌性小鼠中VTA多巴胺神经元的低活性，我们接下来研究了直接刺激VTA的影响。我们向VTA注射了由CaMKII启动子驱动、带有mCherry标签的hM3Dq（Gq）（图6E），并对注射生理盐水或CNO的GH和SI雌性小鼠进行了电生理和行为实验。如图6F-6H所示，SI雌性小鼠VTA多巴胺神经元中显著降低的sEPSC幅度和频率以及sAP和eAP频率通过化学遗传学刺激VTA（SI + CNO）得以恢复。这些神经元的静息膜电位（图S6C）或输入电阻（图S6D）未发现显著差异。此外，CNO还逆转了SI雌性小鼠VTA多巴胺神经元中显著增加的Ih幅度（图6I）。与神经元活动的正常化相关，CNO治疗显著增强了社交性，这从SA测试中更长的社交互动时间得到了证明（图6J）。
三、讨论
长期处于压力之下会使人更容易患上焦虑症、抑郁症和其他精神疾病。在此，我们发现青春期长期的隔离压力会导致性别特异性的行为和生理变化。受压的雄性表现出攻击性增强，这与它们在攻击入侵者时前额叶皮质（PFC）锥体神经元（PNs）活动减弱有关；受压的雌性则表现出社交退缩，这与社交刺激引起的PFC PNs活动减弱有关。化学遗传学刺激PFC PNs可逆转PFC功能障碍，并改善受压雄性和雌性的行为缺陷。压力的性别差异效应取决于PFC的两个不同靶区。基底外侧杏仁核（BLA）主神经元的过度活跃与压力诱导的雄性攻击行为特异性相关，而腹侧被盖区（VTA）多巴胺（DA）神经元的活动减弱则与压力诱导的雌性社交退缩特异性相关。
在我们的应激模型中，隔离的时间段与玩耍行为的开始和增强相吻合，玩耍行为是一种仅见于幼年/青少年时期的非正式争斗形式，对成年生活的准备至关重要。行为学结果表明，长期的社会隔离会导致不恰当的反应。处于应激状态的雄性动物容易将其领地内的正常社交互动转变为攻击行为（RI测试）。处于应激状态的雌性动物社交动机受损，表现为参与社交活动的意愿降低。这些行为结果与先前关于各种应激源性别特异性效应的报告基本一致。RI测试是检测雄性攻击行为的常用方法，因为雄性通常比雌性表现出更多的领地和社交支配行为。尽管使用RI测试也能观察到雌性的攻击行为，但这种情况主要出现在有雄性入侵者的哺乳期雌性中。在本研究中，我们未在经历社交隔离的雌性中发现攻击行为，这可能是由于RI测试对雌性攻击行为的敏感性较低。尽管有报告称社交隔离2周后雄性的社交偏好会降低，但在本研究中，经历5周青春期隔离应激的雄性在SA测试中表现出正常的社交互动。不同的隔离程序和行为测试可能会导致不同的结果。
是什么导致了应激动物的行为异常？我们首先关注前额叶皮层（PFC），这是与抑制情绪爆发（包括攻击和暴力）有关的关键区域。在人类中，PFC损伤会导致冲动行为的出现，而暴力患者则表现出PFC活动降低。在动物中，光遗传学抑制mPFC神经元会导致攻击行为加剧，而光遗传学激活mPFC兴奋性神经元则会抑制攻击行为。PFC还与社交性高度相关，因为在社交互动期间其活动会增强。在隔离应激动物中，PFC神经元对社交互动的c-Fos诱导作用减弱。我们对处于应激状态下的动物进行的体内记录以及化学遗传学研究结果表明，应激状态下雄性动物攻击行为的增强是由前额叶皮质锥体神经元活动的减弱所驱动的，而应激状态下雌性动物的社会退缩行为则是由社会刺激无法增强前额叶皮质锥体神经元活动所导致的。
前额叶皮层通过控制不同的皮层下区域来发挥其多效性作用。前额叶皮层相互作用的区域之一是杏仁核，它在威胁检测和恐惧反应中起着决定性作用。解剖学研究发现，大鼠前额叶皮质的每个亚区对杏仁核的投射都具有独特性，其中内侧前额叶皮质主要投射至杏仁核的基底外侧核。基底外侧核投射至杏仁核的中央核，后者是杏仁核复合体的主要输出核团，负责控制恐惧和情绪反应。杏仁核的激活会促进攻击行为，这是一种对感知到的社会威胁的不适当情绪反应以及冲动控制能力差的表现。我们的电生理学数据表明，处于应激状态的雄性大鼠在冲动攻击时，边缘系统的脑功能出现异常：杏仁核等情绪回路的反应过度，而前额叶皮质等情绪调节回路的反应不足，这与对人类受试者的功能性磁共振成像研究结果一致。通过使用DREADD技术激活基底外侧核中内侧前额叶皮质的轴突末梢，我们观察到基底外侧核主要神经元的兴奋性降低以及抑制性突触电流增加，这表明前额叶皮质的输入通过前馈抑制作用抑制了基底外侧核主要神经元的活动。一直以来，体内细胞内记录表明，前额叶皮质（PFC）的刺激会抑制杏仁核基底外侧核（BLA）的投射神经元，这归因于抑制性中间神经元的募集。通过化学遗传学激活PFC或抑制BLA来减轻攻击行为，表明PFC到BLA的通路在雄性应激反应中起着重要作用。然而，只有在行为动物中进行通路特异性的化学/光遗传学研究，才能最终确定PFC到BLA或PFC到腹侧被盖区（VTA）的通路是观察到的行为缺陷的因果关系。我们也不排除其他与PFC相连的通路在攻击行为中的潜在作用，例如下丘脑区域，这些区域在攻击行为的控制中具有重要作用。
为了找出与前额叶皮质（PFC）相互作用且参与应激雌性动物社交退缩行为的皮质下区域，我们重点关注了腹侧被盖区（VTA），因为已有研究发现VTA的活动动态能够编码并预测社交互动的关键特征。VTA多巴胺神经元上兴奋性传递的产后发育缺陷会导致社交能力缺陷。
慢性轻度应激会导致腹侧被盖区多巴胺神经元动作电位发放减少，而社会挫败应激则会使易感小鼠腹侧被盖区多巴胺神经元过度活跃。在经历隔离应激的雌性小鼠中，我们检测到腹侧被盖区多巴胺神经元活性降低，这可能是由于来自前额叶皮质的兴奋性输入减少所致。通过化学遗传学激活前额叶皮质或激活腹侧被盖区可改善社交退缩，这表明前额叶皮质到腹侧被盖区通路在雌性应激反应中起着重要作用。与社会挫败应激后易感雄性小鼠腹侧被盖区多巴胺神经元过度活跃的报道相反，我们未发现社交隔离雄性小鼠腹侧被盖区多巴胺神经元的活动变化。不同的应激源可能会诱导不同的分子和生理适应机制。
在本研究中，我们使用 Gq 和 Gi DREADDs 作为工具来操控特定区域的神经元活动，这与它们在其他研究中的普遍用途一致。Gq DREADD 的激活（注射到 SI 动物的前额叶皮质中）会触发 PLC/Ca2+-mediated 突触前递质释放增加，导致 SI 雄性动物的杏仁核基底外侧区（BLA）中间神经元激活增强以及对 BLA 主神经元的前馈抑制增强（图7A），同时也会使 SI 雌性动物的腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元激活增强（图7B）。Gi DREADD 的激活（注射到 SI 雄性的 BLA 中）则会减弱 BLA 主神经元的活动，可能是通过 G 蛋白偶联的内向整流钾通道（GIRK）经由 Gβγ 介导的开放以及对蛋白激酶 A（PKA）通路的抑制（图7C）。激活Gq DREADD（注射到 SI 雌性 VTA 中）提高了 VTA 多巴胺神经元的活动，这可能是通过增加细胞内 Ca2+ 并通过水解 PIP2 阻断 K+ 通过 KCNQ 通道的外流来实现的（图7D）。此外，DREADD 对超极化激活的环核苷酸门控通道（HCN）的调节作用可能有助于 Gq DREADD 对 VTA 多巴胺神经元 Ih 的影响。
图 7.示意图展示了在社交隔离（SI）应激雄性和雌性中神经元回路的化学遗传学调节机制（A 和 B）。在社交隔离雄性中，前额叶皮质（PFC）锥体神经元（PNs）突触前末梢的 Gq DREADD 激活会增加 Ca2+ 浓度并促进谷氨酸（Glu）释放，从而激活突触后 AMPARs 和 NMDARs，导致基底外侧杏仁核（BLA）中间神经元（INs）受到更强的刺激，并对 BLA 主神经元（PNs）产生前馈抑制（A）；在社交隔离雌性中，该激活会增强腹侧被盖区多巴胺神经元（DANs）的刺激（B）。（D）在社交隔离雌性小鼠的腹侧被盖区多巴胺神经元（DANs）中激活 Gq DREADD 可提高细胞内钙离子水平，并通过水解磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP2）阻止钾离子通过 KCNQ 通道外流，从而提高腹侧被盖区多巴胺神经元的活性。
本研究中的大多数实验均采用腹腔注射 3 毫克/千克的氯氮平（CNO），这一剂量在小鼠体内能有效激活 DREADD，且不会产生非特异性行为影响。我们发现，CNO 注射对生长激素（GH）对照组动物的影响极小，这与先前关于行为的报告一致以及电生理学。系统性应用氯氮平诺（3 毫克/千克，腹腔注射）在脑内达到的浓度为 25 纳摩尔，这远低于体外实验中通常使用的剂量（例如 5 毫摩尔）。我们推测，在 GPCR 信号传导和神经元活动受损的异常情况下，这种低剂量的氯氮平诺更易发挥作用。一旦剂量足够高，氯氮平诺注射也会调节正常动物的神经元活动，甚至诱发癫痫发作。一个重要的问题是 DREADD 如何使社交隔离小鼠受损的 GPCR 信号传导恢复正常。已知诸如多巴胺和去甲肾上腺素之类的儿茶酚胺对前额叶皮质的生理和功能具有“倒 U 型”影响，而压力会扰乱这些物质。先前的研究表明，压力导致这些受体的异常变化会改变钙 – cAMP 信号传导，从而导致离子通道的异常门控、前额叶皮质神经元放电减少以及对情绪过程的自上而下控制受损。未来的研究将探讨在长期社交隔离压力下，雄性和雌性小鼠前额叶皮质、基底外侧杏仁核和腹侧被盖区回路中 Gq 和 Gi DREADD 的详细机制。
我们共同研究了青春期隔离压力所导致的性别特异性效应所涉及的大脑区域和细胞类型：雄性表现出攻击性增强，雌性则出现社交退缩。我们证明，这些复杂的行为变化很可能是由于前额叶皮层（PFC）活动异常以及对包括杏仁核（BLA）和腹侧被盖区（VTA）在内的不同神经系统的自上而下控制发生改变所致。了解这些神经回路的功能连接和行为作用，将有助于开发针对压力相关疾病的有效治疗方法。
四、方法细节
01.社交隔离应激
所有实验均在纽约州立大学布法罗分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行。C57BL/6J 小鼠在动物设施中饲养，环境条件受控（22°C，12 小时光照/黑暗周期），可自由获取食物。雄性和雌性小鼠在断奶后（出生后第 21 天）随机分配到单笼饲养（SI）或群笼饲养（GH）组，持续 5 周。感官线索不受限制，这意味着它们可以看到、听到和闻到群体中的其他动物，并经历正常的饲养程序。实验由不知情的实验人员进行（事先不知道分组和处理情况）。
02.行为测试
所有行为实验期间灯光均调至昏暗。使用 ANY-maze 5.1 进行行为记录和数据分析。
03.居民-入侵者（RI）测试
采用改良方案。简而言之，将小鼠单独饲养 24 小时，然后将其置于家笼中与一只入侵者（同性别的稍小（5%-15% 体重较轻）的陌生对照小鼠）接触 10 分钟。对驻留小鼠针对入侵者的攻击行为，包括侧向威胁、直立姿势、抱颈攻击、按压和追逐进行评分，以衡量攻击水平。在 RI 测试中，非攻击性社交行为，包括社交探索、肛门生殖器嗅探和社交梳理，与无互动一起计为“无攻击”。
04.社交接近（SA）测试
测试动物在一个装置（长：57 厘米，宽：43 厘米，高：43 厘米）中适应 5 分钟，该装置内有一个空胶囊。然后将社交刺激（一只陌生的年龄和性别匹配的对照小鼠）置于胶囊内（一个倒置的铅笔杯，直径：10.2 厘米，高：10.5 厘米）。将测试动物放回装置中探索 10 分钟。社交互动被定义为对社交刺激的主动寻找和嗅探。交互时间通过 ANY-maze 软件进行测量，该软件计算测试动物在胶囊附近停留的时间（动物头部到杯沿的距离：≤ 3.5 厘米）。与社交刺激互动的时间以及接近并参与社交互动的次数也被测量。
05.病毒载体和注射
腺相关病毒 AAV8-CaMKIIα-hM3D（Gq）-mCherry（4.1×10¹² vp/ml）和 AAV8-CaMKIIα-hM4D（Gi）-mCherry 获得。病毒（1 μl）向目标脑区的立体定向注射按照先前的描述进行。简而言之，小鼠被麻醉并放置在立体定向仪上。使用注射器（针头规格 31）以 0.1 μl/min 的速度进行注射，注射完成后针头在原位停留 5 分钟。病毒通过以下坐标双侧递送至目标区域：从眉间点（bregma）测量，前额叶皮质（mPFC）：+1.98 毫米（前后向，AP），± 0.25 毫米（左右向，ML），−2.2 毫米（上下向，DV）；杏仁核基底外侧核（BLA）：−1.46 毫米 AP；± 2.8 毫米 ML，−4.9 毫米 DV；中脑腹侧被盖区（VTA）：−3.64 毫米 AP；± 0.5 毫米 ML，−4.2 毫米 DV。手术后 2 至 3 周，动物用于测试。使用水溶性氯氮平（#6329），将其溶解于生理盐水中制成储备液（1 毫克/毫升），并用生理盐水进一步稀释以用于体内或体外应用。动物接受氯氮平（3 毫克/千克，腹腔注射）或生理盐水对照处理，采用平衡给药顺序。
06.体内记录
电极阵列的外科植入、体内电生理数据采集和分析与先前描述的类似。
0601.电极阵列的外科植入
小鼠用氯胺酮（100 毫克/千克）/赛拉嗪（10 毫克/千克，腹腔注射）麻醉。在进行开颅手术（1×2 毫米的矩形切口）后，移除硬脑膜。将定制的 16 通道微电极阵列插入到前额叶皮质（mPFC）。该阵列呈 4×4 排列：直径 33 微米的镍铬合金线，外覆芳烃绝缘层，电极间距 0.25 毫米，阻抗小于 1 兆欧，使用镀金。电极插入目标脑区后，用三个微型颅骨螺钉和牙科水泥固定在颅骨上。然后将小鼠置于加热灯下使其苏醒。
0602.行为小鼠的电生理记录
术后 3 至 5 天恢复后，小鼠需适应 2 至 3 天与头部电极相连的头架（RHD2132 16 通道放大器/加速度计板，部件号 C3335，Intan）和电缆（RHD2000 6 英尺超薄 SPI 电缆，部件号 C3216，Intan）。为确保动物能自由活动，电缆由氦气球悬吊。在整个行为测试期间，多通道电信号以 30 千赫兹的频率进行数字化，并使用 Intan 512 通道记录控制器（部件号 C3004，Intan）进行记录。动物行为通过安装在装置上方（100 厘米）的数码相机进行监测，并使用 ANY-maze 进行记录。
07.尖峰分选
尖峰通过 250 – 7500 赫兹的带通滤波器进行分离。所记录的信号是由微电极附近的多个神经元产生的整合信号，而非单个神经元。因此，使用离线分选器进行尖峰分选，以对不同神经元的放电进行分类，并进行分析。信号噪声比低（< 3.0）或基线放电率极低（< 0.5 赫兹）的单元被丢弃。
08.定量分析和统计分析
使用软件对数据进行统计分析。所有数据均以平均值 ± 标准误表示。两组实验采用 t 检验（单尾或双尾，独立样本或配对样本），除非数据未通过夏皮罗-威尔克正态性检验，此时采用曼-惠特尼 U 检验或柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验。多于两组的实验采用单因素方差分析、双因素方差分析或双因素重复测量方差分析（rmANOVA），随后进行多重比较的事后检验。比例饼图采用卡方检验。详细统计结果见表 S1。星号的使用表示统计学显著性（# p < 0.1，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。
09.电流钳制记录自发动作电位和诱发动作电位
为记录自发动作电位（sAP）和诱发动作电位（eAP），将切片浸泡于改良的人工脑脊液（mM：130 NaCl、26 NaHCO₃、1 CaCl₂、0.5 MgCl₂、3.5 KCl、10 葡萄糖、1.25 NaH₂PO₄）中，以略微提高基础神经元活动。采用全细胞电流钳制，内部溶液含（mM：20 KCl、100 K-葡萄糖酸盐、10 HEPES、4 ATP、0.5 GTP 和 10 磷酸肌酸）。在 BLA 记录 sAP 时，施加一个小的去极化电流（< 100 pA），以将峰电位间膜电位调整至 -60 mV 至 -55 mV 之间。在 VTA DA 神经元记录 sAP 时，不施加电流注入。对于诱发动作电位，将膜电位调整至 -70 mV，同时注入去极化电流阶跃（-30 pA 至 300 pA）。全细胞记录数据使用 Clampfit 10.0.7 和 Mini Analysis 6.0.3 进行分析。
10.成像
为验证电极位置，每个通道施加 12 μA 直流电 30 秒。麻醉动物经心内灌注 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水（PBS）后，再灌注 4% 多聚甲醛（PFA，溶于 0.1 M PBS）。取出大脑，用 4% 多聚甲醛后固定 2 天，然后在 30% 蔗糖中过夜，再沿冠状面切成 100 μm 厚的切片。使用荧光显微镜获取图像。
11.定量分析和统计分析
使用软件对数据进行统计分析。所有数据均以平均值 ± 标准误表示。两组实验采用 t 检验（单尾或双尾，独立样本或配对样本），除非数据未通过夏皮罗-威尔克正态性检验，此时采用曼-惠特尼 U 检验或柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验。多于两组的实验采用单因素方差分析、双因素方差分析或双因素重复测量方差分析（rmANOVA），随后进行多重比较的事后检验。比例饼图采用卡方检验。详细统计结果见表 S1。星号的使用表示统计学显著性（# p < 0.1，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）
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