大脑区域内及区域间的动态相互作用是行为和认知功能的基础。为了理解这些过程的基础，必须在精确操控这些回路输入的同时，同步记录行为动物大脑内分布式局部回路的活动。尽管最近的技术进步已经实现了这种大规模记录的能力，但与之配套的高时空分辨率大规模调制技术的发展却滞后了。本文介绍了一种新型神经探针，它能够在高时空分辨率下大规模地同时实现电监测和光遗传学操控深层神经元回路。“HectoSTAR”微发光二极管（μLED）光电电极在其四个30微米厚的硅微针杆的表面上整体集成了256个记录电极和128个刺激μLED，覆盖了位于大脑深处（最深达6毫米）的1.3毫米×0.9毫米横截面积的大体积区域。本文展示了该设备在行为小鼠中用于剖析皮层层和海马区之间远距离网络相互作用的能力。HectoSTAR微发光二极管光电电极的记录和刺激功能将为在行为动物中基于细胞和回路的大脑功能研究开辟新的可能性。
一、简介
对行为和认知功能的神经基础的理解始于观察不同脑区神经元集群之间如何进行沟通。通过在体外制备中记录和操控神经活动，特别是在观察亚阈值细胞内活动（如突触后膜电位）的基础上，对神经元微回路的详细突触组织方面取得了重要进展。然而，为了理解神经元活动如何产生复杂的脑功能，有必要以高时空分辨率监测和控制行为动物中神经元的活动。最近的技术发展提供了在大脑区域间进行单细胞分辨率的大规模体内记录的新方法，这些方法既可以通过电生理途径，也可以通过成像途径实现。这些发展使我们对行为神经机制的理解取得了重要进展，从以单个脑区为中心的视角转变为动态相互作用的分布式回路视角。然而，要更深入地理解特定的神经模式或单个神经元的活动如何产生行为和认知功能，还需要具备精确扰动特定神经元子集活动的能力。一种强大的扰动方法是光遗传学，而光电极的发展为更精确地探究神经回路功能铺平了道路。
在行为动物中将电生理记录与光遗传学操控相结合的一个共同挑战是，以高空间分辨率向深部脑结构传递光，理想情况下是向单个细胞传递光。光传递的两种知名方法是：在电极阵列上集成光导结构和光学辅助的多光子刺激。虽然这两种方法各自具有独特的优势，但它们都不适合需要大规模、高分辨率探测深部神经结构的应用。这些方法既不能提供足够高分辨率的刺激（光导方法），也不能将光传递到深部脑区（多光子方法）。一种有前景但具有挑战性的光传递方法是使用微型光源，如微发光二极管（μLEDs），直接位于目标区域，以便多个光源可以选择性地调制由电极主动监测活动的神经元。然而，由于存在大的刺激伪影和设备上有限的表面积，μLED光电极无法扩展到能够对大脑的大体积进行采样。
在本研究中，我们报告了一种新型光电极，它提供了大规模神经元活动记录的能力，同时能够使用单片集成的μLEDs精确刺激位于一百多个（百级）跨区域刺激目标（STAR）的神经元。hectoSTAR微发光二极管光电电极在纳米制造和集成组件组装方面实现了几项工程创新，与之前的设备相比，记录和刺激点的数量增加了一个数量级，密度提高了三倍，而无需牺牲记录和刺激性能。工程创新包括用于减轻刺激伪影的多金属层架构、高分辨率金属图案化和光电子组件的高密度集成，以及使用微制造中介层进行高通道数产品的高效面积封装。得益于这些创新，hectoSTAR微发光二极管光电电极上的256个记录点和128个μLED跨越了900×1300微米的脑区，从而允许研究跨脑区的相互作用。除了光电极外，我们还介绍了一种定制开发的基于现场可编程门阵列（FPGA）控制器，用于独立操控每个μLED，具有任意定义的脉冲形状和动力学。利用hectoSTAR微发光二极管光电电极和控制器，我们在行为小鼠中进行了首次实验，以解决以前用现有技术无法解决的问题。作为演示，我们展示了hectoSTAR微发光二极管光电电极在剖析皮层层和海马区之间网络相互作用方面的实用性。
二、结果
2.1. HectoSTAR微发光二极管光电电极实现大规模体内光电生理学研究
HectoSTAR微发光二极管光电电极的设计旨在实现高分辨率、大规模的光电生理学研究。具体而言，该光电极能够记录来自大脑广阔区域的细胞外峰电位和局部场电位（LFPs），并向其记录范围内的选定神经元提供光刺激，同时使用多个电极记录每个神经元的峰电位。探针的几何形状设计旨在最佳地记录来自二维层状结构的数据，如啮齿动物的多个皮质柱或海马亚区（图1a）。HectoSTAR微发光二极管光电电极在其四个6毫米长的支腿上整体集成了256个电极和128个μLED。记录和刺激位点覆盖的大脑区域面积可达1.17平方毫米（900微米×1300微米；图1b）。同时，光电极每个支腿的横截面积被最小化，以减少插入过程中对组织造成的急性损伤（支持信息）。
如图1c所示，光电极的每个支腿尖端包含64个电极和32个LED。两排铱电极（每排包含32个小型电极，尺寸为11微米×15微米）位于支腿中心。每列上相邻电极之间的垂直距离和列之间的水平距离分别选择为40微米和27微米，以确保任意两个相邻电极之间的距离不超过40微米。由于距离神经元胞体（或轴突）不足60微米的电极可以可靠地记录来自该神经元的动作电位，因此这种密集的电极配置允许多个电极同时记录单个神经元的动作电位（峰电位），从而有助于峰电位分类（图S1，支持信息）。尺寸与神经元胞体相当（8微米×15微米）的μLED位于支腿中心，允许对附近电极记录的神经元进行精确、共定位的光刺激。相邻两个LED之间的垂直距离设置为40微米，与每列电极的垂直间距相同，以便至少有一个μLED能够照亮正在记录活动的神经元。如图1d和e所示，每个μLED发出蓝光，其光谱（λ峰值≈470纳米）非常适合激活Channelrhodopsin-2视蛋白。每个LED产生的光刺激的开启和关闭时间以及强度都可以独立控制，以便在实验过程中通过开环设置随时生成任何复杂的刺激模式（无论是预定义的还是实时生成的），图1d显示了一个示例（电影S1，支持信息）。
图1. HectoSTAR微发光二极管光电电极实现高精度、大规模深部脑光电生理学研究。
（a)使用HectoSTAR微发光二极管光电电极进行大规模体内光电生理实验的概念图。HectoSTAR微发光二极管光电电极能够在从整个皮层层到背侧海马体CA1区域的大范围内，向多个深部脑位置提供任意光学刺激模式，同时同步记录该区域的单个神经元活动和局部场电位。大脑示意图（左侧）与HectoSTAR微发光二极管光电电极的长度成比例。灰色物体表示非活跃神经元，彩色物体表示活跃神经元。白色矩形显示记录位点的位置，蓝色发光点表示由多个μLED生成的一个示例刺激模式。
(b) HectoSTAR微发光二极管光电电极生成复杂光学刺激模式的3D模型。HectoSTAR微发光二极管光电电极有四个6毫米长、30微米厚的支腿，相邻两个支腿之间的间距为300微米。每个支腿可以沿着背腹轴在1.3毫米的范围内进行记录和刺激。
(c) 支腿尖端的详细示意图。插图显示了铱电极（记录位点，每个支腿64个）和蓝色发光GaN/InGaN μLED（刺激位点，每个支腿32个）的尺寸以及它们之间的距离。记录位点以“交错”配置排列，中心到中心的间距小于40微米。μLED位于光电极支腿的中心，中心到中心的间距为40微米。
(d,e) 制造的HectoSTAR微发光二极管光电电极的显微照片。在(d)中，一个封装的HectoSTAR光电极与一枚美国25美分硬币并排放置拍摄。在(e)中，比例尺长度为300微米。注意活跃μLED产生的蓝色光。
(f) 来自HectoSTAR光电极的局部场电位记录的示例，其中显示了由单个μLED提供的光学刺激引起的诱导响应（蓝色）。灰色轨迹表示非功能通道。
图1f所示的是从一个hectoSTAR微发光二极管光电电极记录到的示例神经信号，这些信号清晰地展示了光电极的记录和刺激能力。如图1f所示，通过将光电极单次插入，可以轻松捕捉到多个深部脑区域（这里是皮层层和海马体CA1）不同位置发生的神经元活动。在大通道数记录轨迹中，有群体活动的示例（从CA1区域的位点记录到的高频波动，以及从皮层位点记录到的间歇性“下陷”），这些活动都是由对小脑区域（蓝色高亮显示的CA1锥体层）进行精确光学刺激产生的。
2.2. 在最小尺寸平台上高密度、大规模集成μLED和电极
HectoSTAR光电极在其表面以高密度和大规模集成了异类组件，这种集成是通过先进的细间距金属图案化以及多层金属堆叠实现的。在迄今为止开发的μLED光电极中，由于金属轨迹在表面上占据的空间较大（每条轨迹约4微米），因此每个支腿上集成的μLED和电极的数量被限制在少数（总数约为10个）。为了突破现有μLED光电极制造工艺的限制，进行了大量的工程开发和优化，以便在支腿尺寸给定的约束条件下，以大约三倍于原有的密度容纳多个μLED和电极，从而减轻对组织的损伤。图2a展示了HectoSTA微发光二极管光电电极在制造过程中的几个关键步骤后的横截面示意图。LED驱动信号和记录神经信号的互连以0.7微米的半间距形成，每毫米可提供约700条金属轨迹线。通过这些极细的金属轨迹，可以实现窄支腿轮廓（在最底部的μLED处渐缩至50微米，在顶部μLED上方140微米）。
引入了一种创新的图案化技术，能够在不使用昂贵的电子束或极紫外光刻的情况下形成高密度金属轨迹。μLED和记录轨迹均由100纳米厚的金层构成，并且在使用步进重复晶圆曝光工具进行i线光刻步骤后，通过剥离工艺在每层上形成具有亚微米特征的图案。使用具有增强对比度顶层的双层抗蚀剂堆叠（图S2，补充信息），可以在整个4英寸晶圆上均匀且可靠地形成理想的逆向侧壁轮廓。使用电子束蒸发在抗蚀剂牺牲层上沉积100纳米厚的金（90纳米金在10纳米钛上），然后在基于N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）的溶剂热浴中进行剥离图案化。图2b和2c分别展示了LED形成和电极定义步骤后的HectoSTAR 微发光二极管光电电极支腿的显微照片，说明了在两层金属上可靠形成了亚微米互连。
尽管异类组件的高密度集成，但HectoSTAR微发光二极管光电电极表现出与之前报道的低LED密度光电极相当甚至更优的性能，支持其在体内的可靠运行。我们表征了制造的HectoSTAR微发光二极管光电电极的电学和光学性能，并确认了其适用于体内光电生理实验（图2e–i）。典型的μLED在2.56 ± 0.04 V偏置下允许1 μA的电流，在3.5 V下允许30.3 ± 1.52 μA的电流（均为平均值±标准差，n = 121）。最大电流设置为75 μA，这是考虑到互连尺寸，LED安全连续运行的推荐最大电流。在75 μA下，μLED产生7.03 ± 1.05 μW的辐射通量（平均值±标准差，n = 121），这相当于μLED表面约60 mW cm^(-2)。大多数电极在1 kHz下的阻抗在500 kΩ至2 MΩ之间（图2f），这些电极的中值阻抗为1.40 MΩ。LED的性能和电极阻抗分布范围较窄（图2e–h），并且与μLED和/或电极在光电极支腿上的位置无关（图2i）。电极阻抗足够低，满足所需的多路复用细胞外电生理学的要求，并且LED可以高效地产生足够多的光。
基于有限元方法（FEM）的模拟结果进一步验证了HectoSTAR微发光二极管光电电极适用于体内光电生理实验的可靠运行。一些重要的器件特性难以直接测量，但可以通过模拟准确估计，如记录电信号之间的串扰、μLED的照明分布以及μLED运行引起的组织加热。首先，HectoSTAR微发光二极管光电电极的静电和电路联合模拟（图S3a–c，补充信息）表明，到达电极的电压信号能够可靠记录，损失极小（<1 dB），并且在生理相关信号频率范围内（0.1 Hz ≤ f ≤ 10 kHz，图S2d，补充信息），来自相邻通道的串扰（<-88 dB）可忽略不计。模拟的μLED照明产生的辐照度分布表明，照明体积（其中Φe < 0.1 mW mm^(-2)）局限于LED附近区域，并且位于附近电极内（图S4a，补充信息）。最后，组织加热模拟证实，当μLED以最大安全功率驱动时（Welec = 4 V × 75 μA = 300 μW，图S4b,c，补充信息），组织温度升高不超过0.6℃。所有这些结果表明，HectoSTAR光电极可以安全地在高时空分辨率和高精度体内光电生理实验中运行。
2.3. 对任意图案光微刺激的μLED独立控制
我们设计了一个带有图形用户界面的开源定制多通道μLED控制系统，以实现对hectoSTAR微发光二极管光电电极上多个μLED的独立控制（详见第4节）。该系统的核心是一个基于FPGA的12通道光刺激控制器（光刺激芯片1代-Light版；见图3a和图S5，补充信息）。OSC1Lite旨在闭环设置中实现对多个通道电流输出的独立操控。此外，每个通道的输出都可以生成任意波形，从而生成多种刺激模式（见图S6，补充信息）。每个通道的电流输出每17.2微秒更新一次，分辨率为1微安，从而能够以高保真度生成任意电流信号（见图3b）。
图2. hectoSTAR微发光二极管光电电极的单片集成组件非常适合高精度体内光电生理学。
(a)展示了在三个关键制造步骤之后，hectoSTAR微发光二极管光电电极杆的一部分的虚拟横截面视图（上排）和俯视图（下排）的快照。在横截面视图中，为了说明目的，x轴（宽度）和y轴（厚度）的比例尺并不相同。(b) 为形成μLED结构后的杆表面的显微照片；(c) 为信号记录电极的互连形成后的杆表面的显微照片。两个比例尺均为20微米长。(d) 为释放后的hectoSTAR微发光二极管光电电极杆的显微照片。比例尺为100微米长。(e) 典型hectoSTAR微发光二极管光电电极上μLED的电压-电流关系。
实线表示中位数，阴影区域表示在每个正向偏置电压下最小电流和最大电流之间的分离。f-h) 直方图显示了典型hectoSTAR微发光二极管光电电极上电极和LED的电学和光学特性的分布。电极在1 kHz下测量的阻抗幅值、LED在3.5 V正向偏置电压下的电流以及LED在75 μA电流下的辐射通量分别如图f、g和h所示。i) 热图显示了典型光电极上电极阻抗和LED辐射通量的空间分布。
OSC1Lite在接收到触发输入脉冲后，会在17.25 ± 0.04 μs内（图3c；平均值±标准差，n=500）立即发送触发输出脉冲，并在30.8 ± 1.3 μs内（图3c；平均值±标准差，n=500，在50%转换点处测量）生成电流信号。我们利用基于AVR微控制器板为48个独立通道生成触发信号（图3d）。如图3d所示，OSC1Lite通道产生的触发输出脉冲被多路复用为4个模拟信号，然后输入到电生理信号记录系统（RHD USB接口板，Intan Technologies），以便记录系统能够记录光刺激的准确时间戳，并将其与电生理记录同步。
东莞富临医疗科技有限公司是神经科学电生理领域的专家，我们供应Intan Technologies全系列产品。
图3. 使用OSC1Lite实现μLED的独立高度复用控制。
(a) OSC1Lite的示意图。图中展示了每个电流输出通道的所有商用现成集成电路（IC）组件。
(b) 从OSC1Lite通道生成的示例电流波形的片段。得益于控制器软件的高采样率（≈60 kS s⁻¹）和任意波形生成功能，电流脉冲上升沿的形状可以轻松修改为不同的形状。注意，由于量化误差导致的信号失真可忽略不计。
(c) 触发输入信号、触发输出信号和电流输出（输入和输出到一个OSC1Lite通道）的图示。图中以灰色显示了50条单独轨迹，并以彩色显示了平均轨迹。触发输入信号上升沿与随后触发输出信号上升沿之间的平均（±标准差）延迟为17.25（±0.04）μs，触发输入与电流输出之间的延迟为30.8（±1.3 μs），n=500。
(d) 48通道系统的电路图。由基于AVR的微控制器板生成的48个晶体管-晶体管逻辑（TTL）脉冲触发电流输出。分压器将48个TTL信号合并为4个模拟信号，然后输入到电生理记录系统的模拟输入通道。高密度和高通道数的电极和μLED，结合对任意μLED的独立控制，可以实现e)多层光标记、f)神经序列生成和g)闭环光遗传学实验。
(e) 皮质和海马回电路的示意图（蓝色三角形、绿色和紫色圆圈分别代表锥体细胞、小清蛋白+和生长抑素+中间神经元）。请注意，hectoSTAR光电极可以同时记录并刺激皮质和CA1锥体层的神经元。图中展示了用于头固定小鼠实验的光电极杆示意图（中间）和刺激模式（右侧）。在此刺激序列中使用了每杆12个μLED（50 ms刺激与100 ms无刺激交替进行）。
(f) 在CA3中可以生成OSC1Lite控制的时间变化的神经序列，并可以沿着海马回的CA1-CA3轴记录由此产生的活动。
(g) 行为或神经事件可以触发OSC1Lite，而OSC1Lite又可以在35 μs内向任意μLED输送电流。根据动物的位置，OSC1Lite可以在小鼠在跑道上奔跑时激活μLED（刺激位置由红外LED显示）。
该系统由四个定制的μLED控制器并联组成，能够在体内实验期间实时控制μLED光电极上多达48个独立的LED。该系统采用市售的现成电路组件构建，因此为利用hectoSTAR微发光二极管光电电极的高精度光刺激能力提供了一种既有效又经济的方法。
控制器系统每个通道所能生成的图案的灵活性，加上触发输入信号与电流产生之间的短延迟，使得该系统可用于多种实验设计（见图S7，支持信息）。图3e-g展示了这项技术实现的三个独特实验示例。hectoSTAR微发光二极管光电电极探针允许跨层跨结构对遗传定义的细胞类型进行同时的光遗传学标记，并研究它们的功能相互作用（图3e）。为了理解上游输入是如何被下游目标结构读取的，可以在上游生成人工输入模式，同时记录两个神经群体（图3f）。最后，控制器电路的短延迟甚至允许进行闭环光遗传学实验，刺激由行为或神经事件触发（图3g）。
2.4 跨脑区细胞类型特异性相互作用的研究
为了证明hectoSTAR微发光二极管光电电极在体内神经回路询问方面的能力，我们对头部固定的小鼠进行了急性记录（见图S8，支持信息）。hectoSTAR探针被插入背侧海马体，同时靶向皮层和CA1区（见图4a,d）。其中一些实验还靶向背侧CA1、CA3和齿状回亚区（见图S9a和S10，支持信息）。层状局部场电位（LFP）记录可根据电生理标志物识别细胞和树突层。除了宽带LFP外，低阻抗电极还能够记录到高信噪比的细胞外尖峰，在许多情况下尖峰幅度超过200微伏（见图4a,b和图S1，支持信息）。由于探针杆中的电极具有高密度且交错排列，因此可以同时从多个电极（通常为3-5个电极）记录到单个神经元的尖峰。在对记录的尖峰进行半自动聚类后，在9次记录会话中共分离出700多个单细胞单位（每次会话84±28个单细胞单位，平均值±标准差；n=7只小鼠）。这些单位根据波形和尖峰序列的特征被分类为假定细胞类型（见图4b,e，此类分类的标准可参见第4节）。
通过生理特征对细胞类型进行分类容易出错，并且只能将细胞大致划分为兴奋性或抑制性等宽泛类别。为了进一步完善这种分类并提供真实数据，我们通过在表达ChR2的转基因小鼠品系中，使用不同转基因小鼠品系中的单个μLED发出短暂光脉冲，对遗传定义的细胞类型进行了光遗传学“标记”。这些转基因小鼠品系中的ChR2选择性表达于小清蛋白阳性（PV+）或生长抑素阳性（SOM+）的抑制性细胞或钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CamKII+）表达的兴奋性细胞中。单个μLED发出的50毫秒光脉冲在附近表达ChR2的细胞中引发了具有短延迟的可靠动作电位放电（见图4b,c和图S9，支持信息）。而照亮相邻探针杆上的μLED并未诱发神经元的时序锁定放电（见图4c）。这种方法提供了真实数据，以指导我们在这些记录中对这三种细胞类型进行分类（见图4d,e）。
HectoSTAR光电极具备的多区域记录和识别遗传定义细胞类型的能力，为研究行为动物中的回路相互作用提供了一种新方法。我们重点关注了由海马体CA1区及其主要输入区域CA3区组成的回路。我们首先根据尖峰序列的互相关图确定了可能的单突触连接的锥体细胞-中间神经元细胞对。互相关图中存在一个显著的短延迟（1-3毫秒）峰值，表示存在功能性单突触细胞对（见图S11a，支持信息）。我们发现，在海马体亚区之间存在多个此类功能性连接的细胞对示例，包括光遗传学标记的CamKII+、PV+和SOM+细胞（见图S11b，支持信息）。利用hectoSTAR光电极进行二维记录，我们表征了这些细胞类型中单突触相互作用模式的空间分布。锥体细胞-中间神经元单突触连接的数量和强度遵循对数正态分布，大多数细胞具有少量且较弱的连接，而少数细胞具有大量连接的细胞对（最多14个）。我们发现，PV+细胞平均每个细胞的连接数多于SOM+或CamKII+细胞（PV+为3.53±2.63个连接/细胞，SOM+为2±1.41个连接/细胞，CamKII+为2.13±1.42个连接/细胞）。这些连接的强度（即尖峰传递概率）随着两种细胞胞体之间的距离增加而衰减（对于n=220个细胞对，尖峰传递概率与距离之间的相关性r=-0.14，p<0.05，秩和检验）。
然后，我们提出了一个使用传统光遗传学工具难以解决的问题：CA3到CA1的体内功能连接是否与下游细胞类型和局部连接有关？位于CA3锥体层的单个μLED发出的短脉冲刺激（120毫秒）在四个探针杆上的CA3和CA1区域均引发了强烈反应（活动传播范围超过1毫米）（见图5a-d）。然而，使用位于CA1锥体层的单个μLED发出的相同刺激仅引发了局部强烈反应（见图5b-d），这可能是由于CA1缺乏像CA3那样的强烈反复兴奋性连接。我们发现，在CA1和CA3中，不同细胞类型对CA3局部刺激均有反应（见图5e）。CA1细胞的反应延迟比CA3细胞长（p=0.036，秩和检验）。与CA1中的CamKII+或SOM+细胞相比，CA1 PV+细胞更有可能对局部CA3刺激产生放电反应（响应的PV+/SOM+/CamKII+细胞比例为52/5/27%），且放电延迟更短（p<0.05，秩和检验）。
在每次记录会话中，我们都发现了CA1中的多个局部功能连接模式，即多个中间神经元连接到同一个突触前锥体细胞，或反之亦然（见图5f和图S11，支持信息）。因此，我们分析了下游连接（在CA1中）是否与上游输入（来自CA3）有关。事实上，我们发现，对于具有局部单突触连接的CA1细胞，其对CA3刺激的反应幅度显著相关（r=0.51，p<0.001），而对于未连接的细胞则无相关性（r=-0.014，p>0.05），这表明存在跨脑区的功能连接模式（见图5g）。
图4. 使用hectoSTAR微发光二极管光电电极在头部固定的小鼠中进行多区域记录。(a) 在PV::ChR2小鼠的11个通道上记录的局部场电位（LFPs）。左侧：单探针布局显示了本实验中使用的激活μLED的位置（深蓝色）。LED-15至LED-25发出的50毫秒光脉冲（水平蓝色线）诱发了单个神经元的放电活动（蓝色阴影区域）。底部的光栅图显示了两个神经元在μLED刺激下的活动。示例神经元相对于记录位置的可能位置显示在左侧。(b) 平均波形和自相关直方图表明单个神经元得到了很好的分离。右侧显示了两个细胞的单个LED触发光栅图。青色细胞被shank-4上的LED-19显著调制（p < 0.01，自举检验），而品红色细胞被shank-4上的LED-17调制（p < 0.01）。(c) 显示了每个细胞的LED触发平均放电率。每一行代表一个LED触发的神经元的平均放电率（n = 396次试验，LED1-12位于shank-1，LED13-24位于shank-2，LED25-36位于shank-3，LED37-48位于shank-4，白色虚线表示光刺激的开始和结束）。以下LED显著调制了这些细胞（青色细胞：LED43-45，放电率：4 Hz、14.2 Hz和26.75 Hz，置信区间CI = 0.8–3.1；品红色细胞：LED42-46，放电率：10.64 Hz、48.44 Hz、105.64 Hz和15.9 Hz，CI = 4.3–10.4）。(d) 探针布局显示了记录到的神经元胞体（n = 61个疑似锥体细胞，15个窄型中间神经元和12个宽型中间神经元）的可能位置。单个神经元聚集在大脑皮层和海马体的细胞层中（0 μm代表大脑表面）。(e) 根据神经元的波形从起始到峰值的时间和爆发指数对神经元进行聚类。注意窄波形中间神经元和锥体细胞的分离。蓝色星号表示在与（a）中相同的记录会话期间记录到的光标记PV+细胞。
图5. 揭示CA3-CA1回路中细胞类型特异性的相互作用。(a) 在CA3区域（位于shank 1的蓝色球体）通过100毫秒单次μLED激活所诱发的示例反应。上方：尖峰的光栅图显示了由每个shank记录的细胞的顺序激活。每个点代表一个尖峰，每条线代表一个单独的神经元。下方：局部场电位（LFP）的深度分布叠加在电流源密度（CSD）彩色图上。注意，在四个shank上都诱发了振荡反应和单元放电。(b) 与（a）中的图相同，但在此情况下，激活的μLED位于CA1区域（shank 1的顶部）。仅在shank 1上诱发了强烈的LFP和单元反应。(c) 在CA1中，作为与激活的μLED水平距离的函数，高频LFP功率（80–200 Hz）在CA3刺激时高于CA1刺激（对于距离激活的μLED 1–3个shank的位点，秩和检验，p < 0.001）。(d) 在距离激活的μLED 1–3个shank的位点，CA1中的单元放电反应在CA3刺激时也强于CA1刺激（秩和检验，p < 0.01）。(e) 在探针布局上叠加了记录的神经元胞体的位置（n = 89个锥体细胞，19个窄波形中间神经元和3个宽波形中间神经元，分别用红色、深蓝色和浅蓝色表示）（CA1和CA3分别用黄色和橙色表示）。光栅图显示了由CA3中单个μLED（蓝色球体）发出的120毫秒光脉冲诱发的单个细胞反应。(f) 左上角插图：从一个假定锥体细胞与中间神经元之间的交叉相关函数（CCG）中识别出的示例功能性单突触连接。用有向图（箭头指示神经元之间连接的方向）说明了同一记录会话中的不同功能性连接模式。为每个高亮显示的神经元显示了自相关直方图和CA3光遗传序列触发的光栅图。(g) CA3刺激CA1细胞时，具有相互单突触连接的细胞所诱发的放电率之间的相关性（r = 0.51，p = 0.0008；n = 50对）。
2.5. 跨脑区的输入输出转换解析
CA3/CA2区域会产生一种称为尖波-涟漪（SPW-Rs）的同步网络模式，该模式会传播到CA1区域，强烈激活当地的细胞集群。在SPW-Rs期间，CA1细胞放电的顺序会重复再现近期的经历，据此有人提出，这构成了记忆巩固和行动计划的细胞机制。SPW-Rs期间已描述了两种主要的活动模式。海马细胞可以以与行为期间放电相同的顺序重新激活（“正向序列”），也可以以相反的顺序重新激活（“反向序列”）。这两种模式已被归因于不同的功能角色，但其潜在机制仍不清楚。此类神经元序列在记忆中发挥作用的一个先决条件是，下游区域能够有效地区分它们。
图6. 从上游群体活动中读取输入模式。(a) 实验设计。每个shank上的单个μLED（底部；蓝色球体）以前向或反向的方式（顶部）依次激活，以刺激CA3神经元。(b) CA3前向（左）和反向（右）刺激在CA1中诱发的示例反应。上方显示的是CA1滤波后的局部场电位（LFP，80–300 Hz），下方显示的是单元群体反应（仅包括在这些事件期间放电的CA1锥体细胞）。在第一列中，单元根据其在CA3前向刺激期间的放电顺序进行排序，在第二列中，根据其在反向刺激期间的放电顺序进行排序。(c) 在CA3前向和反向刺激事件中，CA1序列的秩相关（n = 120/120个前向和反向事件），***p < 0.001，秩和检验。(d) 解码方法示意图。将CA3刺激事件中CA1锥体细胞的放电序列作为线性支持向量机（SVM）的输入特征，以解码输入模式（前向或反向刺激）。(e) 解码准确率与随机分布的比较。红线表示解码准确率（71.4%），黑色直方图表示随机分布（p = 0.0004；10000次随机）。
我们利用同时记录的CA1和CA3数据来验证这一假设。我们通过以正向或反向顺序依次激活每个shank中位于CA3锥体层的μLED，以交错方式传递两种CA3刺激模式（120 ms部分重叠的脉冲，图6a）。该实验在CamKII::ChR2转基因小鼠（n = 3）中进行，因此只有锥体细胞被直接激活。这种刺激训练了局部CA3细胞，并在上游CA1中诱发了尖波-涟漪（SPW-R）（图6b）。在CA3正向和反向刺激期间，CA1神经元的激活顺序不同（图6c）。
为了量化这一现象，我们分析了刺激事件中CA1活动的秩相关性。对于相同类型的CA3刺激，CA1序列的相关性高于正向与反向事件之间的比较（图6c）。为了直接测试CA1群体是否能够区分正向和反向输入序列，我们采用了支持向量机（SVM）解码方法。我们使用SVM对CA1群体对CA3正向和反向刺激模式的反应进行二元线性分类（图6d）。我们取CA3刺激120 ms期间CA1神经元的放电序列，并将其作为SVM解码器的输入特征。一半数据用于训练解码器（n = 120个事件），另一半用于测试解码准确性。我们发现，我们的解码器有71.4%的时间能够正确预测CA3输入模式，与随机分配CA3输入标签的随机分布相比，这一结果具有高度显著性（图6e；p = 0.0004；自助法检验）。这些结果表明，CA1可以有效地读出其CA3输入的顺序。
三、实验
3.1 HectoSTAR微发光二极管光电电极的制作与封装
所有微制造工艺步骤均在位于美国密歇根州安娜堡市的密歇根大学Lurie纳米制造中心完成。我们采用了多层金属配置制作μLED光电极的工艺，并使用精细间距的光刻技术来定义光电极表面上的窄金属线，这些金属线作为LED和电极的互连。具体来说，我们利用薄双层抗蚀剂和5倍图像缩小的i线步进重复投影光刻工具，通过剥离工艺定义了100纳米厚、700纳米宽的金（Au）线。在曝光前，我们在抗蚀剂堆叠的顶部旋涂了一层对比度增强材料，并立即冲洗掉。对于每一层金属，我们在图案化的晶片上通过电子束蒸发沉积了90微米厚的金层，并在其上先沉积了10纳米厚的钛（Ti）作为粘附层。然后，将双层抗蚀剂在基于N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）的溶剂的温暖（40℃，过夜浸泡）浴中溶解，以完成剥离过程。
制作好的hectoSTAR光电极被封装在提供与外部信号调理电子设备接口的印刷电路板上。我们在商业PCB制造工厂（Hughes Circuits，美国加利福尼亚州圣马科斯）制造了两层印刷电路板，其半间距为2密耳（0.051毫米），铜迹线厚度为0.7密耳（半盎司，0.018毫米）。在将光电极连接到印刷电路板之前，我们在电路板上回流焊接了用于连接PCB与神经元信号记录前置放大器和LED驱动器的电气连接器。
我们使用了单独制作的4微米厚的聚酰亚胺柔性中间层，以提供印刷电路板与光电极之间的电气和机械连接。包含嵌入式金属线的聚酰亚胺电缆是在硅晶片上制造的，然后从晶片上释放。在金属线的两端形成金球凸点，以形成从电缆上的金属线到下方焊盘的垂直连接。我们使用了球焊机来形成金球凸点。将所有组件连接到印刷电路板后，所有暴露的金属表面都用热环氧树脂覆盖以保护。
3.2 HectoSTAR微发光二极管光电电极的电气和光学特性表征
我们测量了封装好的hectoSTAR微发光二极管光电电极上每个μLED的电流-电压（I-V）和辐射通量-电流（Φe-I）特性。我们使用源表为光电极上μLED的阳极和阴极提供电压，并在源表和光电极之间放置了多路复用器以提供自动通道多路复用功能。我们使用由积分球和光谱仪组成的光学测量系统进行光学测量。首先，我们将光电极的尖端移动，直到其柄部完全位于积分球内，以确保从μLED产生的所有光都能被收集。我们在每个LED的端子之间施加0至6.5V的直流电压，电流限制为75μA，并记录源表的电流输出和光谱仪检测到的光谱通量。通过将350至600纳米波长范围内的光谱通量积分来计算辐射通量。
我们使用Intan神经元信号记录前置放大器（RHD 128通道前置放大器，Intan Technologies）在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（中测量了hectoSTAR微发光二极管光电电极上每个记录电极的1kHz阻抗。我们使用神经元信号记录系统（RHD2000，Intan Technologies，配备RHD2000接口软件v1.5.2）一次测量128个通道的电极阻抗。首先，我们用250mL烧杯装满1×PBS。将前置放大器连接到光电极PCB上的一对Molex连接器后，将μLED光电极降低到容器中，直到其柄部的下半部分（约3毫米）浸入PBS中。参考线的裸露尖端（另一端焊接到前置放大器上相应引脚的过孔上）也浸入PBS中。使用Intan软件的自动阻抗测量功能测量前128个电极的阻抗后，将前置放大器移动到另一对Molex连接器上，并测量其余电极的阻抗。
3.3 百星μLED光电极性能模拟
对百星μLED光电极的记录电极信号的衰减（插入损耗，IL）和串扰（远端串扰，FEXT）进行了模拟。首先，使用COMSOL为光电极杆身的100微米部分构建了一个等效3D模型（支持信息中的图S2a）。等效电路模型（支持信息中的图S2b）中的电容值是通过静态静电分析计算的，而电阻值则是根据相应金属层的测量薄层电阻计算得出的。然后，使用LTSpice构建并模拟了一个由T型网络（单元结构如图S2c所示，支持信息）和信号记录电路中的其他组件组成的电路网表。对于1 mHz至1 MHz的频段，在目标节点（Vo1）和相邻节点（Vo2）处记录的电压信号的幅度和相位是在输入电压Vi1 = 1 V的条件下计算的。电容和电阻的值列在支持信息中的表S1中。
3.4 脑组织中的光强分布模拟
使用脑组织模型和平面8微米×11微米光源（代表μLED）模拟了脑组织中的光强分布。使用COMSOL求解了描述具有高散射和吸收系数的混浊介质内部光通量率的亥姆霍兹方程。将光电极的表面建模为理想反射表面。所使用的吸收系数（μa）和约化散射系数（μs’）分别为4.47和50.5 cm⁻¹。
3.5 组织加热模拟
使用脑组织模型（7毫米×7毫米×7毫米，宽×高×长）和植入组织内的6毫米长硅针进行了组织加热模拟。假设由LED提供的电量等效的热量（300 μW）是从8微米×17微米×0.5微米（宽×长×高）的体积中产生的，该体积对应于最底部μLED的位置。硅针的尺寸与百星光电极杆身相同，并且假设30微米厚的硅杆顶部表面覆盖有1微米厚的二氧化硅层。为了简化，忽略了所有金属迹线和GaN/InGaN LED堆叠，因为它们的厚度可忽略不计，且其热性能与硅相当。使用COMSOL求解了Pennes生物传热方程，假设硅针的顶面和暴露侧面是热绝缘的，其余表面是等温的。脑组织和植入光电极的热性能以及生物传热方程的系数列在支持信息中的表S2中。
3.6 急性动物实验
动物实验程序已获得密歇根大学动物护理与使用委员会（协议编号PRO-7275）的批准。实验中使用了一只雄性转基因小鼠（JAX品系#007612）。使用两个连接到探针安装在其上的PCB上的RHD 128通道记录前置放大器（Intan技术）进行了电生理记录。一台运行Intan数据采集软件的PC通过USB 2.0电缆连接到Intan USB接口板，用于实时采集和保存数据。使用NeuroScope对所有256个通道收集的数据进行实时可视化。使用函数发生器为LED驱动提供电压信号。使用0 V低电平电压和3.5 V高电平电压的矩形电压脉冲作为驱动信号，并在大脑皮层和海马体中每5秒应用一次100毫秒长的脉冲（n = 260个脉冲，支持信息中的图S12和图S13）。
3.7 头固定动物实验
所有实验均获得纽约大学医学中心动物护理与使用委员会的批准。在手术和头部固定记录之前，实验者会每日处理动物并使其适应。实验采用了小鼠（成年雄性，包括4只CaMKII-ChR2小鼠，2只PV-ChR2小鼠，和1只生长抑素-ChR2小鼠，体重26-31克），这些小鼠被饲养在光照/黑暗周期为12小时的饲养室内，手术前每笼两只，手术后单独饲养。在异氟烷诱导麻醉后，给予阿托品（0.05 mg/kg，皮下注射）以减少唾液分泌。使用直流温度控制器（TCAT-LV；Physitemp，克利夫顿，新泽西州，美国）监测并保持体温恒定在36-37℃。通过确认无痛觉反射来维持麻醉阶段。剃除头部皮肤，并用2%过氧化氢清洁颅骨表面。使用C&B Metabond牙科水泥将定制的3D打印头柱固定到颅骨上。标记开颅术位置，并在小脑上方放置带有引脚的不锈钢接地螺丝。在头部固定适应期之前，每只动物至少恢复7天。在记录期间，动物被允许在低摩擦的啮齿动物驱动带式跑步机上自由行走（支持信息中的图S8）。记录前一天，进行开颅术（距Bregma点2毫米后和距中线1.5毫米侧），并移除硬脑膜。手术后，用Kwik-Sil密封开颅部位直至记录。记录当天，将动物头部固定，清洁开颅部位，并用无菌生理盐水填充头柱。探针印刷电路板（PCB）的接地端连接到引脚，并使用手动微操器将探针插入目标深度。作者在插入过程中不断监测电生理信号。使用RHD2000记录系统（Intan Technologies）以20 kS/s的速度对收集的数据进行数字化。到达目标深度后，作者等待至少15分钟。从每只小鼠记录基线期和光遗传学刺激期。记录结束后，用Kwik-Sil密封开颅部位，并将动物放回其饲养笼中。如果从一只动物身上记录了多个时段，则如上文所述在对侧准备新的开颅术。
3.8 μLED控制
使用电流控制的刺激来驱动单个μLED。每个电极阵列由一个OSC1Lite控制。实验前选择激活的μLED位置，并在整个记录期间保持不变。使用OSC1Lite的开源图形用户界面定义刺激幅度和波形。使用连接到无焊面包板（支持信息中的图S6）的36针Omnetics电缆（A79029-001）向单个μLED提供电流。Arduino Mega 2560微控制器的48个数字输出连接到4个OSC1Lite的触发输入。在实验前将预定义的刺激序列上传到Arduino板，并通过手动开关触发序列。Arduino代码持续运行，直到手动开关关闭。所有刺激参数均列在支持信息的表S3中。
3.9 局部场电位分析
如先前所述进行波纹检测和小波谱图计算。为了检测波纹，选择了位于锥体层中间的单个电极。宽带局部场电位（LFP）信号通过带通滤波（高斯差分；零延迟，线性相位FIR），并通过在4个标准差处截断、整流和低通滤波来计算瞬时功率。低通滤波器的截止频率对应于平均带通频率的p个周期（对于80-250 Hz带通，低通滤波为55 Hz）。随后，计算未截断信号的功率，并检测所有超出平均值4个标准差的事件。然后将事件扩展到（未截断）功率降至1个标准差以下；丢弃短时间事件（<15 ms）。为了以高分辨率分析LFP中的高频振荡活动，使用复杂Morlet小波计算LFP的复杂小波变换。对于50-150 Hz频带中的每2 Hz频率步长，计算小波。使用来自每个单独电极的LFP，为每个检测到的锐波涟漪（SPW-R）或刺激脉冲在[-150, +150] ms窗口内计算谱图。将单个事件的谱图平均以构建最终图。
通过增加的单元活动和特征LFP模式从生理学上识别CA1区的锥体层。通过对LFP应用电流源密度（CSD）分析和独立成分分析（ICA）来确定树突亚层。
3.10 单单元分析
通过将单个动物在一天内的所有记录合并，准备了一个连接信号文件。为了提高峰值排序的有效性，在自动峰值排序之前（在检测到的伪影前1ms和后5ms，时间戳之间进行线性插值）去除刺激诱导的起始和终止伪影。使用Kilosort首先对疑似单单元进行排序，然后使用Phy进行手动整理。在提取每个疑似单单元活动的时间戳后，使用自定义MATLAB（Mathworks，纳蒂克，马萨诸塞州）脚本分析刺激前时间直方图和放电率增益。
3.11 细胞类型分类
在处理流程中，细胞被分为三种假定细胞类型：窄型中间神经元、宽型中间神经元和锥体细胞。中间神经元的选取基于两个独立标准：如果波形波谷到波峰的潜伏时间小于0.425毫秒，则归类为窄型中间神经元；如果波形波谷到波峰的潜伏时间大于0.425毫秒且自相关直方图的上升时间大于6毫秒，则归类为宽型中间神经元。其余细胞则被归类为锥体细胞。自相关直方图采用三指数方程进行拟合，以补充基于波形特征的传统单细胞分类方法。突发放电被定义为具有小于9毫秒的峰间间隔的尖峰群。作者从七只动物在九次实验中分离出762个假定单细胞单位（n = 544个假定锥体细胞，n = 152个假定窄型中间神经元——其中10个为小白蛋白阳性中间神经元，n = 66个假定宽型中间神经元——其中4个为生长抑素阳性中间神经元）。
3.12 光遗传学标记PV和SOM细胞
为了在皮层和海马体中光遗传学标记PV和SOM细胞，分别使用了PV-Cre::Ai32和SOM-Cre::Ai32小鼠。使用48μLEDs在四个电极支脚上每100毫秒发送50毫秒的光脉冲，至少发送200次。在每个光脉冲的首尾之间，对每个神经元的放电活动重新采样500次，以构建自助样本。然后，作者为每个单细胞单位计算了一个自助分布和置信区间（0.001–0.999）。如果神经元的峰放电率在光照后5–8毫秒窗口内的放电率超出自助置信区间，则该假定单细胞单位被归类为光遗传学激活。
3.13 单突触细胞对分析
应用了交叉相关（CCG）分析来检测假定单突触连接。CCG计算的是参考尖峰序列和时移目标尖峰序列之间尖峰传递概率的时间分辨分布。使用了一个[-5, +5]毫秒的窗口间隔和1毫秒的箱尺寸来检测尖锐峰值或波谷，作为假定单突触连接的标识符。使用先前经过验证的卷积方法识别显著相关的细胞对。如果一对细胞中的参考细胞在0.5–3毫秒窗口内的任何CCG箱达到了置信区间以上，则认为该参考细胞与参照神经元具有兴奋性单突触连接。
3.14 CA1诱发顺序活动分析
为了分析由于CA3顺序刺激而在CA1中诱发的群体活动，收集了CA1锥体细胞在正向和反向刺激期间的尖峰。计算了正向和反向刺激事件之间或每种事件类型分别的成对秩序相关性。使用每个单元尖峰的质量中心，将每个刺激事件期间的CA1锥体细胞单元活动转换为标准化序列。使用皮尔逊相关性，将相关性值的秩分布与随机相关性（1000次随机，显著性水平p=0.05）进行比较。为了根据CA3的刺激模式对CA1群体反应进行分类，使用了线性支持向量机（SVM）分类器。输入分类器的特征是每个CA1单元在刺激事件期间的尖峰序列。分类器使用会话中一半的数据进行训练，并使用剩余数据进行性能评估。使用具有10000个替代随机事件标签的自助测试计算解码准确性。
3.15 统计分析
统计分析使用MATLAB函数或自定义脚本进行。没有使用特定分析来估计最小群体样本量或组大小，但动物数量、会话数量和记录细胞数量大于或等于之前相关工作中使用的数量。分析单位通常被确定为单个神经元或神经元集合。在少数情况下，分析单位是会话或动物，这在文本中有所说明。除非另有说明，否则使用非参数双尾Wilcoxon秩和检验（等同于Mann-Whitney U检验）或Wilcoxon符号秩检验。对于ANOVA后的多重比较，采用了Tukey的诚实显著性检验。在箱线图中，中央标记表示中位数，箱子的底部和顶部边缘分别表示第25百分位数和第75百分位数，须状线延伸到不被视为异常值的最极端数据点。一些图中未显示异常值，但将其纳入了统计分析。由于实验设计的限制，实验者在实验过程中并非对进行的操作（即光遗传学操作）保持盲态。
四、结论
我们在这里介绍了hectoSTAR微发光二极管光电电极的制造和测试。这种基于硅的探针具有256个电极和128个LED，分布在四个shank上，覆盖了一个横截面积为900 μm × 1300 μm的大体积。据我们所知，这是迄今为止将光源和电极结合在一起的最高封装密度，与其他先前报道的光电极相比，集成的电极和μLED数量多出一个数量级。此外，我们还开发了一种微控制器，用于独立控制μLED，以传递任意模式的刺激光。我们证明了该设备在行为小鼠中进行高分辨率选择性神经元调制和记录的独特能力。先前的光电极也能够以高时空分辨率记录和刺激神经元，但它们跨越的组织体积非常有限（≈250 × 800 μm）（表S4，补充信息）。这些减小的尺寸使得不可能使用其中一个设备同时记录多个脑区。虽然理论上可以在同一只动物中使用多个这样的设备进行记录，但由于技术难度，特别是当感兴趣区域非常接近时（如海马体的CA1和CA3区域），这样的实验至今尚未进行。hectoSTAR光电极的主要特点是能够同时进行多区域（如新皮层和海马体，或海马体的CA1和CA3亚区）的高密度神经元群体记录，以及以接近单细胞分辨率进行光遗传刺激。这使我们能够剖析海马体亚区间特定细胞类型的网络相互作用。
HectoSTAR光电极特别适合解决系统神经科学的主要目标之一——理解神经回路中的输入输出转换。迄今为止，这种推断通常是通过同时记录连接区域并关联跨区域的活动模式来完成的。虽然这种相关性方法已经为神经通信机制提供了有价值的见解，但需要扰动方法来测试基于相关性的结论。hectoSTAR光电极使人们能够在体内研究CA3到CA1功能输入的特性。首先，我们证明了使用单个μLED进行低强度局部刺激（可能只直接使给定μLED附近极少数锥体神经元去极化）可以在CA1和CA3区域的突触中训练其伙伴中间神经元。由光遗传驱动的CA3输入激活了不同类型的CA1突触后细胞，并表现出不同的反应特性。PV+细胞（包括篮状细胞、双层细胞和轴突-轴突中间神经元的子集的一组细胞）比SOM+或CamKII+细胞更容易被CA3输入激活，并以更短的潜伏期做出反应（图5）。这证实了先前观察到的CA3到CA1输入的强前馈抑制成分，并表明其由PV+中间神经元介导。
此外，我们还发现，CA1中的局部连接模式影响了对外部CA3输入的反应。与其他非连接的CA1细胞相比，具有功能性单突触连接的CA1细胞对CA3刺激的反应具有更强的相关性（图5）。这一结果表明，存在跨区域的功能连接模式。要进一步研究这些模式在CA3到CA1通信中的起源和功能作用，还需进行更多研究。
HectoSTAR光电极的第二项新发现表明，CA1神经元集群能够可靠地读出其CA3输入的序列顺序（图6）。这是一项重要发现，因为已推测与锐波涟漪（Sharp Wave-Ripple, SPW-R）相关的序列是海马体中学习和记忆的细胞标志。SPW-R期间海马体细胞的放电顺序重现了最近的经历，这一现象被称为“回放”回放可以按神经元在行为期间活动的相同顺序或相反顺序进行（“正向回放”或相反顺序的“反向回放”）。大量研究表明，回放的内容，即神经元集群的激活顺序，对于学习和记忆至关重要。该假设的一个前提是，这些序列需要被下游目标区域读出。CA1神经元群体能够区分其上游CA3锥体细胞的激活是正向还是反向顺序（图6）。在这些实验中，相同的单个细胞对两种输入都做出了反应，主要区别仅在于它们的放电顺序。总体而言，这些结果支持了神经元序列是大脑区域之间有效通信代码的假设。
HectoSTAR微发光二极管光电电极的实用性可以通过进一步的工程创新得到进一步提高。关键步骤是使设备后端小型化，以便在自由移动的小鼠和其他小动物身上进行实验。在本文中，我们展示了hectoSTAR微发光二极管光电电极在头部固定动物中的能力。未封装设备的尺寸非常小，尺寸为4.2 × 11.1 × 0.03毫米（宽×长×厚），包括用于外部连接的后端。当前实现中，集成了与记录和刺激系统接口的连接器的印刷电路板尺寸较大，无法在实际中用于自由移动的小型啮齿动物。如果可以通过柔性电缆（即使用微柔性技术）将具有适当尺寸和布局的引线焊盘的微型接口电路与电路集成，则封装后的设备尺寸可以足够小，能够安装在自由移动的小鼠头上。
先前的工作已经证明了柔性电极接口在长时间记录同一神经元方面的实用性。我们方法的一个缺点是用于制造探针时采用的硅基板的刚性。因此，这项工作的一个有前途的未来扩展方向是开发采用柔性（例如聚对二甲苯）而不是刚性硅基板版本的hectoSTAR微发光二极管光电电极。为了实现这一目标，仍需克服许多工程挑战，包括在硅基板上单片集成多色LED、将μLED以高产量转移到柔性基板上以及实现无缺陷的柔性聚合物封装。最近，一些研究小组已经证明了多色LED单片集成和将μLED从刚性基板转移到柔性基板上的晶圆级转移的技术。我们预计这些技术将在不久的将来成熟，并应用于下一代hectoSTAR微发光二极管光电电极的制造。
另一个有前景的未来发展方向是将能够进行细胞内电生理记录的纳米级电极集成到hectoSTAR微发光二极管光电电极上。这种细胞内记录能力无疑将带来巨大优势，能够监测重要的亚阈值神经元活动，而这是细胞外记录无法获得的。同时，必须仔细评估细胞内记录的内在局限性：由于膜损伤（进而导致细胞死亡）而导致的典型短时间记录（<30分钟）、低细胞产量等。对于需要长时间连续监测大量神经元群体的实验，使用细胞内电极将不是最佳选择；然而，将其与大规模细胞外记录和光遗传学操作相结合，可以为剖析神经回路机制提供一种宝贵的工具。
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