利用多电极阵列（MEA）记录来区分兴奋性神经元和抑制性神经元是一项严峻的实验挑战。目前在体外开发的方法大多依赖于尖峰波形分析。然而，这些方法往往分辨率较差，并且可能会因尖峰幅度和神经元形状的可变性而产生误差。最近在人脑内的记录表明，尖峰波形特征与诸如放电率、自相关和变异系数等时域统计数据相关。然而，无论是在体内还是体外，都没有精确的标准来准确地将已识别的单元归为特定的神经元类型。为了解决这个问题，我们将 MEA 记录与在 γ- 氨基丁酸能（GABAergic）细胞中表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠新皮层培养物的荧光成像相结合。通过这种方式，我们可以筛选出 “真正的兴奋性神经元”（AENs）和 “真正的抑制性神经元”（AINs）。因此，我们基于自相关、爆发长度、尖峰数量（SN）、放电率、变异系数的平方以及法诺因子（FF，即尖峰计数方差与均值之比）对 1275 个单元（来自 405 个电极，n = 10 次实验）进行了表征。这些指标在 AINs 和 AENs 之间相差约一个数量级。特别是，FF 结果提供了一种发放编码，能够精确地（无重叠地）识别兴奋性和抑制性单元。所有已识别的 AEN 组和 AIN 组之间的 FF 差异具有高度显着性（p <10^(-8)，方差分析事后多重比较的图基检验）。我们的结果表明，存在一种基于统计指标的方法，可独立于尖峰宽度来区分兴奋性神经元和抑制性神经元。
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一、引言
大脑皮层中的信息处理依赖于许多类型神经元之间的复杂相互作用，而人们对这些神经元之间的相互作用了解甚少。最近的多部位细胞外记录技术能够对大量神经元群体的活动进行采样。这些方法有望极大地推进我们对支配新皮层回路基本规则的理解。然而，有几个因素使得基于细胞外记录的放电特征来识别特定神经元类型变得模糊不清。甚至仅仅是区分锥体细胞和中间神经元都绝非易事。例如，在运动辨别任务中，猴子前额叶皮层中的神经元会受到行为背景的强烈调节，并且试验间巨大的放电变异性常常会掩盖将放电正确归类到神经元类型的过程。
一些实验室试图根据主要神经元通常更长的尖峰持续时间和自相关函数（ACF）更快的衰减来区分它们。然而，尖峰持续时间和细胞类型之间的关系对于单个神经元来说并不一定成立。在被称为 “喋喋不休细胞” 的锥体细胞中以及在锥体束和猕猴腹侧前运动皮层的主要细胞中都观察到了短动作电位。在我们之前对新生小鼠新皮层长期培养物进行的多电极阵列（MEA）记录研究中，我们也发现尖峰持续时间和自相关图之间经常存在不一致的情况。因此，为了对兴奋性和抑制性细胞进行聚类，我们要么依赖自相关图，要么依赖法诺因子（FF），即定义时间窗口内尖峰计数的方差与均值之比。使用 FF 使我们能够有效地将单元分类为两个簇，这两个簇的比例与通过不同方法确定的锥体细胞和中间神经元的典型比例一致。此外，在人体中进行的体内 MEA 实验表明，在规则放电（推测为锥体）和快速放电（推测为抑制性）细胞中观察到的尖峰波形差异伴随着不同的自相关函数（ACF）、变异系数（CV）和放电率（SR）。
然而，在细胞外多阵列记录中，仍然缺乏能够可靠区分兴奋性神经元和抑制性神经元的明确统计参数。在本文中，我们将从单细胞电极记录的尖峰与相应神经元在体外的神经化学性质相关联，而目前在体内无法进行这样的操作。我们使用了表达与绿色荧光蛋白（GFP）融合的谷氨酸脱羧酶异构体 GAD67 的小鼠。GAD67 是一种 γ- 氨基丁酸（GABA）合成酶，通常与异构体 GAD65 以不同比例共表达于 GABA 能细胞中。之前已有其他研究人员对 GAD67-GFP 基因敲入小鼠进行了表征。绝大多数的 GFP 阳性细胞表达 GABA 能标记物。此外，膜片钳记录显示所有 GFP 阳性神经元在功能上都是 GABA 能的。
为了确定兴奋性和抑制性神经元（定义为 GFP 阳性细胞）的诊断统计数据，我们收集了数千个单元的数据。对于每个单元，我们分析了持续数小时且包含数千个尖峰的连续记录。在通过主成分分析（PCA）将尖峰进行标准分类为马氏距离分离的单元后，我们计算了一系列生理相关的统计数据。互相关动力学表明，存在类似于在大鼠和人体体内观察到的单突触兴奋性和抑制性通路。总之，我们发现基于 FF 确定的 “计数” 编码（或基于变异系数的平方（CV²）确定的 “时间” 编码）能够最好地区分兴奋性神经元和抑制性神经元，这种编码也越来越多地用于表征体内神经元的放电情况。
二、材料与方法
01.伦理声明
实验是根据《实验动物护理原则》（指令 86/609/EEC）进行的，并得到了米兰比可卡大学伦理委员会的认可。研究人员已尽一切努力尽量减少实验动物的使用数量。
02.细胞培养
皮质神经元原代培养物是通过标准程序，从表达 GAD67-GFP 的小鼠中制备而来。从断头的出生后小鼠（P1-P3）中取出大脑皮层（不包括海马体），切成 1 立方毫米的小块，然后在 37°C 下用 0.15% 的胰蛋白酶和 10 微克 / 毫升的脱氧核糖核酸酶消化 20 分钟。接下来，将细胞进行机械解离，并以每毫升 600-900×10³ 个细胞的密度接种在预先用 0.1%（重量 / 体积）的聚乙烯亚胺和 20 微克 / 毫升的层粘连蛋白包被的多电极阵列（MEA）培养皿上。MEA 培养皿上有直径为 30 微米的铟锡氧化物（ITO）电极，电极间距为 200 微米。在孵育 3 小时后，将接种培养基更换为含有 B27、1 毫摩尔谷氨酰胺和 10 纳克 / 毫升碱性成纤维细胞生长因子的神经基础培养基。培养物在 37°C、5% 二氧化碳的环境中，使用透气盖（MEA-MEM）进行培养。每 3 天更换一半体积的培养基。
03.GFP 阳性细胞的鉴定
MEA 培养皿的记录面积约为 2 平方毫米，平均神经元（加上神经胶质细胞）数量约为 6000 个细胞。因此，细胞之间的平均间距相对较大。研究人员使用配备落射荧光装置和 GFP 滤光片的尼康 T120 倒置显微镜对细胞进行检查。当用倒置显微镜检查时，直径 30 微米的圆形电极区域看起来是暗的（图 1），因此会遮盖一些 GFP 阳性细胞。然而，706 平方微米的电极面积覆盖的范围不到电极采样总面积的 10%，电极采样区域的直径约为 110 微米。更准确地说，荧光细胞的平均直径为 9.9±0.08 微米（n = 112），这与研究人员报告的约 12 微米的直径相当吻合。因此，只有中心落在 30 微米电极中心内 20 微米圆圈内的细胞才会被金属电极完全遮盖（假设细胞形状近似为球形）。假设每个细胞在电极采样区域内任何位置附着的概率相同，那么一个荧光细胞被电极完全遮盖的概率约为 3.3%，即直径 20 微米区域的面积与总采样面积之比。
图 1. 代表性实验中的 GFP+ 细胞和爆发相关细胞外记录轨迹（尖峰和局部场电位）。黑色圆圈为金属电极（直径 30 μm）；荧光点为 GFP+ 神经元；黑色轨迹为尖峰波形，白色轨迹为相应的局部场电位（参见“材料和方法”）。相邻电极之间的距离为 200 μm。
04.多电极阵列（MEA）记录；波形采集与分类
记录是在 36°C、二氧化碳浓度受控的培养箱中进行的，每个培养皿的记录时间不超过 4-5 小时，如先前所述。因此，整个记录过程可被视为处于稳态。原始模拟信号以 40 千赫兹的频率采样，使用 MEA-1060BC 或 1060INV 前置放大器（带宽 0.1-8000 赫兹）进行记录，这些前置放大器连接到一个 MEA 工作站（带宽 100-8000 赫兹）。为避免伪迹，随后重新调整阈值，并通过离线分类程序去除那些峰间间隔（ISI）短于预先设定的 2.5 毫秒不应期的尖峰信号。接下来，在基于主成分分析（PCA）的波形分类过程中，对于多单元电极，我们采用以下程序之一。（A）使用马氏距离阈值在 1.8-1.4 范围内去除尖峰。在这种情况下，我们检查发现，在所识别的单元中，多元方差分析分类统计的 p 值小于 0.01。（B）当前述程序导致过多尖峰无效时，我们手动去除侵入相邻单元椭圆区域的尖峰。后一种方法在降低 p 值方面非常有效，即使擦除的尖峰数量很少。那些尖峰放电率小于 0.03 赫兹、响应不规则或在下降状态期间持续放电的单元被舍弃。图 1 中所示的数据是使用 MC_Rack 软件获得的，该软件允许设置最佳滤波带宽以检测局部场电位（LFP）（5-180 赫兹）和尖峰（200-5000 赫兹）。我们使用了体外培养 12-15 天的 MEA 培养皿，通常有 58-59 个活性电极。分类软件的采集程序在 1.2 毫秒的时间窗口内进行，采用混合幅度 / 持续时间标准。
05.神经元簇识别与高级爆发状态分类
对于每个单元，我们计算了爆发持续时间（BD）、尖峰数量（SN）、爆发内尖峰放电率（IBSR）、法诺因子（FF，时间窗口为 6 秒）、峰间间隔（ISIs）、变异系数的平方（CV²，从峰间间隔直方图计算得出）以及爆发内间隔（IBIs）。使用 Neuroexplorer 软件从时间戳开始计算长达 200 毫秒的自相关函数（ACF）。或者（图 3），自相关函数（ACF）和互相关函数（CCF）都从 – 50 毫秒计算到 50 毫秒。活动爆发的检测和分类如先前报道。简而言之，使用 Neuroexplorer 软件识别出包含超过 2 个尖峰的爆发。当观察到两个连续的尖峰时，我们将爆发持续时间（BD）设定为它们的峰间间隔（ISI），尖峰数量（SN）设定为 2。对于孤立的尖峰，我们将爆发持续时间（BD）设定为 3 毫秒（即大于采集期间使用的不应期峰间间隔），尖峰数量（SN）设定为 1。此程序基于以下原理。（1）在所有有时会发放单个尖峰的单元中，绝大多数事件是包含至少两个尖峰的爆发；相应地，这些单元的平均尖峰数量（SN）总是大于 2。（2）由于反馈和前馈抑制控制，锥体细胞通常发放较少的尖峰。这种行为是中枢神经系统神经元以及体内反复受到刺激的神经元的典型特征。因此，在体外的循环网络中，这也应被视为生理现象。这些放电模式的示例如图 4（上部和中部的光栅图）所示。（3）“经典” 的爆发定义（至少 3 个尖峰）会导致我们错误地估计尖峰数量（SN）、爆发持续时间（BD）和爆发次数。（4）我们的网络在下降状态期间（即爆发之间的间隔）是静默的。我们忽略了那些持续放电的单元（每个网络中有 1-2 个）。（5）这些规则的有效性已被研究人员在 2012 年使用的新型分析方法所证实，在该分析中引入了 “网络爆发” 的概念，并且尖峰数量（SN）、爆发持续时间（BD）和爆发次数数据与这里使用的数据有很好的相关性。
对于每个神经元，在感兴趣的时间段内对爆发数据进行平均。神经元根据一种无监督学习方法进行分类，该方法包括数据降维的主成分分析（PCA），然后进行 K 均值聚类程序。通过使用异常值去除程序来改进聚类，该程序会舍弃那些与簇质心的马氏距离大于固定阈值（我们使用 1.4）的单元。该程序生成一系列与两个神经元簇相关的文件，给出：（1）找到第 1、第 2、第 3、第 i 个尖峰的概率密度函数（放电尖峰直方图，FSH），它表征了神经元的放电模式；（2）感兴趣时间窗口的法诺因子（FF）时间直方图。
06.统计数据分析
数据使用 OriginPro 7.0 或 8.0 软件进行分析并绘制图表。数据以平均值 ± 标准误差均值（S.E.M.）的形式给出，n 表示实验次数。除非另有说明，统计显着性使用学生 t 检验在指定的显着性水平（p）下进行评估。
在图 3 和图 5 中，我们对两个实验进行了全面的统计分析，在这两个实验中，我们分别记录了真正的兴奋性神经元（AEN）（12 个单元）和真正的抑制性神经元（AIN）（11 个单元）。这些实验代表了我们所有的观察结果。
这在表 1 中有所体现，在表 1 中，我们对从 8 个未在图 3 和图 5 中展示的实验中获得的单元的法诺因子（FF）特性进行了更简要的分析。在表 1 中，8 个补充的真正的兴奋性神经元（AEN）单元被命名为 AEN-sup，9 个补充的真正的抑制性神经元（AIN）单元被命名为 AIN-sup。组间的统计显着性通过单因素方差分析进行评估（在事后分析中，p 均小于 0.001，使用 Origin8Pro 软件进行分析）。我们对每个记录中 10 分钟时间段内的法诺因子（FF）数据进行了分析。表 1 表明，图 3 或图 5 中使用的法诺因子（FF）值与从其他实验中计算得出的值没有差异（p 大于 0.001）。相反，真正的兴奋性神经元（AEN）群体和真正的抑制性神经元（AIN）群体之间的比较显示出高度显着的差异（p 远小于 0.001）。对表 1 底部行（AEN + AEN-sup 和 AIN + AIN-sup）所示数据进行的柯尔莫哥洛夫 – 斯米尔诺夫正态性检验表明，这些群体呈正态分布（在 0.05 的显着性水平下）。
表 1. AEN（图 3）、AEN-sup、AIN（图 5）和 AIN-sup 的 FF 统计比较。
三、结果
01.多电极阵列（MEA）电极附近的神经元分布
为了将绿色荧光蛋白（GFP）阳性神经元的空间分布与 MEA 时间序列数据关联起来，我们使用了来自新生 GAD67-GFP 小鼠的长期新皮质网络，该网络具有平衡的兴奋抑制比例。我们在 10 个独立实验中，从不同小鼠制备的培养皿上的 405 个电极中识别出了 1275 个单元。记录在稳态下进行，时长约 14 小时。图 1 展示了一个典型实验，我们将不同电极区域的 60 张荧光图像与相应的尖峰轨迹（黑色）和局部场电位（LFP；白色）进行了关联。在每个电极周围，我们画出了直径分别为 70、110 和 150 微米的同心圆环。金属电极完全遮挡 GFP 阳性细胞这种罕见情况被忽略不计（见 “材料与方法”）。电极附近 GFP 阳性细胞的分布示例如图 2 所示。对于每一张图像，我们统计了距离电极中心 55 微米范围内的 GFP 阳性细胞数量。在我们的实验条件下，超过这个大致距离后，每个神经元的电紧张电流贡献就会小于电极噪声。在相关研究中可以找到完整的理论分析。如图 2 所示，在采样区域（约 9000 平方微米）内，有的电极周围有 GFP 阳性细胞，有的则没有。总体而言，在采样区域内共发现了 1544 个 GFP 阳性细胞，这意味着每个 γ- 氨基丁酸能（GABAergic）神经元大约对应 2300 平方微米的面积，这与之前免疫细胞化学估计的每个神经元约 1000 平方微米的结果相符（需注意，免疫细胞化学的多次洗涤操作会导致 50% 的细胞损失）。这一估计与从下丘切片的中央核、背侧皮质和外侧皮质得到的结果相符，它们分别得出每个神经元对应 2800、6250 和 4150 平方微米的面积 。这也与在体内和体外观察到的皮质 GABAergic 细胞的百分比一致。
图 2. MEA 电极附近的 GFP+ 神经元。以每个电极为中心画三个圆圈，直径分别为 70、110 和 150 μm。上图显示了一系列典型电极，在 110 μm 范围内没有附近的 GFP+ 细胞。在这些情况下，发现所有放电单元都是 AEN 类型。下图显示了一系列显示附近 GFP+ 细胞的电极。在这些情况下，发现所有单元都是 AIN 类型。右侧的图显示了找到带有 GFP+ 细胞的电极的累积概率。插图显示了从 8 次实验和 1544 个细胞中获得的相应计数直方图。
02.确定真正的兴奋性神经元（AEN）的放电特性
我们首先寻找未对 GFP 阳性神经元进行采样的电极（例如，图 2 的顶部面板）。电极周围 GFP 阳性细胞计数的直方图如图 2 的插图所示（n = 8）。这种分布在数值为 2 处达到峰值，没有 GFP 阳性细胞的电极占比约为 3%。在这些电极中，观察到的尖峰必定源自兴奋性神经元。为了将尖峰正确地归属于各个单元，只考虑正确的尖峰波形至关重要。为此，我们首先应用了基于幅度的分类程序（以识别小的和大的，或者近的和远的神经元），然后采用主成分分析（PCA）标准（见 “材料与方法”）。因此，我们在 405 个电极中确定了 20 个这样的电极（对 20 个单元进行采样）（完整的方差分析见表 1）。代表性的例子如图 3 所示，展示了从同一网络的 7 个电极记录中所表征的 12 个单元。典型波形显示在上部插图中。记录的轨迹以约 2 小时的时间段进行分析。图 3A–E 中的条形图报告了上部面板中绘制的每个单元的指定放电统计数据。尽管所有单元都来自兴奋性神经元，但在爆发持续时间（BD；变异系数 CV = 0.94）、每次爆发的尖峰数量（SN；CV = 0.7）和变异系数的平方（CV²；CV = 0.85）方面，观察到单元间存在较大的变异性。自相关函数衰减半衰期（τ1/2；CV = 0.33）和法诺因子（FF；CV = 0.62）的数据离散度较小。
图 3. 从不含 GFP+ 细胞的电极中识别出的单元的属性。上方插图显示了从不含 GFP+ 细胞的电极中记录的分配给单元的尖峰的平均（5400 秒）波形。（A–E）BD、SN、FF、CV2 和 τ1/2 的图，分别根据 2 小时记录的数据段计算得出，这些数据段包含约 160 个爆发，对于上方插图中显示的 12 个单元的尖峰模板，每个单元的尖峰都是如此。在同一图中，线（右端带有误差线）表示相应的平均值。A–E 面板左侧显示的空三角形是使用描述图 4 时提到的软件获得的平均值。（F）12 个单元平均值的 ACF。（G）12 个单元平均值的 FSH。（H）12 个单元平均值的 SNTH。(I) 来自单元 62a 的 40 个叠加尖峰（线）及其对应的平均值（空心圆）（J）单元 62a 的 ACF。（K）单元 62b 相对于 62a 的 CCF。ACF 和 CCF 是根据时间戳计算得出的。单元 62a 和 62b 的平均 SR 分别为 0.033 和 0.062 Hz。为了进行比较，附近单元 64b 和 64c（被识别为抑制细胞）的 SR 分别为 0.27 和 0.32 Hz（未显示）。CCF 图显示，在 0 到 50 毫秒的区域中，假设神经元 62a 已发射尖峰，则在 62b 中观察到尖峰的条件概率是观察到 -50 到 0 毫秒区域中尖峰的概率的约 5 倍。对于单元 62a (括号内为单元 62b)，在三个 1800 秒的时间段内，IBSR 分别为 191、228、228 Hz (46、47、42 Hz)，FF 分别为 1.82、1.65、1.76 (3.4、3.24、2.74)。
图 4. 细胞活动和神经元簇统计特性的栅格图。数据来自与图 3 中所示的相同实验和时间段，但使用了全部 98 个单元。左图：12 个神经元的四次爆发栅格图（持续时间为 1 秒）。左上：从不含 GFP+ 细胞的电极记录到的脉冲爆发（从上往下第二行和第三行分别对应单元 62b 和 62a，其波形如图 3 所示。中左：AEN 样类型的脉冲爆发（参见正文）。左下：AEN 样类型的脉冲爆发。中下面板中标记为 FF 的左侧列给出每个单元的平均 FF 值。（A–C）分别使用软件对使用 FF 分类的 78 个和 20 个单元进行聚类获得的 ACF、FSH 和 SNTH 图（时间窗口为 6 秒）。半封闭方块：AEN 样单元；空心方块：AEN 样单元。（D）为 AEN 样（78 个单元；白色条）和 AEN 样（20 个单元；黑色条）聚类计算的 BD、SN、FF、CV2 和 τ1/2 值的条形图。垂直尺度条形图：BD，50 毫秒；SN、FF 和 CV2，2；τ1/2，20 毫秒。（E-H）基于 FF 的聚类后，所有单位（线）、兴奋性（半封闭方块）和抑制性（空心方块）神经元的 BD、SN、FF-CV2 和 τ1/2 百分比累积直方图（如图所示）。累积直方图中的箱宽分别为：0.025 秒、1、0.5、0.5 和 10 毫秒。对于每个变量，每 30 分钟计算 3 个独立数据点。兴奋性和抑制性细胞总数分别为 234 和 60。
单元内统计数据的标准误差均值（SEM）以误差条的形式显示在每一列上。这些误差条通常较小（因此有时在图中不可见），因为我们的实验记录平均包含约 160 个自发爆发。另一方面，12 个兴奋性神经元的单元间平均值为：BD = 0.06 ± 0.016 秒，SN = 2.9 ± 0.52，FF = 3 ± 0.5，CV² = 2.6 ± 0.5，以及 τ1/2 = 35 ± 4 毫秒。这些值在图 3 中以贯穿 A–E 面板的水平线表示。相应的 SEM 条位于右端。由于平均单元数量相对较少，它们比单元内的误差条大得多。这些结果总体上与文献一致。
在此值得一提的是，培养的新皮质神经元表现出长时间的静默状态（“下降状态”），其间穿插着以频繁放电为特征的较短的 “上升状态” 。长时间静默状态的存在使得放电率无法恰当地衡量给定神经元的放电特性。为了更好地表征这 12 个单元，我们还计算了平均自相关函数（ACF）（图 3F）、具有特定尖峰数量的爆发频率（放电尖峰直方图，FSH；图 3G）以及尖峰数量时间直方图（SNTH；图 3H）。快速的 ACF 衰减表明这些神经元在上升状态期间的活动短暂，这与 BD 和 SN 的值一致。FSH 显示这些神经元通常每次爆发产生的尖峰不超过 8–9 个。此外，SNTH 表明在 10 毫秒的时间区间内出现的尖峰数量从未高于 4 个，并且在爆发结束时急剧减少。
为了说明尖峰波形的可变性，将来自同一单元（标识为 62a）的 40 个尖峰及其平均值（白色空心圆）进行了叠加（图 3I）。由于同一电极上还显示出第二个单元（62b），我们检查了这些细胞是否相连。因此，我们计算了 62a 的自相关函数（ACF）以及 62b 相对于 62a 的互相关函数（CCF）（图 3J–K）。62a 的 ACF 与 F 面板中显示的平均数据非常相似。更有趣的是，单元 62b 的几乎所有尖峰都在单元 62a 引发的尖峰之后几十毫秒内出现，这表明存在一种类似于新皮质中典型的兴奋性到兴奋性的连接。
03.将真正的兴奋性神经元（AEN）的统计特性与由盲软件和基于法诺因子（FF）的聚类所定义的特性进行比较
接下来，我们将为上述 AEN 单元计算的统计数据与从所有单元获得的统计数据进行了比较，无论这些单元周围是否有 GFP 阳性细胞。通过使用常用的基于 FF 的程序，我们得到了两个单元簇，我们之前提出这两个簇主要由兴奋性和抑制性神经元组成。图 4（光栅图）展示了属于不同类别的 12 个单元的放电模式。特别是，AEN 单元（顶部面板）如图 3 所述。类 AEN 单元（中间面板）和非 AEN 单元分别从推测的兴奋性和抑制性簇中随机提取。每个面板显示了 12 个时长为 1 秒的尖峰时间戳光栅图，每个神经元对应一个。尖峰由垂直刻度表示。每个神经元展示了四个不同的爆发。这些爆发是从大约 1000 秒的时间间隔内随机提取并排列显示的。AEN 单元显示出的放电特征与在类 AEN 单元中观察到的相似。实际上，客观的软件分析将 AEN 单元归为兴奋性簇，这与相应电极周围没有 GFP 阳性细胞的独立观察结果一致。相反，非 AEN 单元呈现出截然不同的放电模式，如平均 FF 值所示（在标记为 “FF” 的列中为每个细胞给出）。为了进一步量化这些观察结果，我们绘制了类 AEN 单元（半闭正方形）和非 AEN 单元（空心正方形）的 ACF（图 4A）、FSH（图 4B）和 SNTH（图 4C）。为了便于与 AEN 单元的相对值进行比较，类 AEN 单元的平均值在图 3A–E 中给出（最左边条形顶部的空心三角形）。从 AEN 和类 AEN 单元中提取的统计数据非常相似。ACF 和 FSH 值也是如此（图 3F–G）。图 4D 报告了类 AEN 簇（78 个单元；白色条形）和非 AEN 簇（20 个单元；黑色条形）的 BD、SN、FF、CV² 和 τ1/2 的平均值。尽管这些值在簇之间始终不同，但簇内的异质性可能在基于 FF 的单元分类中造成了一些不确定性。为了解决这种模糊性并阐明内在数据的分散程度，我们计算了上述统计数据的完整分布特性。图 4E–H 针对所示变量展示了所有单元的百分比累积分布（连续线）。在任何情况下都未观察到明显的双峰分布。相比之下，基于 FF 的兴奋性（半闭正方形）和抑制性（空心正方形）单元簇的分布产生了更好分离的分布。更具体地说，在 BD（图 4E）、SN（图 4F）和 τ1/2（图 4H）的情况下，两个分布有显着重叠，但在 FF（以及部分 CV²；图 4G）的情况下没有。在我们所有的实验中都发现了非常相似的结果（未展示），这表明基于 FF 的分类能够可靠地识别不同的簇。我们得出结论，在未对 GABAergic 神经元进行采样的电极中识别出的单元的生理相关统计特性，与基于 FF 分析所定义的推测兴奋性单元的特性无法区分。
04.从非 AEN 单元定义 “真正的” 抑制性神经元（AIN）的放电特性
在确定了纯 AEN 的特性后，我们从分析中排除了所有至少包含一个类 AEN 单元的记录。因此，我们也排除了同时包含类 AEN 和非 AEN 事件的多单元记录。在这些电极中，我们选择了那些显示出最多 GFP 阳性细胞的电极。我们采用了这个严格的标准，因为有研究表明自动分类程序可能会产生由同一电极中尖峰的错误分类导致的 “伪迹”。因此，我们选择了一个实验，在其中我们发现了 29 个非 AEN 单元。所有相应的电极都至少显示出 3 个 GFP 阳性细胞。此外，从显示 5–8 个 GFP 阳性细胞的 8 个电极中得到了 11 个单元，并且在其他 9 个实验中我们发现了 8 个类似的单元（所有单元的方差分析见表 1）。后面这些单元在图 5A–E 中进行了分析，使用了与图 3 所示相同的统计数据。顶部面板为每个单元展示了代表性的波形。总体而言，单元的可变性相对较低，变异系数（CV）在 0.2–0.38 范围内。平均而言，这些 AIN 单元的 BD = 1.29 ± 0.15 秒，SN = 28.2 ± 3.2，FF = 27.8 ± 1.8，CV² = 47.6 ± 3，以及 τ1/2 = 89 ± 6 秒（A–E 面板中的连续线）。为了直接比较，AEN 单元的值（虚线）从图 3 中复制过来。AEN 和 AIN 单元的统计数据相差约一个数量级。同样，为了更好地量化，我们绘制了 ACF、FSH 和 SNTH 图（图 5F–H）。AEN 单元的数据以虚线给出用于比较。非常缓慢的 ACF 衰减表明 AIN 具有长时间的活动，这与 BD 和 SN 的值一致。FSH 直方图显示，与 AEN 不同，这些细胞通常每次爆发产生的尖峰不会少于 9–10 个。分布在大约每次爆发 20–30 个尖峰处达到峰值，这与图 4B 中所示的结果一致。SNTH 图进一步表明，与 AEN 相比，AIN 倾向于表现出长时间的放电。
图 5. AIN 样单元的特征。从包含至少一个 GFP+ 细胞但不产生 AEN 样尖峰的区域的电极采样中识别出的单元的属性。上图显示分配给每个单元的尖峰的典型波形。(A–E) 分别为 BD、SN、FF、CV2 和 τ1/2 的图。这些是根据 2 小时连续记录计算得出的，这些记录包含大约 160 次爆发，针对上图显示其尖峰模板的 11 个单元中的每一个。在同一图中，直线连续线（右端有误差线）表示这些 AIN 的相应平均值。为了进行比较，虚线表示 AEN 单元的相应值，从图 3 中复制。(F) 11 个单元的 ACF 平均值（空心方块）。(G) 11 个单元的 FSH 平均值（空心方块）。(H) 11 个单位的 SNTH 平均值（空心方块；为清晰起见，仅显示一半的数据点）。为了进行比较，虚线报告从 AEN 单位计算出的相应数据，这些数据来自图 3。(I–J) 通过分析图 5 和图 3 中显示的实验中的尖峰宽度（半最大幅度）获得的累积概率直方图。空心圆：兴奋性神经元；半实心方块：抑制性神经元。(K) 图 3 和图 4 实验中使用的 98 个单位的 FF 与 IBSR 图。对于每个单位，在连续的 30 分钟片段（n = 294）中计算 3 个独立的 FF（IBSR）数据点。为了说明在总共 1.5 小时的记录时间内的数据波动，每个 30 分钟实验的三个数据点分别通过点或连续线连接起来，代表 12 个 AEN 和 AEN 不同单元（其时间戳如图 4 所示）。
05.尖峰宽度的分布对于单元分类无效
在体内，尖峰宽度分布倾向于呈现双峰模式，两条部分重叠的高斯曲线分别归因于抑制性（“窄” 尖峰）和兴奋性（“宽” 尖峰）细胞。与之前的观察结果一致，我们的数据中没有出现这样的模式。为了深入进行定量分析，我们绘制了通过软件介导的聚类得到的尖峰宽度。图 5I 和 J 分别展示了对图 5 和图 3 所示实验进行分析的结果。由于使用 FF 分组的兴奋性（空心圆）和抑制性（半填充正方形）细胞的数量不同，图 5 展示的是累积概率而不是计数分布的直方图。同样，没有观察到明显的簇分离。在其他实验（n = 8）中进行的相同分析得到了类似的结果，这表明我们的体外制备在尖峰宽度方面没有达到我们所研究的其他生理特征所观察到的细胞成熟阶段。
06.法诺因子（FF）与爆发内尖峰放电率无关
最后，为了研究 FF 是否依赖于上升状态期间典型的神经元放电率，我们为每个单元计算了爆发内尖峰放电率（IBSR）。我们研究了图 4 所示实验中的所有 98 个单元，在大约 1.5 小时的时间段内，以 30 分钟为时间片段（图 5K，小空心正方形）。大多数神经元的放电频率在 15 到 200 赫兹之间，这在生理上是合理的，并且在 FF 和 IBSR 之间未观察到相关性。此外，对于图 4 中的 12 个 AEN 和非 AEN 单元，用线连接了三个 30 分钟的数据点，以便更好地了解 FF 和 IBSR 值的典型波动（见图例）。这些结果还表明 IBSR 不适合用于单元聚类。
四、讨论
通过使用来自 GAD67-GFP 小鼠的新皮质培养物，我们在多电极阵列（MEA）记录培养皿附近定位了 γ- 氨基丁酸能（GABAergic）细胞。通过从 405 个电极收集数据，我们获得了足够数量的对真正的兴奋性神经元（AENs）或 GFP 阳性细胞进行采样的电极，从而区分了主要细胞和中间神经元的放电模式。尽管多项统计数据被证明有助于将神经元类型分配给已注册的单元，但最佳结果来自法诺因子（FF），它提供了一种相对直接的方法来区分这两类主要神经元。此外，我们的工作支持这样一种观点，即对多电极系统记录的尖峰序列进行统计分析可以提供有关神经元群体的可靠信息。尽管在体内结合光学和电生理分析具有挑战性，但我们的结果鼓励进一步开展此类研究，旨在剖析特定标记的神经元亚型。
01. 体内和体外单元与神经元类型的分配
在体内海马体中，研究人员（2000）比较了细胞外四极管电极和细胞内记录的结果。他们发现，通过分析细胞外尖峰波形可以推断出许多细胞内参数。在另一篇相关论文中，研究人员（2000）深入分析了单元识别中尖峰聚类的可能误差来源。他们指出，严格的单元分类应依赖自动尖峰分类算法，而非人工选择。最近，研究人员（2004）将多单元记录扩展到了体感皮层。他们使用自相关图分离了 V 层的单元，并展示了如何利用互相关图揭示短潜伏期突触连接，从而基于突触效应区分锥体细胞和中间神经元。然而，总体而言，区分细胞类型仍然困难，尤其是在新皮质中，快速放电并不一定代表中间神经元。基于生理和形态特性的聚类分析可识别出多种抑制性细胞类群。此外，尽管体内实验保留了整体电路，但尚不清楚深度麻醉如何改变神经元放电和单元分类。
一种互补方法是在长期新皮质培养物上应用 MEA 记录。这允许通过不同标记方法相对直接地识别特定神经元类型。此外，在稳态下，神经元类型之间的平衡和总体放电统计与体内观察到的情况相似。更具体地说，培养网络的互相关图特性（表明短潜伏期突触连接的程度）与睡眠大鼠和人类中观察到的结果相似。通过将单元聚类为推测的兴奋性和抑制性神经元群体后，利用时间直方图可以剖析循环网络活动的上升状态结构。这种聚类与免疫染色获得的数据非常吻合，尽管它仍无法对单元进行明确的兴奋性或抑制性分类。为了进一步验证这些证据，我们深入研究了通过 GFP 荧光识别的神经元类型的统计特性。尽管我们发现 AENs 和 AINs 的单个单元特性存在较大数据离散，但它们的爆发持续时间（BD）、尖峰数量（SN）、法诺因子（FF）、变异系数平方（CV²）和自相关函数半衰期（τ1/2）的平均值差异显著，错误分类的概率可忽略不计（p <10^(-6)）。通过排除异常值，这一概率进一步降低。例如，图 3C 显示，12 个单元的 FF 范围为 1 至 6，但在基于软件的异常值排除后，兴奋性细胞的平均 FF 为 3.8 ± 0.3，抑制性细胞为 14.9 ± 1.6。我们的分析程序可根据用户定义的约束条件工作，因此始终可以舍弃位于适当马氏距离之外的单元。由于尖峰分类通常基于逐个电极分析（基于主成分分析或其他波形特性），我们建议 MEA 相关软件的开发者引入计算本文分析参数的功能。这将极大帮助用户决定如何分配同一电极采样且主成分分析分离不足的单元。目前，这些分配缺乏严格的统计工具支持，而我们认为 FF 是区分兴奋性和抑制性神经元的特别理想的参数。与我们的结果一致，最近研究发现，在猴子前额叶皮层中，快速放电和规则放电神经元的 FF 值存在显著差异。
02. 对未来研究的意义
众所周知，将中枢神经系统（CNS）神经元粗略分为兴奋性和抑制性群体是一种简化的分类方式。因此，图 3 和图 5 表明，在主要单元簇内，有充分的可能性定义亚簇。通过标记特定神经元亚型，这些进一步分类值得深入研究。总体而言，尚不清楚通过放电统计区分的单元组是否归因于不同的神经元类型（即具有不同的内在兴奋性），或仅仅反映了相似神经元的不同突触连接。无论如何，我们的数据表明，兴奋性神经元之间的放电异质性更为广泛。然而，GABAergic 中间神经元众所周知包含许多由基因表达和免疫标记定义的亚类。因此，我们的观察似乎更支持这样的观点：放电异质性更多与神经元连接有关，而非内在的神经元变异性。进一步表征这些神经元群体的一个有希望的方法是研究尖峰与局部场电位（LFP）的相关性。在时域中，最近使用 64 电极平台获得的结果表明，时间异质性可稳定持续数小时。然而，在定义单元 / 神经元亚型时实现统计显著性的主要障碍是在给定实验记录中获得足够数量的每个类别的神经元。只有大规模 MEA 平台才能收集足够多的单元数据，以确定时空域中此类异质性的细节。我们使用 256 电极 MEA 进行的初步实验表明，相距约 2 毫米的电极之间的上升状态往往不会同时发生，这与癫痫研究中的体内结果一致。使用数百个电极进行记录应能很快减少研究特定 CNS 区域特性所需的实验总数。
最后，图 5I–J 表明，部分抑制性和兴奋性神经元的尖峰宽度存在明显差异，因此总体模式与成年神经元中观察到的相似。然而，在未成熟网络中，中间尖峰持续时间的神经元类群分离似乎不如后期阶段有效。因此，我们的结果还表明，我们提出的判别方法可能在新皮质完全成熟前特别有助于区分主要细胞和 GABAergic 细胞。这将极大促进对发育中大脑多单元记录结果的解释。这一方面对于理解具有显著发育成分的神经疾病（如特发性癫痫）的发病机制具有潜在重要意义。
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