Held 氏壶腹是一种谷氨酸能轴体突触终末，其生物物理学特性已得到了充分的研究。它有许多释放位点，使其能够在听觉脑干中充当倒转中继突触，可靠地驱动其突触后伙伴，即斜方体内侧核（MNTB）中的主神经元，即使在放电频率大于 200 赫兹的情况下也是如此。在其形成后不久，大约在啮齿动物出生后第 2 天（P2）左右，它在体内就已经以特征性的高频爆发形式放电。在脑片研究中，已经观察到了较大的去极化后电位（DAP），其中再生钠电流起了重要作用，并且这可能促进了高频放电。除了小脑苔藓纤维终末之外，对哺乳动物突触前终末生物物理学特性的研究都是在体外进行的，而目前对于后电位的功能意义，包括它们在自然放电模式中的作用，在很大程度上仍然未知。在这里，我们对大鼠幼崽的 Held 氏壶腹进行了体内近细胞和全细胞记录，并研究了后电位在自然放电模式下对突触前动作电位稳定性的贡献。
一、结果
01. 体内 Held 氏壶腹的鉴定
为了研究在生理放电过程中动作电位衰减的作用，我们对 2 至 8 日龄的大鼠幼崽的 Held 氏壶腹进行了盲法近细胞和全细胞记录。几条相互印证的证据表明，我们确实记录到了听觉脑干中的巨大终末——Held 氏壶腹。首先，通过生物胞素填充和随后的组织学处理，确认了几个 Held 氏壶腹的身份（图 1A；n = 6），显示出 Held 氏壶腹典型的杯状形态（影片 S1）以及一根通常可以追溯到中线和 MNTB 同侧其他听觉核团的轴突。其次，与之前在脑片上对 Held 氏壶腹的记录一致，终末在电流注入开始时对恒定电流注入的反应是产生一个单一、短暂且超射的动作电位、强烈的外向整流以及超极化激活的去极化电压下陷（图 1B 和图 S1）。第三，在一些记录中，Held 氏壶腹的动作电位之后会出现一个小的偏转，这很可能反映了突触后动作电位（图 1C 中的箭头）。第四，终末表现出一种特征性的放电模式，由高频的小爆发组成（图 1D）。其间隔分布与这个年龄段的听神经活动相似（图 S2），这与它由耳蜗产生的情况相一致。与体内突触后记录不同的是，在电压钳模式下没有观察到快速的突触瞬变（图 1E），这与不存在轴-轴输入的情况相符。因此，我们记录的结构极有可能是 Held 氏壶腹。
图 1. 建立对 Held 氏壶腹的体内记录。（A）P6 大鼠腹侧脑干的冠状切片，包含 MNTB（轮廓所示），用抗生物胞素（绿色）、抗囊泡谷氨酸转运体 1 和 2（橙色）以及核苷酸染色剂 Sytox Blue 标记。中线位于左侧，腹侧位于底部。（B）对一个 Held 氏壶腹的体内全细胞记录（左侧）；在恒定电流注入时（顶部），终末表现出去极化下陷、强烈的外向整流以及一个单一的动作电位（底部）。蓝色轨迹表示引发动作电位的电流阈值。串联电阻进行了离线补偿。（C）在一些记录中，诱发的和自发的动作电位之后会出现一个峰后电位（箭头），这表明存在一个类似于在突触后记录中可以记录到的峰前电位的突触后动作电位。（D）在电压钳记录中，可以记录到自发活动的时期（顶部），这些时期由小爆发组成（底部）。顶部记录中电流幅度约 2 赫兹的振荡是由呼吸引起的。（E）图 D 的放大图显示了两个峰后电位（箭头），并且没有突触电流。对于图 D 和图 E，指令电位为 -80 mV；串联电阻（36 MΩ）未进行补偿。
图 S1. 体内全细胞记录过程中 Held 氏壶腹主动和被动特性的发育变化。（A，顶部）恒定电流注入的示例轨迹描绘了电压下陷和外向整流。轨迹用双指数函数进行拟合（绿色虚线）。（底部）在电流注入结束时获得拟合的稳态值（绿色圆圈）或记录值（黑色圆圈），并针对电流幅度进行绘图。通过线性拟合得到斜率电阻（虚线）。（B）自发动作电位（底部）和由恒定电流注入诱发的动作电位（顶部）的示例。（C）串联电阻与幼崽年龄的关系。串联电阻按照参考文献 22 中描述的方法从电压钳记录（未显示）中计算得出。（D）瞬时斜率电阻（图 A 中的绿色虚线）与幼崽年龄的关系。（E）由超极化电流注入计算得到的斜率电阻（图 A 中的黑色虚线）与幼崽年龄的关系。（F）由去极化电流注入计算得到的斜率电阻（图 A 中的蓝色虚线）与幼崽年龄的关系。外向整流极大地降低了斜率电阻。（G）诱发的（黑色圆圈）和自发的动作电位（蓝色菱形）的最大上升速率与幼崽年龄的关系（图 B 中的标记）。（H）诱发的（黑色圆圈）和自发的动作电位（蓝色菱形）的最大复极化/下降速率与幼崽年龄的关系。（I）诱发的（黑色圆圈）和自发的动作电位（蓝色菱形）的动作电位半宽度与幼崽年龄的关系。（J）自发动作电位的 Vafter 与幼崽年龄的关系。数据点表示 Held 氏壶腹。图 G 至图 I 中的线条连接了从同一个 Held 氏壶腹记录到的自发动作电位（蓝色菱形）和诱发动作电位（黑色圆圈）。
图 S2. 对 Held 氏壶腹进行体内近细胞记录时自发放电的偏好频率。（A）上半部分显示了按幼崽年龄分组的单个近细胞记录的概率密度图（灰度）。下半部分在半对数图上显示了不同幼崽年龄下的平均概率密度与峰间间隔（ISI）的关系。（B）平均和最小小爆发间隔（即间隔 < 40 ms）与幼崽年龄的关系。（C）最大瞬时频率与幼崽年龄的关系。（D）估计为动作电位峰-峰间隔的动作电位半宽度与幼崽年龄的关系。对于图 B 至图 D，圆圈代表单个近细胞记录的 Held 氏壶腹。
在新生的最初几天里，终末呈现出杯状形态。伴随着这种结构发育，其生物物理学特性发生了一些发育变化，包括静息膜电阻的发育性降低和外向整流的显著增加、最大上升速率增加的发育趋势、复极化速率的增加以及动作电位半宽度的明显缩短（图 S1）。由短暂电流注入诱发的动作电位也表现出类似的发育变化。这些发育变化加快了终末的动作电位，使其能够以更短的间隔进行放电。令人惊讶的是，即使是 P2-P3 阶段的 Held 氏壶腹也能以超过 150 赫兹的频率自发放电且没有明显的失败情况（n = 3，在全细胞和近细胞模式下分别记录了 4 个 Held 氏壶腹），这表明它在形成后不久就已经具备了高频放电的能力。
东莞市富临塑胶原料有限公司是 Microprobes 在中国的代理商，富临塑胶为中国客户提供 金属微电极、多通道阵列、外周电极和技术协助。
02. 体内对动作电位衰减的抗性
在高频放电期间，无论是在全细胞记录还是近细胞记录中，突触前动作电位的形状都保持得非常稳定（图 2A 和 B）。图 2C 显示了在一个代表性的全细胞记录中，动作电位的最大上升速率与动作电位间隔的函数关系。虽然在体内最短间隔时突触后体细胞动作电位通常会衰减超过 40% ，但在全细胞记录中，对于间隔小于 5 毫秒的情况，Held 氏壶腹的动作电位平均仅衰减 4%（0.96 ± 0.03；平均值 ± 标准差；n = 9 个 Held 氏壶腹；图 2C 和 D）。在近细胞记录中也得到了类似的数值（0.977 ± 0.004；平均值 ± 标准差；n = 18 个 Held 氏壶腹；图 2D），这表明这一发现既不是冲洗的结果，也不是串联电阻相关的电容滤波的结果。此外，在一个小爆发内，第三个动作电位的最大上升速率与第一个动作电位相似（时间间隔：21 ± 2 毫秒；AP3/AP1 比值：1.02 ± 0.01；平均值 ± 标准差；n = 9 个 Held 氏壶腹），考虑到高频放电频率和动物的幼小年龄，这显示出了显著的稳定性。此外，在高频爆发之后，定义为在 -35 mV 时的动作电位宽度的半宽度仅增加了 4 ± 1%（平均值 ± 标准误；n = 9；图 2D 和图 S3）。在近细胞记录中，动作电位半宽度最好用正峰和负峰之间的延迟来表示，同样，在近细胞模式下，这个延迟增加了 4.0 ± 0.7%（平均值 ± 标准误；n = 18；图 2D）。半宽度的变化与动作电位的衰减相关（r = -0.55；n = 27；图 S3）。我们得出结论，突触前动作电位的形状在高频活动期间几乎没有变化。
图 2. 体内放电时动作电位几乎无衰减。（A，左侧）体内全细胞记录（WC）显示了 Held 氏壶腹爆发活动的时期。（中间）高频小爆发。（右侧）四个动作电位的叠加图。（B）体内近细胞记录（近细胞）显示出与 A 中类似的活动，并且显示了五个细胞外动作电位（eAPs）的叠加图（右侧）。（C）来自单个全细胞记录的动作电位最大上升速率与动作电位间隔的关系。（插图）相对于前一个动作电位的最大上升速率与动作电位间隔的关系表明，在短间隔时存在一个小但明显的衰减。计算灰色区域内间隔的平均值以便在记录之间进行比较。（D，左侧）间隔小于 5 毫秒时的相对幅度显示出较小的衰减。对于全细胞记录，显示的是动作电位上升速率的相对变化；对于近细胞记录，显示的是细胞外动作电位幅度的相对变化。（右侧）间隔小于 5 毫秒时动作电位半宽度的变化。（E，顶部）持续 20 秒的恒定电流注入伴随着自发放电爆发。恒定电流注入从 -120 皮安（最下方的轨迹）开始，每次增加 60 皮安（以蓝色阴影表示）。（底部）动作电位最大上升速率与起始电位的关系。橙色 – 绿色相连的圆圈对对应于一对动作电位，其中第一个动作电位（AP1）在 300 毫秒内没有前一个动作电位（绿色），第二个动作电位（AP2）在 20 毫秒内跟随 AP1（橙色）。（F）E 中第二个动作电位的相对上升速率与 AP1 的起始电位的关系。红色虚线表示线性拟合。与黑色虚线（AP2/AP1 等于 1 的位置）的交点在 -64.9 毫伏处。（G）稳定电位（Vstab）与静息膜电位（RMP）的关系。线性相关性不显著 [r = 0.5；F(1,7) = 2.8；P = 0.14]。C 和 E 中的圆圈表示动作电位。D 和 G 中的空心标记表示记录的 Held 氏壶腹；实心标记对应平均值。F 中的圆圈表示动作电位对。条形表示标准差。
图 S3. 高频放电期间动作电位半宽度的调节最小。（A）在对 P5 期 Held 氏壶腹的全细胞记录中，动作电位半宽度与动作电位间隔的关系。（插图）相对于前一个动作电位的动作电位半宽度与动作电位间隔的关系。（B）动作电位半宽度的相对大小与近细胞记录的细胞外动作电位幅度（菱形）或全细胞记录的动作电位上升速率（圆圈）的关系。直线表示回归线 [r = -0.55；t(23) = 2.9；P = 0.004]。
接下来，我们研究了哪些机制导致了突触前动作电位形状的显著稳定性。在短间隔时，动作电位后的膜电位 Vafter 将决定下一个动作电位的起始电位。为了了解 Vafter 如何影响下一个动作电位的上升速率，我们比较了在长时间去极化或超极化电流注入期间的连续动作电位对。有趣的是，如果 Held 氏壶腹的膜电位被超极化，第二个动作电位将在比第一个动作电位更去极化的电位下开始，并且相对衰减；相反，如果第一个动作电位在去极化电位下开始，第二个动作电位将在更超极化的电位下开始，并且与第一个动作电位相比会增强（图 2E）。为了找到衰减转变为增强的电位，将第二个动作电位上升速率的相对变化与第一个动作电位的起始电位作图（图 2F）。通过线性回归得到动作电位大小稳定时的电位。这个稳定电位 Vstab 接近静息膜电位（RMP）（图 2G），这表明当 Vafter 接近 RMP 时，动作电位在高频放电期间其上升速率的变化最小。我们无法确定动作电位半宽度的 Vstab，因为半宽度的调节并不随起始电位呈线性变化，这可能是由于其他电压依赖性离子通道的失活。尽管如此，半宽度的调节范围有限（0.95 – 1.05）。因此，从我们的体内测量结果可以得出结论，如果动作电位之间的膜电位接近 RMP，动作电位波形在高频放电期间将保持稳定。
在脑片研究中，Held 氏壶腹的动作电位通常之后会出现 3 至 12 毫伏的去极化后电位（DAP），然而在体内，我们在 17 次记录中的 7 次观察到了超极化后电位（HAP）（图 3A，插图）。后电位在发育过程中没有变化（r = -0.1；n = 17 个 Held 氏壶腹）；它确实取决于 RMP，后电位的方向在 -71.3 ± 0.8 毫伏处反转（r = -0.88；n = 17 个 Held 氏壶腹；图 3A）。为了分析当动作电位从不同膜电位开始时 Vafter 如何变化，我们再次观察长时间的恒定电流注入。在动作电位峰值后 1.8 毫秒测量的 Vafter，在所有动作电位从 -75 毫伏或更负电位开始的记录中，似乎在很大程度上与动作电位的起始电位无关（图 3A），而在电位比 -70 毫伏更正时，Vafter 随着动作电位起始电位每变化 1 毫伏而以 +0.58 ± 0.03 毫伏去极化（平均值 ± 标准误；n = 5 个 Held 氏壶腹；图 S4）。我们不再关注动作电位前后膜电位的差异，而是关注动作电位后的膜电位绝对值（Vafter），这对于下一个动作电位的影响更为重要。
图 3. 在体内高频放电期间，动作电位之间的膜电位接近动作电位稳定的电位。（A）由于恒定电流注入而具有不同起始电位的五个自发的、峰值对齐的动作电位。在后电位在动作电位峰值后 1.8 毫秒处测量（箭头）。（插图）后电位幅度与静息膜电位（RMP）的关系。圆圈颜色表示幼崽年龄；黑色、蓝色、绿色、品红色和橙色分别表示 <P4、P4、P5、P6、>P6。（B，顶部）一个带有超极化后电位的高频爆发，以及增强的动作电位幅度（插图）。（底部）Vafter 与起始电位（Vstart）的关系。灰色圆圈表示一个动作电位；绿色 – 橙色成对的圆圈对应于一对连续的动作电位，其中第一个动作电位在 300 毫秒内没有前一个动作电位（绿色），第二个动作电位在 20 毫秒内跟随第一个动作电位（橙色）。箭头表示每对动作电位中 Vafter – Vstart 的变化。（C）稳定电位 Vstab 与后电位 Vafter 的关系。虚线表示线性拟合 [r = 0.7；F(1,7) = 6.6；P = 0.04]。这种相关性表明 Vafter 和 Vstab 是匹配的。对于 A 和 C，每个圆圈对应一个不同的 Held 氏壶腹。
图 S4. Vafter 随恒定电流注入和爆发活动而变化。（A）在长时间恒定电流注入期间，Vafter 与自发动作电位起始电位的关系。绿色 – 橙色圆圈对对应于一对动作电位，其中第一个动作电位（绿色）在 300 毫秒内没有前一个动作电位，第二个动作电位（橙色）在 20 毫秒内跟随第一个动作电位。虚线表示恒等线。在高频放电期间，Vafter 主导后续动作电位的起始电位。（B）动作电位起始电位与 Vafter 关系的模型图。对于超极化起始电位，Vafter 将达到一个恒定的膜电位（此处为 -71.3 毫伏）。在去极化电位时，后电位以每毫伏 +0.58 毫伏去极化，可能是由于像 Kv1 这样的钾通道失活来对抗去极化（图 S5）。（C）上半部分显示了一个活动期的示例，在此期间后电位（品红色圆圈）在爆发期间去极化。（校准条：2 毫伏，0.2 秒。）下半部分，在单个 P6 记录的活动期内，后电位与动作电位相对位置的关系。蓝色线表示 RMP。在活动期间，后电位去极化，从而从超极化后电位转变为去极化后电位。（D）在活动期内后电位的相对变化与跨记录的动作电位相对位置的关系。
在爆发活动期间，Vafter 成为下一个动作电位的起始电位，因此这可能使爆发期间的起始电位保持稳定。实际上，在高频放电时，一个动作电位的起始电位与其前一个动作电位的 Vafter 重叠（图 3B），并且当后电位是超极化时，下一个动作电位可以增强（图 3B）。此外，Vafter 接近 Vstab（图 3C）。在活动增加的时期，Vafter 变得更加去极化，并且后电位可以从超极化转变为去极化（图 S4）。平均而言，在活动期内后电位去极化 1.7 ± 0.2 毫伏 [平均值 ± 标准误；n = 9 个 Held 氏壶腹；配对 t 检验 AP1 与 AP15：t(8) = 8.5，P < 0.01]，尽管这种变化在统计学上是显著的，但起始电位如此小的去极化只会对动作电位特性产生极小的影响（图 2E）。考虑到在活动期内后电位变化较小，我们得出结论，Vafter 提供了一个稳定的动作电位起始电位，其值使动作电位波形保持不变。
03. 脑片中对动作电位衰减的抗性
我们体内记录的两个局限性是与高串联电阻相关的低通滤波以及无法系统地测试不同的传入活动模式。因此，我们也在急性脑干脑片中进行了 Held 氏壶腹记录。通过放置在中线处的双极刺激电极刺激传入纤维。通过这种方法，我们测试了在超过体内观察到的频率（>400 赫兹）时，动作电位衰减是否会更明显。在生理温度下，Held 氏壶腹能够在这些频率下放电，并且在 2 至 3 毫秒的间隔时，动作电位上升速率衰减至 0.88 ± 0.02（平均值 ± 标准误；n = 17；年龄，P4 – P9）。在 17 个终末中的 16 个中，我们可以确定 Vstab（-70 ± 1 毫伏；平均值 ± 标准误）和 Vafter（-71 ± 1 毫伏；平均值 ± 标准误）。这两个值再次紧密匹配（r = 0.9；图 S5）。在 2 毫摩尔每升的钙离子浓度下，Vafter 没有变化 [n = 6；ΔV = 0.3 ± 0.8，t(5) = 0.9，P = 0.8；图 S6]，这表明钙通道或钙激活通道在设定 Vafter 方面的作用有限。此外，未发现 XE991（10 微摩尔每升）对后电位有影响 [n = 5；ΔV = -0.6 ± 0.7，t(5) = 0.1，P = 0.5；图 S6]，这表明 Kv7 通道对后电位的最初几毫秒没有显著贡献。最后，我们量化了在具有不同动作电位间隔（2 – 100 毫秒）的动作电位序列期间动作电位形状的稳定性。序列中的第一个动作电位的波形与其他动作电位不同（图 S7）。第一个动作电位对电流注入敏感（r = -0.95），而第二个到第五个动作电位没有变化（r 的范围为 -0.4 – 0.2；图 S7），这再次表明后电位稳定了 Held 氏壶腹的动作电位形状。
图 S5. 脑片记录中动作电位稳定电位 Vstab 与 Vafter 相关。（A）在恒定电流注入期间，在中线处刺激 Held 氏壶腹轴突以引发间隔为 3 毫秒的成对动作电位。来自 P5 期 Held 氏壶腹的动作电位以第一个动作电位的峰值对齐。刺激伪迹已减去。（B）动作电位最大上升速率与起始电位的关系。成对动作电位用绿色 – 橙色圆圈表示，并用箭头连接。箭头方向反转，表明存在一个稳定电位。此外，请注意由于起始电位改变导致的动作电位的稳态衰减。（C）Vafter 与起始电位之间的关系。对于起始膜电位小于 -70 毫伏的情况，Vafter 相对恒定。虚线是恒等线。（D）成对动作电位的相对动作电位上升速率与第一个动作电位的起始电位的关系。红色虚线表示接近 1 的数据点的线性拟合。（E）Vstab 与 Vafter 之间的关系。红色虚线表示回归线（r = 0.9）。
图 S6. 后电位与钙浓度或 Kv7 通道无关。（A）显示了在细胞外钙浓度为 1.2 毫摩尔每升（标准浓度；黑色）或 2 毫摩尔每升（蓝色）时记录的 P8 期 Held 氏壶腹的 25 个动作电位的平均值。（B）在将细胞外介质替换为 2 毫摩尔每升 Ca²⁺ 细胞外介质的实验期间的起始电位（Vstart；品红色）和 Vafter（绿色）。在大约 t = 3 分钟时，新介质进入浴槽。阴影区域表示 Held 氏壶腹暴露于新细胞外介质的预期时间段。每个圆圈代表单个动作电位。A 中显示的动作电位来自同一记录。（C）显示了在添加 10 微摩尔每升 XE991 之前（“ctrl”）和之后记录的 P5 期 Held 氏壶腹的 25 个动作电位的平均值。（D）与 B 类似，但针对 Kv7 阻断剂 XE991。B 中显示的动作电位属于同一实验。（E）不同药理学实验的汇总散点图。相连的圆圈来自单个记录。未观察到较高的细胞外钙浓度对 Vstart 或 Vafter 有显著影响。XE991 对 Vafter 没有显著影响，但观察到 Vstart 有去极化的趋势 [ΔV = 2.2 ± 0.9；t(5) = 1.7，P = 0.07]，如参考文献所述。
图 S7. 高频序列在第一个动作电位之后保持稳定。（A）在 P7 期脑片中通过中线电刺激以不同间隔引发的示例动作电位序列。动作电位特性显示在 B 和 C 中。刺激伪迹已减去。（校准条：100 毫伏，2 毫秒。）（B）动作电位上升速率与动作电位在序列中的序号的关系。仅从第一个到第二个动作电位观察到明显变化。（C）动作电位半宽度与动作电位在序列中的序号的关系。（D）在恒定电流注入以偏置起始电位期间，P6 期 Held 氏壶腹的动作电位上升速率与动作电位序号的关系。第一个动作电位的起始电位用颜色编码。插图显示了动作电位上升速率与动作电位 #1 的起始电位的关系。实心圆圈表示动作电位序列中的第一个动作电位（AP #1），空心圆圈表示动作电位序列中的第二个动作电位（AP #2）。虽然 AP #1 的上升速率与偏置起始电位密切相关（r = -0.95），但 AP #2 并非如此（r = 0.2）。（E）与 D 相同，但针对动作电位半宽度。
在爆发活动期间，后电位通过失活恢复的时间依赖性以及下一个动作电位的稳态通道可用性来影响动作电位衰减。为了区分这两种效应，我们对动作电位衰减进行了建模（补充信息材料与方法）。首先，我们通过电流注入测量了作为起始电位函数的稳态衰减。这些记录表明，动作电位在静息膜电位（RMP）时略有衰减（Vhalf：-54.8 ± 2.6 毫伏；k：7.0 ± 0.9 毫伏；n = 14；平均值 ± 标准误）。然后，我们使用稳态衰减来预测由刺激序列引起的衰减，该刺激序列由多个间隔组成，代表类似体内的活动，并额外包含 2 至 3 毫秒的间隔（图 S8A）。稳态值无法捕捉到最短间隔时的衰减（一个自由参数，解释方差：60 ± 5%；n = 14；平均值 ± 标准误；图 S8C）。加入衰减恢复，其中包括如参考文献 33 中所述的电压依赖性时间常数，改善了预测（两个自由参数，解释方差：86 ± 2%；n = 14；平均值 ± 标准误；图 S8D），这表明在最短的峰间间隔时未达到稳态恢复。达到与下一个动作电位起始电位相关的稳态的 96% 和 98% 的衰减恢复分别需要 2.8 ± 0.2 毫秒和 3.5 ± 0.2 毫秒（平均值 ± 标准误；n = 14；图 S8B），这表明在体内观察到的间隔足够长，足以使恢复达到稳态。最后，我们通过使用在每个实验中观察到的间隔和起始电位，测试了具有平均值的模型在多大程度上可以预测体内的衰减。对于大于 P4 期的动物，预测的衰减与观察到的衰减吻合良好（n = 6；r = 0.9），而对于 P3 – P4 期，该模型低估了体内的衰减（-0.16 ± 0.2；n = 3；平均值 ± 标准误；图 S8E）。总之，这些发现表明，在 P5 期，衰减的快速恢复使 Held 氏壶腹能够在高频放电时几乎没有或完全没有动作电位衰减。
图 S8. 结合类似体内的活动模式与建模来分析后电位对动作电位衰减的影响。（A）由一系列随机顺序的频率组成的刺激模式。该模式用于刺激 Held 氏壶腹的传入轴突，以在广泛的不同频率下引发动作电位放电。（B）动作电位之后预期的相对衰减作为 Vafter（颜色）的函数。对于该图，假设先前的动作电位没有残留衰减，并且静息膜电位（RMP）为 -70 毫伏。动作电位导致衰减（d）。衰减恢复在延迟后开始，在这种情况下延迟为 0.45 毫秒，因为动作电位首先需要复极化。恢复的时间常数以及稳态衰减均取决于 Vafter（补充信息材料与方法）。请注意，如果后电位接近 RMP，恢复将在 5 毫秒内完成。此外，超极化后电位将加速恢复，甚至可能将相对衰减转变为相对增强，正如在体内确实观察到的那样。（C）记录的动作电位上升速率由完整的动作电位衰减模型（恢复加稳态）或其简化形式（仅稳态或仅恢复；补充信息材料与方法）进行拟合。显示了由不同模型拟合的单个记录的结果。左侧面板显示了动作电位上升速率与峰间间隔的关系（记录值，灰色圆圈；模型预测值，蓝色叉号），并且记录值与预测值之间的差异显示在顶部（黑色圆点）。在右侧面板中，显示了同一数据集的动作电位上升速率与起始电位（Vstart）之间的关系。仅包括衰减恢复的模型（解释方差：45%）显示残差相对于 Vstart 存在偏差。另一方面，仅包括稳态的模型（解释方差，87%）在最短的峰间间隔时显示残差存在偏差。组合模型很好地描述了数据（解释方差，97%）。（D）不同的嵌套模型的解释方差，表明稳态以及衰减恢复对模型都有显著贡献。（E）基于平均模型拟合参数、体内记录的峰间间隔以及体内记录的起始电位，预测了衰减量并对间隔（<5 毫秒）进行了平均。显示了预测的衰减与体内观察到的衰减的关系。虚线是恒等线。空心圆圈表示 >P4 期；实心黑色圆圈表示 P3 期；实心蓝色圆圈表示 P4 期。
04. Held 氏壶腹终末中 Nav1.6 的存在
新生 Held 氏壶腹能够高频放电且几乎无衰减的能力表明，它在形成后不久就已经表达了钠通道 1.6（Nav1.6）（23, 33）。用 Nav1.6 抗体对不同出生后年龄的脑干切片进行免疫标记。在 P2 – P3 期，在整个腹侧听觉脑干中就已经观察到了微弱的表达。免疫标记显示与囊泡谷氨酸转运体 1/2 的标记有重叠，但与锚蛋白 G 无重叠（图 4）。在这个发育阶段未获得存在半结的证据。为了确认 Nav1.6 在突触前的存在，我们在体内用电穿孔法将荧光染料导入 Held 氏壶腹轴突，以标记产生终末的轴突，然后再次对这些终末进行 Nav1.6 和锚蛋白 G 的染色。Nav1.6 信号与电穿孔的轴突共定位；未观察到半结（图 S9）。令人惊讶的是，Nav1.6 的强度在终末本身中最高（图 S9B），这与之前的报道不同（33），这可能与早期发育阶段有关，在这个阶段半结尚未形成（34, 35）。我们得出结论，Nav1.6 在 Held 氏壶腹形成后不久就已经存在于其中。
图 4. 出生后发育过程中钠通道 1.6 的突触前免疫标记。对 MNTB（P3、P7 和 P15 大鼠）进行免疫标记，标记物为锚蛋白 G、钠通道 1.6（Nav1.6）和囊泡谷氨酸转运体 1/2（VGluT1/2），共聚焦图像显示最强的 Nav1.6 标记与突触前 VGluT1/2 共定位（箭头）。锚蛋白 G 抗体标记轴突起始段（*）、郎飞氏结（#）和半结。基于这组抗体无法明确区分半结和郎飞氏结。
图 S9. Held 氏壶腹中钠通道 1.6（Nav1.6）的免疫标记。（A）P5 大鼠 MNTB 的囊泡谷氨酸转运体 1/2（VGluT1/2）（一种突触前标记物）和 Nav1.6 免疫标记。下面面板中的数字指的是 B 中显示的线扫描图。（B）突触前标记物 VGluT1/2（绿色）和钠通道 1.6（橙色）的免疫标记线扫描图。黑色条表示突触后神经元。Nav1.6 强度的峰值与 VGluT1/2 共定位，或者比 VGluT1/2 的峰值更远离突触后神经元。（C）在体内对 Held 氏壶腹轴突进行电穿孔，然后进行 Nav1.6 标记。[比例尺：（A）中为 25 微米，（C）中为 10 微米。]
05. 手术
所有实验均符合我们研究所内实验动物的伦理准则以及欧洲的相关准则，并得到了伊拉斯姆斯医学中心动物伦理委员会的批准。手术程序在参考文献 22 和 51 中有详细描述。
01. 体内电生理学和电穿孔
电生理学方法的详细信息已在参考文献 22 中提供。简而言之，使用 Axopatch 200B（Molecular Devices）在 -80 毫伏的电压钳模式或电流钳快速模式下进行全细胞记录。信号在 10 千赫兹（四极贝塞尔）下进行低通滤波，由 A/D 转换器（Digidata 1220A；Molecular Devices）以 25 千赫兹进行数字化，并使用在 Windows XP 计算机上运行的 Clampex 10.2（Molecular Devices）进行采集。基于葡萄糖酸钾的 pipette 内溶液包含以下成分（毫摩尔每升）：126 葡萄糖酸钾、20 氯化钾、0.5 乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸、10 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10 磷酸肌酸钠、4 三磷酸腺苷镁、0.4 三磷酸鸟苷二钠，用氢氧化钾将 pH 调节至 7.2；在一些记录中，向 pipette 内溶液中添加 2 毫克每毫升的生物胞素。在形成千兆封接之前补偿 -11 毫伏的连接电位。本文中报告的所有电位均已针对连接电位进行了校正。通过定期用以下溶液（毫摩尔每升）冲洗和浸没颅骨切开处来防止其脱水：135 氯化钠、5.4 氯化钾、1 氯化镁、1.8 氯化钙、5 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，用氢氧化钠将 pH 调节至 7.2。在细胞贴附模式下补偿杂散电容，并且在获得全细胞配置后，通过从 -70 毫伏到 -75 毫伏的 500 毫秒、5 毫伏的步阶在电压钳模式下测量串联电阻（图 S1），但不补偿串联电阻。每次记录会话都从短暂的 500 毫秒电流注入开始，以记录 Held 氏壶腹的内在特性。还进行了长时间的 20 秒电流注入，以通过其起始电位评估动作电位特性的变化。还记录了无电流注入时的自发活动，以观察自然放电期间的生理动作电位。在少数记录（n = 6）中，在 -80 毫伏下进行电压钳记录且不补偿串联电阻。这些记录通常显示出由侵入的动作电位引起的强烈内向电流，这些电流逃脱了电压钳的控制。
由于高串联电阻和高分布的 pipette 电容的组合，pipette 的时间常数接近 Held 氏壶腹的时间常数，这限制了使用膜片钳放大器进行最佳补偿。因此，体内的动作电位动力学进行了低通滤波。为了评估这种滤波效应的影响，我们在具有低串联电阻的脑片记录中比较了最佳补偿记录和补偿不足的记录。尽管动作电位确实显示出更快的膜电位变化，但在高频放电时观察到的相对衰减量没有变化。
体内电穿孔按照所述进行。将尖端开口为 15 – 20 微米的破损玻璃 pipette 填充 Alexa Fluor 594 – 葡聚糖染料（在 0.5 摩尔每升氯化钠中为 10%），并降低到基底动脉背侧 100 – 150 微米的深度。通过定制的 pipette 支架以 2 赫兹的频率施加 0.3 微安、250 毫秒的脉冲进行电穿孔，持续 5 – 10 分钟。让染料在轴突内扩散 1 – 2 小时，然后按照参考文献 22 中所述对动物进行心脏灌注，以便随后进行免疫标记。
02. 脑干脑片和脑片电生理学
如参考文献 3 中所述，从出生后 4 至 9 天的新生大鼠制备脑干脑片。对于脑片记录，在细胞内 pipette 溶液中添加 10 – 20 微摩尔每升的荧光染料，以便在记录结束时验证所记录的结构。记录在生理温度（35 – 36 摄氏度，在脑片附近测量）下进行。细胞外溶液包含以下成分（毫摩尔每升）：125 氯化钠、2.5 氯化钾、1.25 磷酸二氢钠、3 肌醇、2 丙酮酸钠、25 葡萄糖、25 碳酸氢钠、0.4 L-抗坏血酸、1 硫酸镁和 1.2 氯化钙。在少数记录中，将氯化钙浓度增加到 2 毫摩尔每升，或者向细胞外溶液中添加 XE991（10 微摩尔每升）。细胞外溶液用混合气体（95% 氧气，5% 二氧化碳）鼓泡，并通过在线加热器以（2 – 3 毫升每分钟）的速度泵入记录室。在接近 Held 氏壶腹之前，我们一直等到浴槽温度稳定下来。记录在动物死后 7 小时内进行。在电流钳快速模式下获得的电压记录，在 10 千赫兹（四极贝塞尔）下进行低通滤波，由 A/D 转换器以 25 或 50 千赫兹进行数字化，并使用在 Windows XP 上运行的软件进行采集。双极刺激电极购自 MicroProbes for Life Science（PI2ST30.1H10）。刺激电流最大为 240 微安（阈值通常小于 100 微安）。连接电位已得到补偿。对于电流钳记录，串联电阻已得到完全补偿。在电压钳或电流钳模式下补偿杂散电容。在电流钳模式下补偿杂散电容会产生更短暂且更大的动作电位，但并未从本质上改变所报告的研究结果。
03. 钠通道免疫标记
对于免疫标记，按照参考文献 22 中所述对大鼠幼崽进行心脏灌注。钠通道标记按照参考文献 52 中所报道的方法进行。使用共聚焦显微镜采集图像，并且在对 MNTB 成像之前，针对钠通道标记，对存在于同一冠状切片中的浦肯野细胞优化采集设置，这些浦肯野细胞作为 Nav1.6 标记的阳性对照（52, 53）。一般来说，MNTB 中的标记比浦肯野细胞中的标记更强。使用软件进行三维渲染。图 4 中显示的图像在图像处理软件中进行了对比度调整。其他共聚焦图像在 ImageJ 1.51j 中进行了对比度调整。在 ImageJ 中添加了伪彩色。
本研究中使用了以下抗体：钠通道 1.6（ASC – 009；1:1,000 或 1:500；兔源）、囊泡谷氨酸转运体 1 和 2（ab5905 和 ab2251；1:2,000；豚鼠源，豚鼠源）、锚蛋白 G（克隆 N106/36；1:1,000；小鼠源）。使用了高度交叉吸收的二抗：荧光染料，所有二抗的稀释比例均为 1:200。省略一抗的对照实验，或者与对照肽抗原（100 微克每毫升）预孵育 1 小时的对照实验，将 Nav1.6 的标记降低到了背景水平。抗 Nav1.6 抗体的特异性已在小鼠中得到验证（54）。
04. 动作电位衰减模型
动作电位衰减由一个模型来描述，该模型既包括膜电位的稳态效应，也包括其对恢复速度的影响。衰减量由衰减系数 D 的实际值决定，D 的范围是从 0 到 1。D 的值决定了第 i 个动作电位（Yi）相对于最大动作电位上升速率（Ymax）的大小：
在每个 AP 处，D 都会减少分数 d：
耗竭因子d可以理解为未被AP失活的钠通道比例。抑郁症的恢复需要经过一段延迟才能开始，因为AP必须先复极化。该延迟设定为每次记录中平均AP半宽的1.5倍。在此延迟之后，恢复情况如下：
D 放松至稳态抑制 DV，时间常数为 τV。假设 APi 和 APi+1 之间的膜电位恒定为 APi+1 的起始电位，对方程 S3 进行积分，可得出 AP 之间 D 的指数恢复：
其中 t0 是 AP 后开始恢复的时间点。DV 和 τV 均呈电压依赖性。电压依赖性效应基于膜电位对钠通道电导的影响，因为钠通道从失活状态恢复的时间常数依赖于电压（33），并且其稳态失活也依赖于膜电位。我们通过一组独立的实验测量了每个花萼的 Dv。在这些实验中，我们注入电流以偏置花萼的起始电位，并在 500 毫秒后刺激传入轴突以引发 AP。然后，可以使用以下方程分析 AP 上升率与起始电位的关系（类似于图 S5B 所示）：
其中 DV 由简单的逆玻尔兹曼方程描述：
包含两个自由参数：V0.5（半抑制电位）和 k（斜率因子）。需要注意的是，就我们的目的而言，多项式模型就足够了，因为我们只想准确估计 Vstart 如何转化为 Ymax。然而，玻尔兹曼方程预计与电压门控通道的失活曲线在生物学上一致。
τV 的电压依赖性基于对肾盏钠通道的电压钳研究（33）。在研究的电压范围内，文献 [33] 中 τV 与膜电位之间的关系几乎呈线性（r = 1.0）。通过线性回归，我们量化了该关系，并将其乘以温度校正因子，该因子也是从文献 [33] 中获得的：
为了校正液体接界电位，我们在记录的膜电位基础上加上了 10 毫伏。需要注意的是，基于相关电导模型，我们预期 τV 和 Vm 之间的关系应遵循钟形曲线，因此公式中的线性外推可能会低估 τV。
拟合函数会根据测量得到的起始电位和间隔，迭代计算衰减系数 D 的变化。D 的初始值设为 1。对于后续的每个动作电位，使用相应公式计算 D 的变化。通过使用特定公式以及两个自由参数 Ymax 和 d，借助软件中实现的“一次性拟合”方法，对测量得到的动作电位上升速率进行拟合；这种方法能够利用整个数据集而非单个 X-Y 对来评估迭代函数与数据的匹配程度。该模型纳入了后电位的两种效应：（i）后电位设定 τV，（ii）后电位决定 DV。通过使用该模型的更简单变体，我们可以评估后电位的这两种效应是如何对观察到的衰减产生影响的。为了分析衰减恢复的单独作用，我们在相应公式中将 Dv 固定为 1，从而排除稳态效应。通过排除衰减恢复，将相关公式简化，以此来探讨稳态衰减的作用。
二、讨论
在这里，我们报告了对 Held 氏壶腹进行的体内全细胞和近细胞记录，Held 氏壶腹这一终末便于进行脑片记录，使其成为研究神经递质释放生物物理学的热门对象。在发育中的啮齿动物中，Held 氏壶腹以大于 200 赫兹的频率爆发式放电，没有失败的迹象，动作电位几乎没有衰减或展宽，并且能从动作电位衰减中快速恢复。我们将稳定电位 Vstab 定义为动作电位后的膜电位，在该电位下下一个动作电位的形状不会改变，并且发现它接近静息膜电位（RMP）。此外，动作电位后的膜电位（Vafter）接近 Vstab，这意味着在高频放电期间，当 Vafter 决定下一个动作电位的起始电位时，动作电位的稳定性达到了最大化。免疫标记表明，钠通道 Nav1.6 已经存在于新形成的 Held 氏壶腹中，为在脑片和体内观察到的动作电位无衰减现象提供了分子基础。因此，这些结果揭示了 Held 氏壶腹在自然放电过程中快速信号传递的重要机制。
01. 自然活动中限制动作电位衰减的机制
我们观察到，在体内放电过程中，Held 氏壶腹动作电位的形状非常稳定。尽管在 Held 氏壶腹形成的早期阶段就已经观察到了 200 赫兹的瞬时放电频率，但动作电位几乎没有衰减。对于动作电位形状不变的情况，有两个因素似乎至关重要：动作电位衰减的快速恢复以及动作电位之间的膜电位，它使波形变化最小化。
在脑片记录中得到的动作电位衰减在很大程度上与动作电位之间的间隔无关。只有在 2 至 4 毫秒的间隔时，才观察到恢复过程中存在时间依赖的成分。稳态衰减与时间依赖的恢复相结合，能够充分描述观察到的动作电位衰减，这表明 Held 氏壶腹钠通道从失活状态的快速恢复为动作电位衰减的恢复提供了合理的解释。免疫标记证据表明 Nav1.6 早期就已存在，Nav1.6 以其快速的动力学特性以及在高频放电期间对失活的抗性而闻名；Nav1.6 的存在与在发育后期对 Held 氏壶腹的研究结果一致。没有发现存在半结的证据，半结直到出生后较晚阶段才形成，大概是由髓鞘形成所触发的。胶质细胞覆盖的增加以及杯状结构被 Held 氏壶腹指状结构所取代，使得无法在体内研究成熟 Held 氏壶腹的特性。成熟的 Held 氏壶腹在听力开始后具有更短暂的动作电位，Held 氏壶腹中钠通道的排除可能对此有一定作用。
体内对动作电位衰减具有抗性的第二个促成因素是 Vafter 接近 Vstab，即动作电位形状保持不变的电位。体内的静息膜电位（RMP）也接近 Vafter ，与之前脑片研究报告的范围相同，尽管在大多数情况下，报告的 RMP 更负且去极化后电位（DAP）更大。假设较大的 DAP 是由于更负的 RMP 导致的，温度差异可能解释了与许多早期脑片实验的差异，因为在生理温度下 Held 氏壶腹的 RMP 往往更去极化，而许多早期脑片实验是在室温下进行的。由于 Held 氏壶腹的 RMP 是由钾通道亚基、Ih、Na+/K+-ATP 酶以及持续性钠通道设定的，这几种电导（或驱动力）中任何一种的细微差异，都可能导致与之前一些脑片研究中观察到的 RMP 存在微小差异。除了对 Vafter 几乎没有影响的钾通道亚基之外，这些电导也可能有助于设定 Vafter，其中某些钾通道和再生钠通道还起到了额外的重要作用。
再生钠电流不仅对 Held 氏壶腹的后电位有重要贡献，它们还促进了更快的动作电位和更高频率的信号传递。很可能，再生钠电流反映了孔道阻塞颗粒从辅助通道亚基上的解离，该颗粒在相关钠通道开放时可迅速阻塞它。阻塞颗粒使得动作电位短暂，并限制了钠通道的失活。在非常短的间隔时，钾通道的易化也可能有助于使动作电位保持短暂。轴突钠通道的快速关闭有望提高动作电位的能量效率。由于该颗粒在负电位下解离而导致钠通道的短暂开放，一直被视为一种副产物，但我们认为再生电流有助于使 Vafter 接近 Vstab，从而维持动作电位的稳定发放。总之，这些适应性变化使得即使在高频放电时，动作电位也能保持非常稳定。
02. 功能意义
一般来说，后电位在高频信号传递过程中控制着电压依赖性离子通道的可用性，并设定下一个动作电位的起始电位。人们已经提出了后电位在终末中的一些更具体的功能。在某些神经结构中，去极化后电位（DAP）可能是动作电位后兴奋性增加的原因，但较大的 DAP 可能导致钠通道失活和动作电位失败。突触前动作电位幅度的降低可能导致短期抑制，尽管这些变化可能会被动作电位的展宽所抵消。通过控制钙离子通道的失活，后电位可能直接控制神经递质的释放，但最近对 Held 氏壶腹的一项研究发现，总的钙离子内流在很大程度上与后电位的值无关。在某些神经终末，DAP 可能导致特定钾通道的累积失活，从而导致动作电位展宽，进而在高频爆发期间对强烈的突触易化起到促进作用。这种突触的传递特性与 Held 氏壶腹突触或其他一些突触的中继功能有很大不同，这种差异可能部分是由于 Vafter 比 Vstab 更去极化所导致的。对于某些突触小体，其几何形状造成的阻抗不匹配使得轴突容易出现频率依赖性的传播失败。使用电压指示剂或许可以测试这里所确定的机制是否也有助于稳定突触小体中的动作电位速度并确保动作电位的传播。
我们提出，与在其他生物神经肌肉接头中获得的数据一致，后电位的一个重要功能是保持突触前动作电位的形状。静息膜电位（RMP）、Vstab 和 Vafter 的紧密对应关系，不仅使得动作电位的起始电位显著独立于放电频率，而且还导致动作电位的形状非常稳定。对于像 Held 氏壶腹这样的中继突触，它在很宽的放电频率范围内都具有精确可靠的优势，这具有明显的优势。由于钠通道可用性的变化而导致的动作电位形状的改变，不仅会影响钙离子通道的开放、钙离子内流的时间和幅度以及神经递质的释放，还会影响轴突的传播速度，从而导致时间精度的丧失。我们得出结论，我们对 Held 氏壶腹的体内记录为理解保持动作电位稳定的机制提供了见解。未来的实验可能会阐明 Vafter 和 Vstab 之间的关系是如何被控制的，以及它们之间的关系在 Held 氏壶腹和其他突触前终末中是否可以动态调整。
三、材料与方法
所有实验均符合相关指导方针，并得到了相关动物伦理委员会的批准。简而言之，购买了定时怀孕的大鼠母鼠，并将它们饲养在动物设施内。出生当天被记为 P0。新生幼崽用异氟烷麻醉，插管并进行机械通气，然后通过腹侧入路暴露右侧腹侧脑干。在记录之前，将麻醉剂异氟烷的浓度降低到 1%，这使动物处于无反射状态。进行体内电穿孔。体内电生理学方法有详细说明。基于特定物质的 pipette 内溶液的连接电位已得到校正。通过轻柔抽吸，然后在特定模式下补偿 pipette 电容，形成千兆封接。进行短暂抽吸以建立全细胞配置，并在破膜后立即测量静息膜电位（RMP）。在电流钳快速模式下进行电压记录。记录进行了低通滤波并以一定频率进行数字化。测量了串联电阻，但电阻上的电压降是离线校正的。
制作急性脑干脑片。电阻得到了完全补偿。在特定模式下补偿电容。记录进行了低通滤波并以一定频率进行数字化。在特定环境中进行了自定义编写的分析。对于衰减模型，我们只纳入了总方差解释率大于 70% 的记录。
生物胞素荧光标记程序已有描述。对于钠通道 1.6 的免疫标记，脑干切片进行抗原修复；随后按照详细描述的方法，使用特定缓冲溶液进行相同的免疫标记程序。更多细节可在补充信息材料与方法中找到。 为了校正液体接界电位，我们在记录的膜电位基础上加上了 10 毫伏。需要注意的是，基于霍奇金 – 赫胥黎电导模型，我们预期 τV 和 Vm 之间的关系应遵循钟形曲线，因此线性外推可能会低估 τV。
拟合函数会根据测量得到的起始电位和间隔，迭代计算衰减系数 D 的变化。D 的初始值设为 1。对于后续的每个动作电位，会计算 D 的变化。通过相关公式以及两个自由参数，借助相应方法对测量得到的动作电位上升速率进行拟合，这种方法能够利用整个数据集来评估迭代函数与数据的匹配程度。该模型纳入了后电位的两种效应：一是后电位设定 τV，二是后电位决定 DV。通过使用更简单的模型变体，我们可以评估后电位的这两种效应是如何对观察到的衰减产生影响的。为了分析衰减恢复的单独作用，我们排除稳态效应。通过排除衰减恢复来探讨稳态衰减的作用。
公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810
