将光合生物机械重新连接到电极是可持续生物发电和燃料生产的前瞻性半人工途径。目前，尚不清楚如何设计电极和生物材料界面以满足高生物光电化学性能的复杂要求。在这里，我们开发了一种使用氧化铟锡纳米粒子生成分层电极结构的气溶胶喷射打印方法。我们打印了高度和亚微米表面特征不同的微柱阵列电极库，并研究了跨生物电极界面的能量/电子转移过程。当连接到蓝藻集胞藻 sp。PCC 6803 ，具有微分支的微柱阵列电极表现出良好的生物催化剂负载、光利用率和电子通量输出，最终使相同高度的最先进多孔结构的光电流几乎翻了一番。当微柱的高度增加到 600µm 时，里程碑介导的光电流密度可以达到 245µAcm-2（迄今为止最接近理论预测）和高达29%的外部量子效率。这项研究展示了如何在未来更有效地利用光合作用产生的生物能，并为三维电极设计提供新工具。
生物催化剂（从酶到活微生物）可以电化学连接（有线）到电极，用于生物技术应用或基础研究。特别是，蓝藻（光合细菌）是自由生活、自我修复、丰富的太阳能生物催化剂，可以连接到电极用于发电（生物光伏；图1a、b）和化学合成。
目前，太阳能转换的半人工方法还处于初级阶段，蓝藻电极可实现的光电流密度已被计算为 340 µA cm-2和2400 µA cm-2 （根据较低的估计，与工业生物燃料生产相比，能源转换效率更高）。然而，蓝藻电极产生的典型光电流比该值低两个数量级。尽管进行了大量生物工程努力以增加生物电子输出，并部署了人工电子介体，可引入人工电子介体以最大限度地从光合电子传递链收集电子（图1b ）。电流输出的瓶颈可能在于电极本身。
在光电化学反应中，电极结构必须平衡几个因素，以尽量减少反应瓶颈。在使用生物催化剂的情况下，它必须补偿较大的催化剂尺寸和较低的总负载。蛋白质膜和生物膜光电化学中最先进的电极结构是反蛋白石( IO )多孔结构，它由各种金属氧化物制成。特别是，氧化铟锡( ITO )表现出适当的惰性、导电性、光散射和生物相容性。结果表明，大孔结构（提供大的电活性表面积并有助于生物催化剂渗透）与中观亚结构（有助于生物催化剂粘附）在分层结构中的组合对于有效的生物催化剂布线很重要。当模型蓝藻，集胞藻属的细胞。将PCC6803（聚x胞藻）固定在 IO-ITO 电极上,观察到 14 µA cm-2 的介导光电流密度（图1c）和2.7%的外部量子效率（ EQE ）。尚不确定光电流的瓶颈在哪里（补充说明1）。由于缺乏可以生成大量分层电极结构库的通用制造技术，电极设计的进一步进展受到限制。
在这里，我们开发了一种气溶胶喷射打印方法，用于高效且可重复地制造由 ITO 纳米颗粒制成的大型微柱电极库。我们证明了这种打印方法可以在一个打印步骤中产生跨越五个数量级长度尺度的可调分层特征。这使我们能够使用 ITO 纳米颗粒（图1d-f ）制造分层微柱阵列电极库（补充说明1 ），而使用其他制造方法是不可能的。我们改变了柱子的高度和表面粗糙度，以在多个长度尺度上调整电活性表面积，并将它们的特性与最先进的 IO-ITO 电极进行比较。使用这种方法，我们扩展了当前对电极结构-活性关系的理解，并获得了新一代高性能光合电极（ 图1c ）。
气溶胶喷射打印 ITO 电极
气溶胶喷射打印是一种增材制造技术，可通过非接触直接写入方法打印具有高设计灵活性、分辨率和材料沉积精度的金属纳米颗粒墨水（图2a）。然而，使用这种技术制造三维（ 3D ）层次结构的报道还没有。建立气溶胶喷射打印方法对于使用 ITO 纳米颗粒墨水制造 3D 结构，与典型墨水成分和打印参数有相当大的偏差（图2 ：有关气溶胶喷射打印的教程说明，请参见补充注释2）。
图1.生物光电化学的下一代电极。a、利用光合生物膜作为光催化剂进行生物太阳能发电的生物光电化学电池示意图。光合水氧化产生的电子通量在阳极收集并转移到阴极，阴极将氧气还原为 H2O 。插图：带有由ITO纳米颗粒打印的蓝藻吸附电极的微柱的彩色SEM图像。比例尺，10µm . b、蓝藻-阳极界面示意图。光由光系统II（ PSII ）收集，用于氧化水，从而释放电子、O2和H+。电子通过光合电子传输链转移到光系统 I（ PSI ），光系统I将吸收的光能泵入电子。这些电子可以用于细胞内的一系列还原途径，包括用于二氧化碳固定的卡尔文-本森循环。光合作用产生的一些电子会进行细胞外电子传递，这可以通过外源电子介质（如 DCBQ ）来增强，使电子往返于电极。c、选择关键蓝藻电极的光电流输出，对应不同世代的电极设计。d、本研究中介绍了气溶胶喷射打印微柱ITO电极库。e、打印微柱阵列电极的 SEM 图像（俯视图）。f、不同高度的打印微柱阵列电极（直径 20µm ，间距 100µm ）的 SEM 图像（侧视图）。
为了产生柱状结构，调整了一个新参数，即气体聚焦压力比，即载气和鞘层气体压力之间的平衡（ 图2b ）。据观察，在 2.4 和 3.5 之间的比率下，可以打印高达 800μm 的柱。低于此范围，将沉积不足的材料；在该范围以上，发生了“过度倾斜”效应，导致柱底较厚且不稳定（ 图2b ，插图）。
我们通过改变油墨前体中的水（非挥发性）和甲醇（ MeOH ，挥发性）等非经典共溶剂系统，赋予打印柱微尺度粗糙度。改变水与甲醇的比例，以产生不同液滴大小和挥发性的气溶胶流（补充表1）：高含水量（ >50% v/v ）产生“液滴状”特征（补充图 1a ）；50–65% v/v 的甲醇含量产生了“光滑”的纳米多孔柱（图2d 和补充图1b ）；65–75% v/v 的甲醇含量产生亚μm大小的分支特征（ 图2e ）；当甲醇含量 >75% v/v 时，柱体的直径变薄变脆（补充图 1c ）。在柱状物打印过程中形成的微支链归因于在较高甲醇含量下形成较小的气溶胶液滴。鞘层气体界面附近的小液滴太小，无法抵抗沉积区一侧的湍流，并在湍流前沿进一步破碎。形成的亚 μm 液滴遵循宽轨迹模式，形成分支特征，共溶剂混合物的挥发性有助于结构的快速凝固。
我们确定了生成 ITO 纳米颗粒( sp-ito ; 图2d )和支链的 ITO 纳米颗粒( bp-ito ， 图2e )的光滑微柱阵列的理想条件，在本研究中，打印了在柱高度( 50-800μm )和粗糙度方面变化的电极(图1d和补充图2)。用于打印微柱电极的条件(直径20μm，高度 50-800μm ，中心到中心的间距 100μm )记录在补充表2 中。
图2 .微柱阵列电极的气溶胶喷射打印。a ，打印过程示意图。将甲醇/水墨水前体中的 ITO 纳米颗粒置于超声波雾化器中，在其中雾化、夹带在 N2 载气流中，并通过同轴 N2 鞘气流进行空气动力学聚焦。将微柱 ITO 结构打印到 FTO 涂层玻璃上。 b，生产微柱的打印参数。气体聚焦压力比被确定为调整柱形的关键控制参数。插图：带有底座的代表性打印柱的 SEM 图像。c，产生亚 μm 粗糙度的打印参数。确定了气体聚焦压力比和油墨 MeOH 含量之间的最佳操作窗口，以形成微滴分支。 d，具有代表性的光滑微柱 ITO(SP-ITO )电极的SEM图像，高度为600µm，直径为20µm。在更高放大倍率下获得的图像显示了由纳米颗粒堆积产生的纳米特征。SP-ITO 是使用 2.5 的聚焦压力比和 60% 的 MeOH 体积分数制造的。 e，具有代表性的分支微柱 ITO（BP-ITO） 电极的SEM图像，高度为 600µm ，直径为 20µm 。在更高放大倍率下获得的图像显示包含亚 μm 液滴的微分支特征。液滴特征的进一步放大显示纳米颗粒的纳米特征。 BP-ITO 是使用 2.5 的气体聚焦压力比和 70% 的 MeOH 体积分数制造的。误差线代表平均值的标准误差 (n=3)。
打印微柱电极的表征
对打印的微柱电极进行退火，并通过能量色散X射线光谱（ EDX ；补充图3 ）确认保留了 ITO 成分。退火的 SP-ITO 和 BP-ITO 结构库的扫描电子显微镜(SEM)图像显示，每个阵列内的打印柱在高度和直径上是均匀的。我们观察到分支随着 BP-ITO 结构的高度而减少，在高度 >400 μm 的柱子上半部分的分支减少（补充图2 ）。这归因于打印过程中湍流的减少，因为打印机喷嘴和支柱尖端之间的距离减小。
借助积分球(补充图4-6 )测量打印微柱裸电极(在空气中)的光学特性，并与基准第三代 IO-ITO 电极(孔径为 10µm ，高度为 50µm 进行比较；补充图7)，如图 3a-d 所示。我们观察到，当用 0° 垂直入射白光( 1 mw cm−2) 照射时，裸露的 IO-ITO 结构透射 4.4 ± 2.0% ，反射 12.4 ± 1.6% 的入射光；相同高度的 SP-ITO 阵列结构透射 32.5 ± 0.7% ，反射 15.6 ± 1. 入射光的 0% ，而 BP-ITO 阵列结构透射 26.4 ± 2.1% 并反射入射光的 20.2 ± 2.2% (图3c )。因此，微柱结构的透光性显著增强（ P≤1.6×10−3 ）与 IO-ITO 相比， BP-ITO 也表现出增强的散射（ P=3.2×10−2).从这一点可以预测，在微柱微支化结构中，负载聚囊藻的电极可以收集更多的光。入射光的剩余部分可归因于材料的光吸收或材料的损耗面内散射。IO-ITO 结构（ 83.2±2.6% ）比 SP-ITO（51.9±0.3% ）和 BP-ITO结构 （ 53.3±3.8% ， P≤2.5×10−3）补充图8 ）。
图3. 打印的微柱电极表现出高透光率和细胞负载。a，裸电极与光相互作用的示意图。b，固定化细胞与光相互作用的电极示意图。c，裸电极在空气中的透光率和反射率研究。d，与细胞一起培养的电极的透光率和反射率研究。使用0°垂直入射白光( 1mWcm-2 )进行透光率和反射率研究。IO-ITO 电极高度为 50µm ， SP-ITO 和 BP-ITO 电极高度范围为 50µm 至 800µm 。将集胞藻细胞的浓缩悬浮液（ BG11 培养基中的 150nmol ( Chla ) ml-1 ）与电极一起孵育 12 小时，在测量前用新鲜培养基轻轻清洗电极。e，通过电容测量确定的扁平、 IO-ITO 、 SP-ITO 和 BP-ITO 电极的 EASA 。插图：高度为 50µm 的扁平、 IO-ITO 、 SP-ITO 和 BP-ITO 电极的 EASA 的放大比较。f，在与集胞藻孵育 12 小时后，电极上的 EASA 标准化叶绿素a负载和温和的培养基洗涤。g，代表性的共聚焦显微镜图像显示通过集胞藻负载电极中间的横截面。比例尺， 20µm 。h ，集胞藻负载电极的代表性彩色SEM图像（顶视图）。误差线代表平均值的标准误差( n=3 )。
还表征了高度范围为 50 µm 至 800µm 的 SP-ITO 和 BP-ITO 电极(这种高度对于 IO-ITO 是不可接近的)。裸露的 SP-ITO 和 BP-ITO 电极的透射率随高度的增加而线性下降，这部分是由于柱基厚度的相应增加。SP-ITO 的总透射率高于 BP-ITO ，因为微分支阻挡了大约8%的入射光；同样，由于 ITO 分支的散射， BP-31 的反射率增加。反射率与裸眼的高度成正比支柱结构（图3c ）。
图4. 聚囊藻负载电极的光电化学性能。a、从一个在存在和不存在外源性电子穿梭 DCBQ （ 1mM ）的情况下，聚囊藻负载 BP-ITO 电极 嗯）。b、调解与和解概述等厚不同电极结构的聚囊藻负载电极的非介导光电化学性能（50 μm）在红灯下（ 680 nm， 1 mMcm−2. )c、载聚囊藻 SP-ITO 的非介导光电化学性能总结和 BP-ITO 电极具有不同的柱高度，在红光下没有外源电子穿梭（ 680 nm ， 1 mMcm−2. ) d、优化的负载集胞藻的BP-ITO电极（柱高600µm）在不同强度的白光条件下的光电化学性能。在 DCBQ 不存在和存在的情况下，以及在 BG11 ( pH8.5 )中，在 25°C 下，分别在不存在和存在 DCBQ 的情况下以及在 BG11 ( pH8.5 )中，对 SHE 施加 0.3V 和 0.5V 的施加电位进行计时电流法实验。误差线代表平均值的标准误差( n=3 )。
图5. 构效关系分析。a、 IO-ITO ， SP-ITO 和 BP-ITO 电极结构(高度为 50µm )之间的雷达图比较。JDCBQ ， DCBQ 介导的光电流密度; MCell loading ，细胞载量由 Chl a 含量推断。b、微柱电极的 Spearman 秩相关矩阵及其性质比例尺表示相关系数( R )的强度和符号，蓝色表示正相关系数，红色表示负相关系数。星号表示显著性，其中 ∗P≤ 0.1 ; ∗∗P≤ 0.05 和 ∗∗∗P≤0.01 。
结论
我们建立了一种稳健的 3D 打印方法，用于使用纳米粒子生成具有多尺度分层特征的微柱阵列结构；这种方法的强大之处在于可以调整多长度尺度的特征。这种方法可以应用于电极结构考虑对性能很重要的领域。我们的制造方法能够在大型电极库上进行比较研究，以确定目前限制生物光电极的瓶颈。我们证明，尽管大孔电极为高生物催化剂负载量提供了大的 EASA ，但光和电解质的渗透通过该结构受到限制。微柱电极设计克服了这个问题，在表面增加亚微米粗糙度提高了EASA、电池负载和光收集。应用本研究的经验教训，光电化学领域的未来电极设计应优先考虑光通量，然后再引入高度结构化的架构以提高电子通量容量。这里展示的光电流输出（介导电子转移高达 245 µA cm-2 ，直接电子转移高达 1.93 µA cm-2 ）是生物光电化学的里程碑。它们使我们更接近活光合细胞在生物能源产生中具有竞争力所需的光电流一个数量级。例如，当这种生物阳极与合适的阴极配对以产生典型的电压差( 0.213 V )时，可以估计出 541 mW m-2 的功率密度；这已经与生物燃料发电( <403 mW m−2) 相媲美。这项研究的经验教训将指导未来高性能生物电极结构的发展；然而，电子介导策略的进步（取代具有细胞毒性且不稳定的 DCBQ ）对于长期高性能非常重要。这项研究展示了3D打印在3D电极设计中的强大功能，并为理解和增强生物电极界面开辟了新的方向。
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